Nghiên cứu quy trình tổng hợp dạng muối natri của 2 (curcumin o yl)ethyl dihydrophosphat

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - VŨ YẾN NHƯ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP DẠNG MUỐI NATRI CỦA 2-(CURCUMIN-O-YL)ETHYL DIHYDROPHOSPHAT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - VŨ YẾN NHƯ MÃ SINH VIÊN: 1301310 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP DẠNG MUỐI NATRI CỦA 2-(CURCUMIN-O-YL)ETHYL DIHYDROPHOSPHAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải ThS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải ThS Phạm Thị Hiền, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm u u tạ i điều iện gi p đ suốt quãng thời gian tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện ThS Nguyễn Văn Giang nhiệt t nh gi p đ , động viên khích lệ tạ điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp n Tơi xin chân thành cô gi ơn Ban Giám hiệu Nh trường toàn thể thầy Trường Đại h c Dược Hà Nội tạ điều kiện tốt cho tơi suốt q trình h c tập trường Trong q trình thực khóa luận tơi nhận gi p đ cán thuộc Phòng phân tích, Kiểm nghiệ Tương đương sinh h c, cán Phòng NMR Viện Hóa h c cán Phòng Thử nghiệ h c, Viện H n lâ Kh a h c sinh h c, Viện Công nghệ sinh Công nghệ Việt Na , c c c n ộ Viện Công nghệ Dược phẩ Quốc gia, c c c n ộ h a Hóa – trường Đại h c Kh a h c tự nhiên, Đại h c Quốc gia H Nội; c c c n ộ Viện Thực phẩ chức xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, xin gửi lời ơn đến gia đ nh, chị Nguyễn Thị Trâm (H c viên CH21), anh Nguyễn Chính Khoa, anh Nguyễn Văn Phương người bạn Vũ Thị Giang, Vũ Mạnh Tiến, Trương Thị Thả ,… gi p đ , chia sẻ, động viên, khích lệ tơi sống h c tập! Do thời gian làm thực nghiệ iến thức thân hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn è để khóa luận hồn thiện Xin chân thành ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2018 Sinh viên Vũ Yến Như MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan curcumin 1.1.1 Cấu trúc phân tử tính chất lý - hóa curcumin 1.1.2 Độ ổn định 1.1.3 Tác dụng sinh học curcumin 1.2 Các phương pháp lý hóa cải thiện độ tan sinh khả dụng curcumin 1.3 Tiền thuốc phosphat phương pháp tổng hợp 1.3.1 Tiền thuốc phosphat 1.3.2 Phương pháp tổng hợp nhóm ester phosphat số tiền thuốc 10 1.4 Một số nghiên cứu dạng ester phosphat curcumin 13 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu – Hóa chất 15 2.2 Dụng cụ – Thiết bị 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tổng hợp hóa học 17 2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 17 2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 18 2.4.4 Thử hoạt tính sinh học 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22 3.1 Xây dựng quy trình tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (C-1) 22 3.1.1 Tổng hợp C-1 theo tài liệu tham khảo 22 3.1.2 Khảo sát phương pháp tinh chế 23 3.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 25 3.1.4 Quy trình tổng hợp 27 3.1.5 Xác định cấu trúc C-1 29 3.2 Xây dựng quy trình tổng hợp muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat 31 3.2.1 Khảo sát pH đến khả tạo muối 33 3.2.2 Khảo sát tác nhân tạo muối 33 3.2.3 Quy trình tổng hợp 34 3.2.4 Xác định cấu trúc C-3 35 3.3 Thử hoạt tính sinh học 38 3.3.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH 38 3.3.2 Thử hoạt tính ức chế sinh NO 38 3.4 Bàn luận 39 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 39 3.4.2 Về xác định cấu trúc 42 3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) H-NMR H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) AR Analytical reagent (Tinh khiết phân tích) CTCT Cơng thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử C-1 mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin C-2 2-(Curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat C-3 Muối dinatri 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat C-4 Muối mononatri 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Môi trường nuôi cấy Dulbecco) DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon FBS Fetal bovine serum (Huyết bào thai bò) g Gam h Giờ Hela Human cervix carcinoma (Ung thư tử cung người) HepG2 Human hepatocellular carcinoma (Ung thư gan người) HIV Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch người) HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IC50 Inhibition concentration at 50% (Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử) IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) K562 Human leukemia (Ung thư bạch cầu cấp người) L-NMMA NG-Methyl-L-arginin acetat logP Hệ số phân bố dầu nước LPS Lipopolysaccharid MCF7 Human breast carcinoma (Ung thư vú người) MS Mass spectrometry (Phổ khối lượng) MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide OD Optical density (Mật độ quang học) Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ) SA Scavenging activities (Khả trung hòa gốc oxy hóa tự do) SC50 Scavenging concentration at 50% (Nồng độ trung hòa 50% gốc tự do) SKLM Sắc ký lớp mỏng δ Độ chuyển dịch hóa học RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 T°nc Nhiệt độ nóng chảy SOD Superoxide dismutase (Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dẫn chất tổng hợp biến đổi chuỗi bên aryl Bảng 1.2 Độ tan số tiền thuốc phosphat dạng muối natri calci Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 15 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ - thiết bị 16 Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin .25 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng .26 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi phản ứng 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng xúc tác KI 26 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2-bromoethanol 27 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) C-1 29 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm 29 ảng 3.8 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, CD3OD) C-1 30 ảng 3.9 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) C-1 31 Bảng 3.10 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến khả tạo muối 33 Bảng 3.11 Kết khảo sát tác nhân tạo muối pH 8-9 33 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) C-3 .35 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ hồng ngoại C-3 .36 ảng 3.14 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO) C-3 36 ảng 3.15 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO) C-3 37 Bảng 3.16 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH 38 Bảng 3.17 Kết khả ức chế sản sinh NO lên dòng tế bào RAW 264.7 38 Bảng 3.18 Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 .38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo curcumin .3 Hình 1.2 Các dạng tồn curcumin ảnh hưởng pH Hình 1.3 Hướng biến đổi cấu trúc curcumin tạo dẫn chất Hình 1.4 Phản ứng tạo prednisolon phosphat, dexamethason phosphat 11 Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp muối calci foramprenavir 11 Hình 1.6 Giai đoạn cuối quy trình tổng hợp tedizolid phosphat 12 Hình 1.7 Giai đoạn cuối quy trình tổng hợp tedizolid phosphat 12 Hình 1.8 Phản ứng tạo prednisolon 21-sodium phosphat 12 Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp muối dinatri fospropofol 13 Hình 1.10 Cấu tạo curcumin-O-yl dihydrophosphat 13 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat 17 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp C-1 từ curcumin 22 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp C-1 quy mơ g/mẻ 28 Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp C-3, C-4 .32 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp C-3 35 Hình 3.5 Cơ chế phản ứng O-alkyl hóa 39 Hình 3.6 Cơng thức tạp phản ứng tạo C-1 .39 Hình 3.7 Cơ chế phản ứng phosphat hóa phosphoryl oxyclorid 41 Hình 3.8 Dạng hỗ biến enol - ceton 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Người Việt Nam nói riêng người châu Á nói chung khơng xa lạ với nghệ hay nghệ vàng Nhắc đến nghệ nhắc đến gia vị quen thuộc, vị thuốc thiên nhiên hữu ích Từ lâu trước đó, người ta biết sử dụng nghệ làm chất tạo màu, tạo hương vị riêng biệt Hơn tận ngày việc dùng nghệ để chữa liền sẹo hay chữa bệnh liên quan đến dày nhiều người áp dụng Với phát triển tiến khoa học, nhiều nghiên cứu cơng bố hoạt tính sinh học dược học củ nghệ thành phần chiết xuất từ củ nghệ, curcuminoid (chủ yếu curcumin – chiếm ~ 77%) nhóm hoạt chất tạo nên tác dụng sinh học quan trọng củ nghệ [12] Curcumin chứng minh có nhiều tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo [1], [9] Cơ sở thuyết phục để tiếp tục sử dụng curcumin điều trị tính an tồn gần tuyết đối Hiện nay, nghiên cứu động vật người ra, curcumin không độc kể sử dụng với liều cao g/kg thể trọng [10] Tuy có nhiều tác dụng việc ứng dụng curcumin lâm sàng lại gặp khó khăn độ tan curcumin nước pH acid sinh lý thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng sử dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng curcumin thấp [12] Nhiều cơng trình nghiên cứu giới đề cập đến số biện pháp cải thiện sinh khả dụng curcumin phương pháp vật lý (tạo nano, liposom, hệ phân tán rắn…) phương pháp hóa học (biến đổi nhóm -OH phenol, β-diceton, khung anken…) Gần đây, nhóm nghiên cứu môn Công nghiệp Dược tổng hợp thử tác dụng chống viêm, chống oxy hóa dẫn chất mono alkyl hóa curcumin (mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin) cho kết khả quan để tiếp tục phát triển hợp chất Tạo tiền thuốc cách tiếp cận thú vị nghiên cứu phát triển thuốc phân tử có hoạt tính sinh học theo hướng cải thiện độ tan, sinh khả dụng, độ ổn định Trong số tiền thuốc ứng dụng lâm sàng, đáng ý nhóm tiền thuốc phosphat với ưu điểm: tương đối bền mơi trường chuyển hóa pKa thấp, cải thiện đáng kể độ tan thuốc gốc (thuốc mẹ) [30] Một số ví dụ kể đến fosphenytoin (chống động kinh), fosamprenavir (trị virus), fosprofol (an thần gây ngủ) Hầu hết tiền thuốc dạng muối natri ester phosphat Phụ lục 13 Phổ IR C-3 Phụ lục 14 Phổ 1H-NMR C-3 Phụ lục 15 Phổ 1H-MNR giãn C-3 zPhụ lục 16 Phổ 1H-NMR giãn tiếp C-3 Phụ lục 17 Phổ 13C-NMR C-3 Phụ lục 18 Phổ 13C-NMR giãn C-3 Phụ lục 19 Phổ 13C-NMR giãn tiếp C-3 ... C-1 mono -O- (2- Hydroxyethyl)-curcumin C -2 2 -(Curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat C-3 Muối dinatri 2- (curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat C-4 Muối mononatri 2- (curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat. .. 2- (curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat với ba mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp mono -O- (2- hydroxyethyl)-curcumin từ curcumin Xây dựng quy trình tổng hợp muối natri 2- (curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat. .. curcumin -O- yl dihydrophosphat 13 Hình 2. 1 Sơ đồ tổng hợp muối natri 2- (curcumin- O- yl)ethyl dihydrophosphat 17 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp C-1 từ curcumin 22 Hình 3 .2 Sơ đồ quy trình tổng