NGHIÊN cứu tạo FUCOIDAN KHỐI LƯỢNG PHÂN tử THẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU xạ GRAMMA COBALT 60 và KHẢ NĂNG ức CHẾ ENZYME ALPHA GLUCOSIDASE

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO FUCOIDAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GRAMMA COBALT-60 VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA GLUCOSIDASE Người hướng dẫn: Th.S NGUYỄN ĐẶNG HẢI ĐĂNG Người thực hiện: TRƯƠNG HOÀNG THỦY NGÂN Lớp : 14060302 Khoá : 2014-2019 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO FUCOIDAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GRAMMA COBALT-60 VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA GLUCOSIDASE Người hướng dẫn: Th.S NGUYỄN ĐẶNG HẢI ĐĂNG Người thực hiện: TRƯƠNG HỒNG THỦY NGÂN Lớp : 14060302 Khố : 2014-2019 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học Th.S Nguyễn Đặng Hải Đăng Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường Đại học Tơn Đức Thắng khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền tơi gây q trình thực (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019 Tác giả (ký tên ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Tơn Đức Thắng, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học Ban Chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng lời cảm ơn chân thành,niềm tự hào học tập Trường năm qua Bên cạnh đó, để hồn thành tốt báo cáo này, em xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Đặng Hải Đăng bên cạnh em, cảm ơn anh tận tình dẫn em, cho em thêm động lực để hồn thành tốt đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh thầy Em xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn làm công tác nghiên cứu Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ giúp đỡ em nhiệt tình suốt thời gian trung tâm Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, người thân bạn bè em, quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn q trình làm khóa luận hồn thành báo cáo thật tốt Trong q trình làm khóa luận, q trình làm báo cáo khóa luận, khó tránh khỏi sai sót mong thầy, bỏ qua Đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi sai sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, cô để em học hỏi thêm nhiều kinh nghiệm cho vấn đề chuyên môn sau Em xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 TĨM TẮT MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .4 TÓM TẮT MỤC LỤC DANH MỤC MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 10 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 11 1.1 Đặt vấn đề: 11 1.2 Mục tiêu ý nghĩa nghiên cứu: .12 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 12 1.2.2 Ý nghĩa khoa học: .12 1.2.3 Ý nghĩa thực tiễn: 12 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 13 2.1 Tổng quan rong nâu 13 2.1.1 Giới thiệu rong biển 13 2.1.2 Giới thiệu rong nâu 19 2.1.3 Thành phần hóa học rong biển 21 2.2 Tổng quan Fucoidan – Sulfated polysaccharide .22 2.2.1 Giới thiệu chung Fucoidan .22 2.2.2 Thành phần hóa học fucoidan .23 2.2.3 Cấu trúc hóa học fucoidan 26 2.3 Phương pháp xạ gramma Cobalt-60 27 2.4 Phương pháp tách chiết Fucoidan từ rong nâu 28 2.5 Phương pháp tinh Fucoidan 31 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .33 3.1 Đối tượng nghiên cứu 33 3.1.1 Nguyên liệu 33 3.1.2 Vật liệu 33 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 34 3.1.4 Phương pháp nghiên cứu .34 3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình trích ly thu nhận fucoidan từ rong nâu 34 3.3 Thí nghiệm 2: Tạo đoạn fucoidan phương pháp chiếu xạ Gamma Cobalt-60 cắt mạch fucoidan (Jong-il Choi cộng sự,2014) 38 3.4 Thí nghiệm 3: Phương pháp xác định KLPT trung bình fucoidan 38 3.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần monosaccharide fucoidan phương pháp tạo dẫn xuất ghi GC-MS (Gas Chromatograph Mass Spectrometer Shimadzu), (Valafar F cs, 2006) 39 3.6 Thí nghiệm 5: Xác định đường fucose có fucoidan phương pháp sắc ký mỏng TLC .40 3.7 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt động enzyme α-D-glucosidase fucoidan thu nhận từ rong nâu Sargassum spp 41 3.8 Thí nghiệm 7: Xác định kiểu ức chế enzyme α-glucosidase fucoidan thô 44 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 4.1 Kết thí nghiệm 1: 46 4.2 Kết thí nghiệm 2, 3: Tạo đoạn fucoidan phương pháp chiếu xạ Gamma Cobalt-60 cắt mạch fucoidan .48 4.3 Kết thí nghiệm : Thành phần đường đơn fucoidan 49 4.4 Kết thí nghiệm 5: 50 4.5 Kết thí nghiệm 6: khả ức chế hoạt động enzyme α-Dglucosidase .51 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình thái rong lục Hình 2.2: Hình thái rong nâu Hình 2.3: Hình thái rong đỏ Hình 2.4: Hình thái rong nâu Hình 2.5: Cấu trúc fucoidan vị trí liên kết 3-O-linked lồi rong E.kurome Hình 3.1: Sơ đồ tóm lượt bước trình nghiên cứu Hình 3.2: Sơ đồ q trình trích ly fucoidan từ rong nâu Hình 3.3 :Phân tích thành phần đường đơn Fucoidan Hình 4.1: Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với thời gian trích ly khác Hình 4.2: Biểu đồ khảo sát hiệu suất trích ly với nồng độ CaCl2 Hình 4.3: Kết phân tích GPC mẫu fucoidan trước chiếu xạ, (a); sau chiếu xạ liều xạ 5KGy, (b); 10KGy, (c); 15KGy, (d); 20KGy, (e Hình 4.4: Kết sau chạy sắc kí mỏng TLC 10 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Một số lồi rong nâu có hàm lượng Fucoidan cao Bảng 2.2: Thành phần hóa học (%) số loài rong biển Bảng 2.3 : Thành phần fucoidan số loài rong Bảng 2.4 : Hàm lượng đường đơn loài rong Bảng 3.1: Phản ứng ức chế enzyme α-glucosidase Fucoidan nồng độ Bảng 3.2: Xác định kiểu ức chế enzyme α-glucosidase fucoidan thô theo nồng độ chất Bảng 4.1: Kết phân tích hàm lượng đường đơn có mẫu fucoidan sau chiếu xạ Bảng 4.2: Kết mức độ di chuyển mẫu Fucoidan sau chạy sắc kí TLC 40 - Xác định thành phần đường GC–MS máy Gas Chromatograph Mass Spectrometer Shimadzu GCMS–QP 2010 với cột DB-5 Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Chương trình nhiệt độ là: 65 oC, giữ phút, tăng đến 250oC với tốc độ gia nhiệt 8oC/phút, giữ 10 phút, tổng thời gian ghi 34 phút/mẫu 3.6 Thí nghiệm 5: Xác định đường fucose có fucoidan phương pháp sắc ký mỏng TLC  Mục đích thí nghiệm: Phân tích phương pháp sắc kí mỏng (thin layer chromatography) để định tính đường fucose theo phương pháp nêu báo cáo Wang cộng sự, 2015  Nguyên liệu: Mẫu Polysaccharide (30 mg/ml) từ thí nghiệm 1, thủy phân 6M axit trifluoroacetic (TFA) 100oC 24 Sau 24 giờ, ly tâm mẫu thủy phân 7380 RCF 10 phút thu dịch để phân tích phương pháp sắc ký mỏng (TLC)  Cách tiến hành: 5µl mẫu nạp lên sắc ký micropipet chuẩn Mỗi mẫu dịch đánh dấu thị với n-butyl rượu/acetic acid/nước (6:3:1, v/v) Các monosaccharides nhìn thấy sắc ký sau ngâm vào acid/sulfuric/methanol (1:1, v/v) ủ ấm xuất chấm đen bề mặt sắc ký D-glucose D-fucose sử dụng làm monosacaride chuẩn Xác định monosacarides thực giá trị Rf (tỷ lệ khoảng cách dịch chuyển monosacarides với khoảng cách dịch chuyển nhờ dung môi) màu sắc điểm giống monosaccharides tiêu chuẩn biết trước Ðại 41 lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính theo cơng thức: Rf = a/b (0< Rf