TIM HIEU VE VI KHUAN SALMONELLA

Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày trở nên cấp thiết, báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo, tình trạng ngộ độc thực phẩm leo thang ngày nghiêm trọng Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… đó, Salmonella lồi vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh nghiêm trọng khác Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu độc tố, khả gây bệnh cách phát cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tơi thực nghiên cứu đề tài “tìm hiểu vi khuẩn Salmonella” để có nhìn tổng quan vi khuẩn Salmonella số chủng vi sinh vật khác 1.2 Mục đích - Tổng quan số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm tìm hiểu Salmonella với độc tố 1.3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố chế gây độc số chủng vi sinh vật - Nghiên cứu cách phát Salmonella đề xuất biện pháp phòng ngừa GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan số vi sinh vật nhiễm thực phẩm 2.1.1 Escherichia Coli 2.1.1.1 Giới thiệu - Escherichia Coli Theodore Escherich (1857 – 1911), bác sĩ nhi khoa người Áo phát năm 1885 - E.Coli thành viên hệ vi khuẩn bình thường đường ruột, nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng - E.Coli sử dụng làm mơ hình nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực vi sinh học nói riêng sinh học nói chung Trong đó, chủng E.coli K12 mơ hình nghiên cứu nhiều Nhiều thành tựu di truyền học, hóa sinh học thu dựa sở nghiên cứu vi khuẩn 2.1.1.2 Phân loại - Về phân loại, Escherichia Coli xếp vào:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: Escherichia Coli 2.1.1.3 Đặc điểm - E.Coli trực khuẩn, Gram âm, kích thước trung bình t àm ì 0,5 àm Mt s chủng E.Coli có vỏ, hầu hết có lơng có khả di động - E.Coli có khả lên men nhiều loại đường có khả sinh E.Coli có khả sinh Indol, khơng sinh H2S, không sử dụng nguồn carbon citrat mơi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả phân giải carborxyl lysin, ornithin, arginin acid glutamic Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h dương tính GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella 2.1.1.4 Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli Yếu tố độc lực - Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, nhóm sinh loại độc tố khác nhau, có nhóm : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) VTEC (Verotoxigenic E.Coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) EIEC (Enteroinvasive E.Coli) a) Nhóm STEC - Hiện có nhiều thuật ngữ khác để gọi tên cho nhóm E.Coli Tên gọi Verotoxigenic E.Coli (VTEC) Konowalchuk cộng tác viên (1977) đặt cho nhóm phát việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero Tên gọi Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) dòng gây viêm kết tràng xuất huyết hội chứng huyết niệu (Nataro Kaper, 1989) Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E.Coli (STEC) (trước gọi Shiga-like toxin producing E.Coli SLTEC) rõ khả sản sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố Shiga - STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), gọi Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm không phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 thay đổi trình tự, tạo nhiều subtype Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g Một dòng STEC sản sinh Stx1, Stx2 Stx1 Stx2, chí nhiều dạng Stx2 - Hai độc tố Stx1 Stx2 cấu tạo từ tiểu đơn vị B có khối lượng phân tử 7,7 kDa tiểu đơn vị A có khối lượng phân tử 32 kDa Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa peptide A2 kDa nối với cầu nối disulfur Peptide A1 có hoạt tính enzyme peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào tiểu đơn vị B Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) diện bề mặt tế bào eukaryote (Stx2e có receptor Gb4) Sau chuyển vào bên tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất tác động lên tiểu phần 60S ribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động N-glycosidase cắt gốc adenin khỏi rRNA 28S ribosome, gây trở ngại cho tổng hợp protein Do không tổng hợp protein, tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Hela hay tế bào có receptor Gb3, receptor Gb4 Stx2e) chết Hậu gây độc cho tế bào ruột Stx yếu tố độc lực khác STEC gây hư hại tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC) Sự hư hại tế bào thành mạch máu Stx2e gây nên tượng phù thủng heo - Yếu tố bám dính STEC/EHEC chứng minh đóng vai trò quan trọng định vị vi khuẩn ruột Đó intimin, protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Intimin mã hóa gen eae (E.Coli attaching and effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá hủy (attachingand-effacing, A/E) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg ctv, 1993) Gen eae tìm thấy nhóm EPEC Gen eae gây tổn thương kiểu A/E số gen nằm vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE STEC/EHEC chứa gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor intimin Tir (translocated intimin receptor) số gen khác Vùng LEE không điều kiện cần mà điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên khơng phải tất STEC có gen eae, tất EHEC có gen eae - Yếu tố khác có liên quan đến độc lực STEC việc tạo enterohaemolysin (EHEC-Hly) độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1) EHEC-Hly mã hóa gen plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid tìm thấy gần tất dòng O157:H7 phổ biến dòng STEC non-O157 (Nataro Kaper, 1998) Trên plasmid có diện operon gồm khung đọc mở (open reading frame ORF) hlyCABD Trong hlyA gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên mơ tả nhóm EAEC EAEC heat-stable enterotoxin 1), tìm thấy nhiều dòng STEC Tầm quan trọng EAST1 khả gây bệnh STEC chưa biết, có vài trường hợp tiêu chảy khơng có máu mà thường thấy người nhiễm STEC b) Nhóm EPEC GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Các yếu tố độc lực bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP (bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) Ler (LEE – encorded regulator) Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG MAP ( mitochondria – associated protein), EAST – có khả phá hủy tế bào biểu mô CDT (Cytolethan distending toxin) c) Nhóm ETEC - Nhóm ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor – CF) - Độc tố ruột enterotoxin + Nhóm ETEC gồm E.Coli tạo hai loại độc tố đường ruột ST LT ETEC gây bệnh cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non tiết độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua tiết độc tố đường ruột LT ST E.Coli nhóm tiết độc tố LT, tiết ST, tiết LT ST  Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT E.Coli oligopeptide có liên hệ gần gũi mặt cấu trúc chức với độc tố tả (cholera toxin – CT) Vibrio cholerae tiết LT CT giống nhiều đặc tính cấu trúc, trình tự acid amin (giống khoảng 80%), tương đồng receptor, hoạt tính enzym, tác động thú hay ni cấy tế bào  LT có serogroup LT-I LT-II LT-I LT-II khơng có phản ứng chéo mặt miễn dịch LT-I tiết dòng E coli gây bệnh người thú Còn LTII tìm thấy chủ yếu E coli thú người LT-I oligopeptide khoảng 86 kDa, cấu tạo tiểu đơn vị A 28 kDa tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm hoạt tính enzyme độc tố gồm peptide A1 peptide A2 liên kết cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B xếp thành vòng, liên kết chắn với ganglioside GM1 liên kết lỏng lẻo với GD1b vài glycoprotein ruột – chúng receptor LT Hai loại LT-I có liên hệ gần phản ứng chéo phần với LTp (LTp-I) phân lập từ heo LTh (LTh-I) phân lập từ người Gen mã hóa cho LT elt hay lt-I nằm plasmid mà plasmid chứa gen mã hóa GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella ST và/hoặc gen mã hóa kháng nguyên yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA)  Sau độc tố vào nội bào, chúng di chuyển tế bào nhờ hệ thống vận chuyển Golgi Đích đến LT tế bào enzym adenylate cyclase nằm lớp màng tế bào biểu mơ ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein liên kết GTP (GTP-binding protein) GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) tế bào Vì enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) họat hóa dẫn đến phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) màng tế bào biểu mơ vượt q mức bình thường Kết dây chuyền kích thích tế bào bên tiết Cl- ngăn cản hấp thụ NaCl tế bào có lơng nhung Hàm lượng ion lòng ruột gia tăng kéo theo di chuyển thụ động nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro Kaper, 1998) Mặc dù kích thích Cl - gia tăng lượng cAMP tế bào cách giải thích cổ điển chế gây tiêu chảy LT CT, ngày có nhiều chứng cho thấy đáp ứng tăng tiết độc tố có chế phức tạp Một chế tác động khác độc tố có liên quan đến prostaglandin E (PGE1 PGE2) yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Sự tổng hợp phóng thích chất chuyển hóa acid arachidonic prostaglandin leukotriene kích thích vận chuyển chất điện giải kích thích nhu động ruột Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động tiết ion ruột Cơ chế thứ ba CT LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ  Nhóm LT-II giống với LT-I CT khoảng 55 - 57% tiểu đơn vị A, không giống với LT-I CT tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP tế bào qua chế tương tự LT-I, LT-II sử dụng GD1 làm receptor thay GM1 Như nói trên, LT-II khơng có liên quan đến bệnh người thú  Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ cầu nối disulfur giải thích cho khả chịu nhiệt độc tố ST chia thành nhóm STa STb, khác cấu trúc chế hoạt động Gen mã hóa cho nhóm tìm thấy chủ yếu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella plasmid vài gen mã hóa ST tìm thấy transposon Sta (hay gọi ST-I) tạo ETEC vài vi khuẩn Gram âm khác Yersinia enterocolitica V cholerae non – O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 EAEC Gần đây, có báo cáo cho vài dòng ETEC sản sinh độc tố EAST1 ngồi độc tố STa Còn STb tìm thấy ETEC  STa peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng kDa STa chia thành loại STp (ST porcine hay STIa) phân lập heo STh (ST human hay STIb) phân lập người Cả loại độc tố tìm thấy dòng ETEC người Receptor STa enzyme xuyên màng GCC (guanylate cyclase C) thuộc họ enzyme receptor cyclase Sự kết hợp STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối dẫn đến kích thích tiết Cl - ngăn cản hấp thụ NaCl, gây tiết chất lỏng ruột STb: STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo có báo cáo vài chủng ETEC người sản sinh STb Không STa, STb gây tổn thương mặt mô học lớp biểu mô ruột tế bào nhung mao biểu mô ruột teo nhung mao phần Receptor STb chưa biết rõ gần người ta cho độc tố kết hợp khơng đặc hiệu với màng tế bào chất trước vào tế bào Không tạo tiết Cl - STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO 3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb kích thích phóng thích PGE2 serotonin, từ người ta cho ENS có liên quan đến đáp ứng tiết gây độc tố (Hitotsubashi, 1992) - Yếu tố định vị (CF): Cơ chế mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy ruột nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông bề mặt vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF) CFA phân loại dựa đặc tính hình thái Có loại gồm loại lơng hình que cứng, lơng hình que mềm có dạng bó, lơng có cấu trúc mảnh mềm Gen CFA thường mã hóa plasmid, nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT d) Nhóm EAEC GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Những yếu tố độc lực EAEC bao gồm diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet độc tố EAST – AFF xem yếu tố định độc lực Ba loại AAF biết đến gồm AAF/I, AAF/II AAF/III, loại I loại II có cấu trúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt Các AAF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch lên tế bào Hep – Yếu tố aggR có vai trò điều hòa biểu AAF Protein Pet tiết màng vi khuẩn gây tụ dịch gây độc cho biểu mơ tiêu hóa EAST – có khả phá hủy tế bào biểu mơ Ngồi yếu tố độc lực nêu trên, EAEC tiết protein làm tan máu làm thăng vận chuyển protein qua màng Các yếu tố độc lực nêu EAEC chủ yếu mã hóa gen nằm plasmid có phân tử lượng 60 MDa Một số yếu tố độc lực mã hóa gen nhiễm sắc thể nghiên cứu e) Nhóm EIEC - EIEC gây bệnh chủ yếu khả xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Khả xâm nhập mã hóa gen plasmid 140 MDa Các gen plasmid mã hóa cho kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion plasmid antigen) EIEC có khả sản xuất độc ruột giống số Shigella Gen mã hóa cho độc tố có tên sen (Shigella enterotoxin), chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu túi thực bào nhân lên bào tương, phá hủy tế bào xâm lấn sang tế bào khác 2.1.1.5 Khả gây bệnh - E.Coli nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật Là nguyên nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết, nguyên thường gặp bệnh viêm màng não, viêm phổi trẻ sinh E.Coli gặp nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng bỏng - Trong loại độc tố E.Coli, độc tố Shiga nguy hiểm biết đến người, làm hủy hoại vi nhung mao hấp thu tế bào biểu mơ ruột Nó xâm nhập vào tế bào biểu mơ đại tràng, ức chế q trình tổng hợp protein làm chết tế bào Hậu gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân máu Những trường hợp họai tử nặng gây thủng ruột 2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Các trung tâm kiểm sốt dịch bệnh (CDC) tính có 85% nguồn gốc E.Coli có nguồn gốc thực phẩm Trên thực tế, tiêu thụ thực phẩm nhiễm phân (đặc biệt phân gia súc) dẫn đến việc nhiễm bệnh Các thực phẩm xác định nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khơ (khơng nấu chín), sữa chưa tiệt trùng, phô mai, nước trái chưa tiệt trùng, cỏ linh lăng, mầm củ cải, rau nước 2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa kiểm sốt - Hiện chưa có biện pháp phòng ngừa đặc hiệu Để đề phòng nhiễm khẩn đường tiêu hóa E.Coli, thực biện pháp phòng ngừa khơng đặc hiệu giống loại vi khuẩn đường ruột khác - Đề phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu E.Coli : thực sinh hậu mơn phận sinh dục ngồi Điều trị loại trừ yếu tố nguy khác E.Coli vi khuẩn gây bệnh hội quan trọng 2.1.2 Listeria monocytogenes 2.1.2.1 Giới thiệu - Năm 1924, Muray cộng trình nghiên cứu dịch bệnh động vật thí nghiệm, phân lập chủng vi sinh vật từ hạch lympho động vật bị bệnh Sau ông lấy chủng vi khuẩn tiêm cho vật khỏe mạnh thấy có tượng tăng bạch cầu đơn nhân (monocytosis), ơng đặ tên cho Bacillus monocytogenes Ba năm sau, Nam Phi, Pirie, nghiên cứu mang Yersinina pestis chuột, phân lập từ gan chuột chủng vi khuẩn đặt tên cho Listeria hepatolitica Loại vi khuẩn hồn tồn khơng thể phân biệt với chủng vi khuẩn Muray Chính vậy, Pirie đề xuất tên cho chủng vi khuẩn này, Listeria monocytogenes 2.1.2.2 Phân loại  Giới: Bacteria  Ngành : Firmicutes  Lớp: Bacilli  Bộ: Bacillales  Họ: Listeriaceae  Chi: Listeria  Loài : Listeria monocytogenes 2.1.2.3 Đặc điểm - Các lồi Listeria trực khuẩn Gram dương, có kích thước ngn (0,4 0,5 ì 0,5 2,0 àm), chỳng mọc môi trường nuôi cấy không acid, không sinh GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella nha bào Ở 20oC chúng di chuyển lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), di động không quan sát 37 oC Chúng vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc sinh trưởng khoảng nhiệt độ dao động rộng từ – 45oC (tối ưu 30 – 36oC), tốc độ mọc nhiệt độ thấp chậm Chúng mọc khoảng pH dao động rộng, số chủng mọc pH 9,6, đạt điều kiện tối ưu pH kiềm mơi trường trung tính Hình 2.2: Vi khuẩn Listeria monocytomonogenes 2.1.2.4 Yếu tố độc lực - Listeriolysin O (LLO) yếu tố độc lực Listeria monocytigenes cho phép khỏi thực bào LLO có khối lượng phân tử 58,6 kDa, hình thành chuỗi polypeptide đơn gồm 529 amino acids Trình tự đầu N đại diện cho đặc điểm trình tự dấu hiệu vi khuẩn Gram dương điển hình: phần có tính nước mang điện tích dương theo sau 20 đầu kỵ nước Trình tự mã hóa trực tiếp cho protein phân cắt sau vị trí lysine 25 Kết LLO amino acid 26, phân tử protein dài 504 aa có trọng lượng phân tử 55,8 kDa - LLO thuộc họ độc tố gắn cholesterol hoạt nhóm thiol tạo hầu hết vi khuẩn Gram dương Hoạt tính ly giải độc tố giảm bớt số tác nhân bị kìm hãm oxy hóa biểu có cholesterol kháng thể kháng streptolysin O Cytolysin hoạt hóa thiol có cystein đơn vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt oxy hóa cystein thay alanine mà khơng làm chức ly giải Chúng tạo nên lỗ khơng liên tục với đường kính bên lên đến 30 nm màng chứa cholesterol Cơ chế hoạt động chúng dựa vào tương tác với cholesterol có GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 10 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella  Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết  Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu nước cất vô trùng + Chương trình khuếch đại  Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: Duy trì nhiệt độ 95 oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi DNA mẫu Tiếp theo 35 chu kỳ, chu kỳ có bước sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20 oC điện di - Ðiện di sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị gel điện di agarose 1%  Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hoàn toàn đệm TAE + Chuẩn bị dịch điện di  Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật + Ðiện di  Một giếng gel điện di sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn - Nhuộm DNA, quan sát sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu  Pha dung dịch nhuộm DNA sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di + Nhuộm gel  Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư + Quan sát, chụp hình  Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ DNA xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 30 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Ðọc giải thích kết + Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm + Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel + Mẫu kết luận âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp 2.3.2.2 Phương pháp ELISA - ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng để phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Kĩ thuật có độ nhạy khoảng 106CFU/ml nhiên phải thực bước tăng sinh tăng sinh chọn lọc trước thực phản ứng miễn dịch - Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) kit phát nhanh Salmonella spp dựa nguyên tắc E sanwich Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc cho vào giếng, có diện vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao vi sinh vật tạo phức hợp với kháng thể cố định giếng kháng thể tự có gắn enzyme peroxydase tạo thành phức hợp kép (sanwhich) Sau kháng thể có gắn enzyme dạng tự không tạo phức hợp sanwhich bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp sanwihch phát nhờ bổ sung chất phản ứng (ure peroxide teramethylbenzidine) Enzyme peroxide thủy phân chất tạo phản ứng màu xanh dương Phản ứng kết thúc cách bất hoạt enzyme dung dịch kết thúc làm acid hóa mơi trường lầm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng Sự hình thành màu vàng chứng minh diện kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu mật độ màu vi sinh vật xác định cách đo cường độ màu máy so màu 2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella thực phẩm - Đối với gia súc gia cầm: Trong chăn ni cần ý đề phòng bệnh tật cho chúng Phải kiểm tra thú y giết súc vật, điều làm tốt có hội bán xuất loại thịt nhiễm Salmonella Trong giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh lây lan vi khuẩn, ý tới loại dụng cụ dùng giết thịt GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 31 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm chế biến nguyên liệu Chú ý thịt băm, patê thịt nghiền mà không ướp lạnh sau tạo điều kiện cho tồn khối ngun liệu nhiễm trùng mau chóng - Đun sôi thực phẩm trước ăn biện pháp tốt Thịt ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài bình thường, đun phải đảm bảo nhiệt độ sôi bên miếng thịt (ít phút) Thực phẩm thừa, thực phẩm dự trữ phải đun lại trước ăn Với trứng bị nhiễm Salmonella sớm đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng ), phải chế biến chín hồn tồn, tuyệt đối khơng ăn sống hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột - Thực nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước vào khám định kỳ (1 năm/1 lần) người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm thực phẩm nấu chín Chương III : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian - Thời gian: Từ ngày 31/05/2010 đến ngày 12/06/2010 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 32 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh - Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh 3.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu phát Salmonella số mẫu thịt gà tươi sống địa bàn hai quận Phú Nhuận Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh 3.3 Vật liệu thí nghiệm 3.3.1 Các dụng cụ hóa chất tiến hành thí nghiệm - Kéo cắt mẫu - Pipet 1ml, 5ml, 10ml - Đĩa petri - Micropipet 10µl-200µl - Túi PE vơ trùng - Que cấy thẳng, que cấy vòng - Cân điện tử - Ống nghiệm khử trùng - Tủ ấm 37oC, 42oC - Nồi hấp khử trùng 121oC - Đèn cồn - Quả bóp cao su - Chai chịu nhiệt dung tích 500ml, 1000ml - Gía ống nghiệm inox - Tủ cấy - Bông không thấm - Que cấy - Cồn 96o, 70o - Nước cất khử trùng 3.3.2 Các môi trường sử dụng - Môi trường BPW (Ấn Độ) - Môi trường RV (Ấn Độ) - Môi trường XLD (Ấn Độ) - Mơi trường dùng để test sinh hóa : + LDC (Ấn Độ) + Manitol (Ấn Độ) + Urea (Merck) + VP (Ấn Độ) + TSI (Ấn Độ) + Trypton (Ấn Độ) 3.4 Nội dung thực Mẫu thịt gà Thu mẫu địa điểm khảo sát GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 33 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Đánh giá tiêu Cảm quan Salmonella 25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng 30 giây Nhận xét,nhất Kếtmẫu luậntrong -1 Hình 3.1: Nội dungđộthực thí nghiệm pha lỗng 10 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Quy trình phân tích Đem ủ 37oC 24 Lấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV Ủ 42oC ± 0,5 24 Cấy chuyển môi trường XLD ủ nhiệt độ 37 oC 24 KL đặc trưng Salmonella mơi trường XLD : tròn, lồi, suốt, có tâm đen đơi tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : mơi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP Hình 3.2: Quy trình phân tích Salmonella thí nghiệm 3.5.2 Ủ 37oC 24 Thuyết minh quy trình GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 34 SVTH: Nguyễn HữuBiểu Liêmhiện đặc trưng Salmonella : TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-); LDC(+); Indol(-); VP(-) Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella a) Chuẩn bị mẫu - Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy chất lỏng có), cho vào bao nilong vơ khuẩn Thêm vào 225ml môi trường PBW hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng mẫu độ pha loãng 10 -1 Đem ủ nhiệt độ 370C 24 b) Cấy mẫu - Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ 42 ± 0,5 oC 24 - Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD ủ nhiệt độ 370C 24 Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng salmonella mơi trường XLD: tròn, lồi, suốt , có tâm đen đơi tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)… Hình 3.3: Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella - Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc ủ 37 ± 0,5oC 24 c) Thử nghiệm khẳng định - Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang môi trường thử nghiệm sinh hóa Thực sau:  Thử nghiệm môi trường TSI: - Hấp khử trùng môi trường TSI 1210C 15 phút phân phối môi trường vào ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 35 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc giống sâu vào đáy ống thạch nghiêng - Sau cấy xong ủ 370C vòng 24h – 48h - Salmonella lên men đường glucose môi trường TSI  phần nghiêng môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng - Salmonella có khả H2S  xuất vệt màu đen mơi trường TSI - Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng không bên ống nghiệm Negative Negative Positive Hình 3.4: Thử nghiệm mơi trường thạch TSI  Thử nghiệm Urea Broth: - Cấy VSV vào mơi trường canh urea có chứa chất thị bromocresol purple - Ủ 370C khoảng 12h – 18h - Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu vàng - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 36 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella  Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường Sau nuôi cấy môi trường giữ ngun màu tím Negative Negative Negative Hình 3.5: Thử nghiệm Urea Broth  Lên men mannitol: - Môi trường sử dụng mơi trường phenol red broth base có pH 7.4, thị mơi trường phenol red có màu đỏ chuyển thành màu vàng pH < 6.8 - Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần khẳng định - Ủ 370C 18 – 24h - Khả lên men chủng đánh giá dựa vào sinh acid sinh - Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng - Sinh (-): có bọt khí ống Durnham  Môi trường sau nuôi cấy salmonella bị acid hóa chuyển thành màu vàng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 37 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Positive Negative Hình 3.6: Lên men Mannitol  Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase): - Sử dụng môi trường Falkow - Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần khẳng định - Chất thị màu môi trường Bromocresol purple - Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục - Phản ứng (-): mơi trường từ tím chuyển sang vàng  Sau nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 38 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.7: Thử nghiệm LDC  Thử nghiệm khả sinh Indol: - Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 37oC - Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s - Quan sát sau vài phút - Thử nghiệm (+): bề mặt môi trường xuất vòng màu đỏ cánh sen - Thử nghiệm (-): khơng xuất vòng đỏ GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 39 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Positive Negative Negative Hình 3.8: Thử nghiệm Indol  Thử nghiệm Voges – Proskauer: - Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth) - Ủ nhiệt độ 370C vòng từ 2-5 ngày - Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% cồn dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 % với tỷ lệ 3:1 - Quan sát phản ứng xảy phút - Thử nghiệm (+):xuất màu đỏ hay hồng sáng mặt môi trường - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 40 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.9: Thử nghiệm Voges – Proskauer 3.4.5 Nhận định tính sinh hố đặc hiệu: Tính chất sinh hố Dương âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactose 99,2 TSI sucrose 99,5 TSI glucose + 100 TSI glucose sinh + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê 100,0 Lên men mannitol + Phản ứng Indol 98,2 Phản ứng V.P 100,0 Bảng 3.1: Phát hay không phát Salmonella 25g mẫu 3.6 Kết 3.6.1 Kết cảm quan - Về màu sắc, thịt gà có màu đặc trưng, phần thịt hồng, phần mỡ màu vàng tươi da màu vàng trắng - Về mùi, thịt có mùi đặc trưng, khơng có mùi lạ - Về tính chất, bề mặt thịt có nước, có độ đàn hồi tốt - Về cảm quan nhìn chung tốt, thịt nhìn tươi, tính chất, màu sắc, mùi vị khơng có lạ Nhưng đánh giá cảm quan không đủ để xem xét mức độ thịt 3.6.2 Kết đánh giá mức độ nhiễm Salmonella - Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella CFU/25g GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 41 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Hình 3.10 : Tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu khảo sát - Theo bảng trên, mẫu mẫu nhiễm Salmonella với tỷ lệ 33.33% Việc tạp nhiễm Salmonella thao tác người phân phối thịt không hợp vệ sinh, không dùng dụng cụ bảo hộ Hoặc thịt bị tạp nhiễm khơng khí, vệ sinh khu bn bán nhiễm trung tâm giết mổ Hai mẫu nhiễm nói lên tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm hai khu vực thấp, tỷ lệ tạp nhiễm quy định TCVN CFU/25g - Tóm lại, ba mẫu 1, âm tính với Salmonella sử dụng được, phải đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm, khơng có Salmonella gây ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella khơng có nghĩa khơng nhiễm vi sinh vật khác - Hai mẫu sử dụng được, sở phân phối cần có biện pháp vệ sinh tốt hơn, đổi khu vực lấy thực phẩm khác để tránh tình trạng lây nhiễm Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Sau trình nghiên cứu lý thuyết thực nghiệm, chúng tơi nhận thấy Salmonella lồi vi khuẩn nguy hiểm, chúng gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết số bệnh khác Đáng nói loài thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều vơ nguy hiểm theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella CFU/25 g GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 42 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm trải rộng khắp nước, lực kiểm dịch chưa cao địa phương , thành phố lớn Tp Hồ Chí Minh 4.2 Kiến nghị - Trong thực nghiệm trên, có số phần thời gian gấp mà chưa thể thực + Khảo sát tình trạng vi sinh khu bn bán + Khảo sát qua tình hình giết mổ gia cầm địa bàn thành phố Hồ Chí Minh - Lập trung tâm kiểm dịch địa bàn quận yêu cầu thịt trước bán cần phải qua kiểm dịch sử dụng dụng cụ phân phối hợp vệ sinh - Nên lập địa điểm bán thực phẩm tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ sinh khu buôn bán Thường xuyên tổ chức đợt kiểm tra khu chăn nuôi giết mổ để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn vi sinh vật trường đại học y Hà Nội (2007), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội Bộ môn vi sinh vật trường đại học y khoa Huế (2004), giảng vi sinh y học Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội Trần Linh Phước (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, ,Boca Raton London New York Washington, D.C, USA Camilla Giammarini and Mauro Magnani, Listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Diatheva, Centre for Biotechnology, University of Urbino, Italy GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 43 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996), Enteric Bacterial Toxins: Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Secretion, American Society for Microbiology FAO and WHO (2009), Salmonella and Campylobacter in chicken meat Jame M.Jay (2000), Modern Food Microbiology 10 WHO, Risk assessments of Salmonella in eggs and broiler chickens GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 44 ... Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella thường có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời dẫn đến tử vong Những biến chứng khác vi m phổi cấp,, vi m màng não, vi m gan, vi m tủy xương... Liêm 15 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella nguyên vỏ bao bọc bên kháng nguyên O, khánh ngun Vi khơng tham gia vào q trình gây bệnh 2.2.5 Yếu tố độc lực - Vi khuẩn Salmonella tiết loại độc tố:... hiểu vi khuẩn Salmonella khả nhân lên đại thực bào nội độc tố Kháng nguyên Vi có mặt S.typhi S.pararatyphi C yếu tố độc lực quan trọng, chủng vi khuẩn gây bệnh thương hàn khơng có kháng ngun Vi