Đề tài tìm hiểu về VI KHUẨN ACETIC

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGÀNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN MÔN HỌC: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM VI KHUẨN ACETIC GV : TS LÊ VĂN VIỆT MẪN HV : ĐẶNG THỊ HOÀNG LAN PHẠM PHI OANH NGUYỄN THỊ CẨM VI LỚP : K15 TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2004 MỤC LỤC Trang I TOÅNG QUAN VỀ VI KHUẨN ACETIC I.1 Acetobacter .1 I.2 Gluconobacter I.3 Gluconacetobacter I.4 Asaia I.5 Acidomonas I.6 Kozakia 10 II DINH DƯỢNG CỦA VI KHUẨN ACETIC 11 II.1.Một số nghiên cứu khởi đầu 11 II.2.Nguyên liệu phương pháp 12 II.3.Kết thí nghiệm 14 II.4.Thảo luận 19 II.5.Kết luận .20 III SINH LÝ VI KHUẨN ACETIC 21 IV MÔI TRƯỜNG IV.1 Môi trường IV.2 Môi trường men 23 IV.3 Môi trường IV.4 Môi trường IV.5 Môi trường IV.6 Môi trường IV.7 Môi trường IV.8 Môi trường IV.9 Môi trường IV.10 Môi trường IV.11 Môi trường MRS .23 Trypticase đậu nành chất chiết nấm Gluconobacter oxydans .24 Acetobacter peroxydans 24 YPM 25 Methylobacterium với methanol 25 Acetobacter europaeus 26 RAE 26 AE 27 thay theá Acetobacter intermedius .28 Acetic acid bacterium 28 V ỨNG DỤNG 29 V.1.Saûn xuaát giaám 29 V.2.Sản xuất L – sorbose 29 V.3.Sản xuất thức uống Kombucha .30 Vi khuẩn Acetic I TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ACETIC Vi khuẩn acetic biết đến vi khuẩn sản xuất giấm từ hàng trăm năm trước Chúng thuộc họ Acetobacteraceae Gillis & De Ley 1980, hình que, Gram (-), tế bào đứng mình, thành đôi hay thành chuỗi ngắn dài, số loài chuyển động, số không Chúng sinh sản vô tính, trao đổi chất hiếu khí bắt buộc, oxi hóa rượu hay đường không hoàn toàn dẫn đến tích lũy acid hữu sản phẩm cuối, chịu điều kiện acid tượng đối cao (pH < 4) Cho tới gần (1992), Acetobacter Gluconobacter hai giống vi khuẩn acetic Đặc điểm chủ yếu để phân biệt chúng Acetobacter oxi hóa hoàn toàn acid acetic thành khí carbonic nước hệ enzym chu trình Krebs, Gluconobacter không oxi hóa acid acetic đầy đủ hệ enzym [13, 14] Sự thay đổi đáng kể việc phân loại vi khuẩn acetic việc giới thiệu giống Gluconacetobacter Yamada et al (1997 1998) Hiện nay, giống (genera) với 34 loài (species) vi khuẩn acetic nhận dạng, gồm Acetobacter Beijerinck 1898 (14 loài), Gluconobacter Asai 1935 (3 loaøi), Acidomonas Urakami et al 1989 (1 loaøi), Gluconacetobacter Yamada et al 1997 (11 loaøi), Asaia Yamada et al 2000 (4 loaøi), vaø Kozakia Lisdiyanti et al 2002 (1 loài) [6, 9, 16] 1.1 Acetobacter Acetobacter có kích thước khoảng 0.6-0.8 x 1.0-3.0m Các loài Acetobacter có khả oxi hóa ethanol thành acid acetic, điều hoàn toàn dựa vào enzym nằm bề mặt màng tế bào chất gọi dehydorgenase liên kết – màng (membrane – bound dehydorgenase); alcohol dehydorgenase (ADH) vaø acetaldehyde dehydorgenase (ALDH) [6] Trong Danh sách Tên vi khuẩn công nhận (the Approved Lists of Bacterial Names), 1980, loài liệt kê cấp độ phân loại chi tiết giống Acetobacter laø Acetobacter aceti (type species), A pasterianus vaø A peroxydans Trong loài đầu, nhiều loài phụ (subspecies) nhận dạng -1- Vi khuẩn Acetic gồm A.ceti subsp aceti, A aceti subsp liquefaciens, A.aceti subsp orleanensis, A aceti subsp xylinum, A pasteurianus subsp pasterianus, A pasteurianus subsp ascendens, A pasteurianus subsp estunensis, A.pasteurianus subsp lovaniensis, A.pasteurianus subsp paradoxus Heä thống phân loại có nguồn gốc từ Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (8 th edition, 1974) Năm 1983, Gosselé et al khảo sát chủng cho thuộc giống Acetobacter theo phân tích đặc điểm kiểu hình vận chuyển điện tử protein gel (protein gel electrophoresis) Họ kết luận nên bỏ loài phụ đề cập Giống Acetobacter chia thành nhóm với cấp độ chi tiết gồm: Acetobacter liquefaciens, A.hansenii, A aceti (type species), A pasteurianus Acetobacter xylinus, moät kết hợp đề nghị cho chủng xác định đặc điểm ubiquinone-10 (Q10) ngược với ubiquinone-9 (Q-9) chủng thuộc A aceti A pasteurianus Chủng giống cuối xếp vào A pasteurianus Sokollek et al mô tả loài A pomorum A oboediens năm 1998 Loài sau sau chuyển qua giống Gluconacetobacter dựa tảng chuỗi gene 16S rRNA quinone gồm có Q-10 Lisdiyanti et al (2000 2001) khảo sát chủng thuộc giống Acetobacter phân lập từ nguồn Indonesia lượng DNA G+C lai DNA-DNA (hybridization) Họ nhận diện A pasteurianus A peroxydans với type species A.aceti Họ đề nghị loài A indonesiensis, A tropicalis, A cibinongensis, A orientalis, A orleanensis, A lovaniensis vaø A estunensis Năm 2002, Cleenwerck et al mô tả loài thêm vào dựa sở lai DNA-DNA Những loài đề nghị A cerevisiae A malorum Những loài đề cập giống Acetobacter chia loài thành sublineages A B Loại đầu bao gồm A.aceti (type species) xác định đặc điểm -2- Vi khuẩn Acetic tạo thành 2-keto-D-gluconate từ glucose, loại sau gồm A pasteurianus xác định đặc điểm không tạo thành 2-ketoD-gluconate [16] Theo Bảng Cập nhật Danh pháp vi khuẩn (Bacterial Nomenclature Up-to-date), dựa Danh sách Tên vi khuẩn công nhaän (the Approved Lists of Bacterial Names, International Journal of Systematic Bacteriology) cập nhật theo Tập san International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Hãng DSMZ (Đức) cung cấp tháng 9/2004 giống Acetobacter gồm loài nhö sau: [4] Acetobacter aceti Acetobacter aceti subsp liquefaciens → Acetobacter liquefaciens → Gluconacetobacter liquefaciens Acetobacter aceti subsp orleanensis → A orleanensis Acetobacter aceti subsp xylinus (corrig.) → Acetobacter xylinus subsp xylinus → Gluconacetobacter xylinus Acetobacter cerevisiae 52:1557* Acetobacter cibinongensis 52:3 Acetobacter diazotrophicus → Gluconacetobacter Acetobacter estunensis 51:263 Acetobacter europaeus → Gluconacetobacter Acetobacter hansenii → Gluconacetobacter Acetobacter indonesiensis 51:263 Acetobacter intermedius → Gluconacetobacter Acetobacter liquefaciens → Gluconacetobacter Acetobacter lovaniensis 51:263 Acetobacter malorum 52:1557* Acetobacter methanolicus → Acidomonas methanolica Acetobacter oboediens → Gluconacetobacter Acetobacter orientalis 52:3 Acetobacter orleanensis 51:263 Acetobacter pasteurianus Acetobacter pasteurianus subsp ascendens  A pasteurianus -3- Vi khuaån Acetic Acetobacter pasteurianus subsp estunensis → A estunensis Acetobacter pasteurianus subsp lovaniensis → A lovaniensis Acetobacter pasteurianus subsp paradoxus  A pasteurianus Acetobacter peroxydans  A pasteurianus Acetobacter pomorum 48:940* Acetobacter syzygii 52:3 Acetobacter tropicalis 51:263 Acetobacter xylinus subsp sucrofermentans  Gluconacetobacter xylinus Acetobacter xylinus subsp xylinus → Gluconacetobacter xylinus Giải thích ký hiệu: Ký hiệu Ví dụ Giải thích Tên, ghi khác Acetobacter aceti Có Danh sách công nhận (Approved Lists) Số tham khảo, dấu * Acetobacter orleanensis 51:263 Danh sách hợp lệ International Journal of Systematic Bacteriology (Số : trang) Số tham khảo có dấu * Acetobacter cerevisiae 52:1557* Bản gốc International Journal of Systematic Bacteriology (Số : trang) → Acetobacter diazotrophicus → Gluconacetobacter Tên cũ, phân loại lại thành  Acetobacter xylinus subsp sucrofermentans  Gluconacetobacter xylinus Đồng (heterotypic synonym) corrig Acetobacter aceti subsp Sửa lỗi tả -4- nghóa Vi khuẩn Acetic xylinus (corrig.) → Acetobacter xylinus subsp xylinus → Gluconacetobacter xylinus  Acetobacter aceti (type species) Acetobacter aceti (Beijerick, 1898) Beijerrick, 1900 Theo Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1957) loài có đặc điểm sau: [2] Hình gậy, 0.4-0.8 x 1.0-2.0m, đứng hay thành chuỗi dài, thường thấy dạng hình chùy (club-shaped) lớn; nhuộm màu vàng với dung dịch iod; chuyển động, tế bào chuyển động có tiên mao kiểu cực mao (polar flagellum) Khi nuôi môi trường gelatin bia chứa 10% sucrose tạo khuẩn lạc (colonies) lớn, bóng Khi môi trường lỏng tạo thành màng mỏng nhầy, tạo thành vòng (ring) hay lớp đục (turbidity) mà không thành màng Tạo acid từ glucose, ethanol, propanol glycol Không tạo acid từ arabinose, galactose, sorbose, sucrose, maltose, lactose, raffinose, dextrin, tinh boät, glycogen, inulin, methanol, isopropanol, butanol, isobutanol, pentanol, glycerol, erythriol, mannitol, dulcitol hay acetaldehyde Đặc điểm phân biệt: có lực oxi hóa rõ rệt, gây oxi hóa nhanh chóng hoàn toàn chất glucose hay ethyl alcohol; có khả sử dụng muối nitơ vô nguồn nitơ nhất; phát triển hoạt động oxi hóa với nấm men lên men Nhiệt độ tối ưu 30oC, phát triển nhiệt độ từ 10 – 42oC Môi trường sống: giấm, trái cây, rau thức uống bị chua 1.2 Gluconobacter -5- Vi khuẩn Acetic Gluconobacter kích thước 0.6-0.8 x 1.5-2.0m, không oxi hóa acid acetic thành CO2 H2O theo chu trình Tricarboxylic Acid Acetobacter, có enzym thuộc chu trình ketoglutarate dehydrogenase succinate dehydrogenase không hoạt động [14] Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date DSMZ loài thuộc giống gồm có: [4] Gluconobacter asaii  G cerinus Gluconobacter cerinus 34:503 Gluconobacter frateurii 39:182* Gluconobacter oxydans subsp industrius Gluconobacter oxydans subsp melanogenes Gluconobacter oxydans subsp oxydans Gluconobacter oxydans subsp sphaericus Gluconobacter oxydans subsp suboxydans  Gluconobacter oxydans Gluconobacter oxydans trước đặt tên Acetobacter suboxydans, vi khuẩn hữu dụng công nghiệp Việc phân loại lại A suboxydans thành G oxidans kết việc khám phá giống Gluconobacter thiếu đường hexose monophosphate G.oxydans có tên từ oxys, theo tiếng Latin “chua, gắt”, dans “đưa, cho” Nó tìm thấy hoa quả, dùng để lên men sorbose Chúng catalse dương vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Khuẩn lạc hình tròn với đường kính khoảng 3mm, lồi lên, thường có rìa rõ nét Khuẩn lạc màu trắng, vàng hay chí nâu phía khuẩn lạc Chúng phát triển thích hợp nhiệt độ 25-30 oC, nhiên không phát triển 37oC pH thích hợp từ 5.5-6.0 [5] Sự oxi hóa không hoàn toàn nhiều carbohydrate alcohol G oxydans thích hợp cho nhiều ứng dụng công nghệ sinh học Một tính chất quan trọng G oxydans khả oxi hóa D-glucose thành acid D-gluconic oxi -6- Vi khuẩn Acetic hóa thành acid 5-keto-D-gluconic (5-KGA), chất xem thích hợp công nghiệp nhóa học chất tiền đề cho sản xuất acid L(+) tartaric, 5-KGA dễ dàng chuyển thành acid L(+) tartatic Acid L(+) tartatic có nhiều ứng dụng công nghiệp thực phẩm y học Nhiều enzym liên quan đến phản ứng oxi hóa không hoàn toàn quinoprotein dehydrogenase, enzym sử dụng cofactor pyrrolloquinolie quinone (PQQ) Trong Gluconobacter người ta xác định quinoprotein xúc tác cho oxi hóa alcohol, glucose, gluconate, glycerol, frutose vaø xylose [3] 1.3 Gluconacetobacter Yamada vaø Kondo chia giống Acetobacter thành giống phụ (subgenera) dựa sở hệ thống ubiquinone khác Loại subgenus Acetobacter xác định Q-9 Ngược lại, subgenus Gluconacetobacter Yamada & Kondo 1984 xác định Q-10 Đối với giống phụ thứ hai, có loài chuyển sang Acetobacter (Gluconacetobacter) liquefaciens Acetobacter (Gluconacetobacter) xylinus Năm 1997, giống phụ (subgenus) Gluconacetobacter nâng lên thành giống (generic level) dựa sở phân tích phần chuỗi 16S rRNA Giống Gluconacetobacter Yamada et al 1997 đề nghị với kết hợp gồm: Gluconacetobacter liquefaciens, Gluconacetobacter diazotrophicus, Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter hansenii Gluconacetobacter europaeus Những loài điều chỉnh chuyển qua giống Gluconobacter là: G oboediens, G intermedius, G sacchari, G entanii, G johannae, G azotocaptans Những loài đề cập giống Gluconacetobacter chia loài thành sublineages, A B Loại đầu gồm G liquefaciens (type species), loại sau gồm G xylinus G hansenii [16] -7- Vi khuaån Acetic Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date Gluconacetobacter gồm 11 loài sau: [4] DSMZ Gluconacetobacter azotocaptans 51:1312* Gluconacetobacter diazotrophicus 48:327 Gluconacetobacter entanii 50:2019* Gluconacetobacter europaeus 48:327 Gluconacetobacter hansenii 48:327 Gluconacetobacter intermedius 50:2226* Gluconacetobacter johannae 51:1312* Gluconacetobacter liquefaciens 48:327 Gluconacetobacter oboediens 50:2226* Gluconacetobacter sacchari 49:1691* Gluconacetobacter xylinus 48:327  Gluconacetobacter xylinus Gluconacetobacter xylinus corrig (Brown 1886) Yamada et al 1998, comb nov., trước phân loại Acetobacter xylinus corrig (Brown 1886) Yamada 1984, hay Acetobacter xylinum (sic) (Brown 1886) Bergey et al 1925 Chuùng loại vi khuẩn có khả tạo polysaccharide ngoại bào (EPS – exopolysaccharides) EPS ứng dụng nhiều công nghiệp thực phẩm tác nhân làm dầy (thickening), tạo gel hay chất ổn định 1.4 Asaia Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date DSMZ giống Asaia gồm loaøi: [4] Asaia bogorensis 50:828* Asaia krungthepensis 54:315* Asaia siamensis 51:562* Ngoài ra, theo Puspita Lisdiyanti giống có thêm loài Asaia indonesiensis phân lập từ nguồn ôû Indonesia [14]  Asaia bogorensis -8- Vi khuaån Acetic A.melanogenum giống Vì nói sản phẩm tự phân nấm men chứa nhiều yếu tố sinh trưởng quan trọng giúp nấm men phát triển với nguồn carbon ethanol, lactate pyruvate Bảng 4: Ảnh hưởng nguồn carbon đến phát triển vi khuẩn acetic môi trường có nitơ ammonium Chủng vi khuẩn Nguồn carbon lượng(*) Nguồn nitơ A.suboxyda (NH4)2SO4 ns, chủng Casein bị thủy phân Sản phẩm tự phân nấm men A.melanog (NH4)2SO4 enum, Casein bị thủy chủng MA phân 6.2 Sản phẩm tự phân nấm men Glycer ol Mannit ol Sorbit ol Ethan ol Na lactat e Na pyruva te +++ +++ + +++ + +++ + +++ + +++ + +++ + +++ + +++ + +++ ++ + +++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ + ++ ++ +++ +++ ++ + +++ (*): moâi trường A với 0.5% Na pyruvate 2% nguồn carbon khác Hỗn hợp yếu tố sinh trưởng biết thay sản phẩm tự phân nấm men nh hưởng tăng nồng độ dịch tự phân nấm men đến việc sử dụng ethanol chủng thuộc loài A.suboxydans trình bày bảng Một lượng tối thiểu dịch tự phân nấm men khoảng 10 mg làm tăng phát triển nấm men tạo thành lượng acid đáng kể Sự phát triển nấm men tăng đáng kể nồng độ sản phẩm tự phân đạt 100 mg 10 ml môi trường Bảng 5: Tác dụng kích thích sản phẩm tự phân nấm men đến việc sử dụng ethanol chủng A.suboxydans Yếu tố Khối lượng sản phẩm tự phân nấm men, mg 10 35 100 Sự diện 2% ethanol (E)(*) - 21 - Vi khuẩn Acetic + + + -E -E -E +E E E E Acetobacter suboxydans, chủng -E Độ đục Độ (**) 7 11 16 35 35 acid 95 -E 74 0 0 0 0 Acetobacter suboxydans, chủng MA 8.3 Độ đục 10 16 28 36 80 Độ acid 0 0 0 0 +E 19 4 19 2.4 Thảo luận: Khả phát triển môi trường chứa nitơ ammonium tính chất đặc trưng để nhận biết vi khuẩn acetic nhận danh số loài A.aceti, A.suboxydans A.lovaniense Việc chứng minh số chủng loài khác A.xylinum, A.rancens, A.suboxydans A.melanogenum kể loài khác giống Acetobacter không làm giảm giá trị việc phân loại vi khuẩn acetic Đối với giống phát sau này, yếu tố sinh trường nguồn carbon ethanol cần thiết để vi khuẩn sử dụng nguồn nitơ ammonium Ngoài ta thấy nhiều yếu tố cần bổ sung vào môi trường Hoyer, môi trường thường sử dụng để nghiên cứu việc sử dụng ammonia Tuy nhiên, điều quan trọng cần phải lưu ý liệu đạt thí nghiệm phản ánh tượng sinh lý chủng riêng biệt tranh toàn cảnh trình dinh dưỡng chủng Vì với thí nghiệm độc lập, ta hoàn toàn thu kết không giống Điều nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn acetic Vi khuẩn acetic cần nguồn nitơ khác sống canh trường khác 2.5 Kết luận: - 22 - Vi khuẩn Acetic Nghiên cứu chứng minh có nhiều loài vi khuẩn acetic có khả sử dụng nitơ ammonium để sinh trưởng khám phá trước Nhiều chủng loài A.suboxydans A.melanogenum có khả thể khả điều kiện sau thỏa mãn: môi trường chứa đầy đủ yếu tố sinh trưởng có nguồn carbon thích hợp Mặc dù nhu cầu yếu tố sinh trưởng thay đổi với chủng khác nhìn chung, hầu hết chủng thuộc loài A.suboxydans cần acid panthothenic, nicotinic paminobenzoic chủng thuộc loài A.melanogenum thích ba vitamin acid panthothenic, nicotinic thiamin Nguồn carbon thích hợp cho chủng bao gồm glucose, arabinose, mannitol, sorbitol glycerol ethanol, pyruvate lactate Để phát triển môi trường có ethanol, pyruvate lactate nitơ ammonium casein bị thủy phân chủng cần thêm yếu tố sinh trưởng chưa xác định có mặt dịch chiết nấm men, tryptone nguyên liệu sinh học khác Tất cacù chủng A.gluconicum A.rancens số chủng A suboxydans A.melanogenum cần yếu tố sinh trưởng chưa xác định có sản phẩm tự phân nấm men - 23 - Vi khuẩn Acetic III SINH LÝ VI KHUẨN ACETIC Vi khuẩn acetic acid có tính chất sinh lý độc đáo, có nhiều ứng dụng hữu ích Acetobacter aceti Acetobacter pasteurianus sử dụng ethanol oxy hóa ethanol thành acid acetic Điều ứng dụng sản xuất dấm từ rượu, nước malt lên men, rượu táo… A aceti oxy hóa ethanol cách sử dụng rượu dịch tế bào sản xuất enzym acetaldehyde dehydrogenase, lượng bị tiêu hao việc hình thành cofactor PQQH2 dạng khử Sau PQQH oxy hóa trở lại nhờ chytocrome loại c chuỗi hô hấp Việc chuyển electron tạo lực đẩy proton ATP tổng hợp nhờ enzym ATPase màng Oxi chất nhận electron cuối Khi ethanol còn, Acetobacter tiếp tục sản xuất acid acetic Khi ethanol cạn kiệt, enzym cần thiết cho chu trình TCA tổng hợp acid acetic oxy hóa triệt để đến CO H2O Vì lý này, giống Acetobacter đặt tên “over – oxidizing” acetic acid bacteria Khi sinh trưởng môi trường ethanol, Acetobacter cần nhiều phản ứng để tổng hợp phosphoenolpyruvate Nhiều giống theo oxy hóa chậm saccharide để tạo nguồn oxaloacetate, đặc biệt môi trường không chứa đủ chất cần thiết cho trình trao đổi chất Sau oxaloacetate đề cacboxyl hóa tới pyruvate nhờ enzym oxaloacetate decarboxylase pyruvate chuyển thành phosphoenolpyruvate nhờ enzym pyruvate phosphate dikinase Phosphoenol sử dụng tiền chất cung cấp cho sinh trưởng tế bào thông qua phản ứng tổng hợp glucose Gluconobacter oxydan oxy hóa ethanol thành acid acetic phát triển ethanol, ethanol không đóng vai trò nguồn cacbon lượng Những thành viên giống phát triển thích hợp glucose hay loại đường khác mà dị hóa qua chu trình pentose phosphate Việc dị hóa đường theo kiểu sản xuất ATP thông qua việc phosphoryl hóa chất - 24 - Vi khuẩn Acetic Năng lượng không đủ cung cấp cho phát triển yếm khí, thế, cofactor khử oxy hóa trở lại qua đường vận chuyển điện tử phosphoryl hóa Gluconobacter có đặc tính mà quan tâm lónh vực ứng dụng vi sinh vật Đó khả oxy hóa phần, chuyển rượu bậc hay bậc đến acid hay ketone Sự oxy hóa phần polyol xảy theo “Bertrand – Hudson rule” Lý thuyết cho polyol với kiểu xếp dạng cis các nhóm chứa gốc hydroxy bậc đồng phân D kế cận với nhóm rượu bậc oxy hóa đến ketose tương ứng phần lớn giống Gluconobacter Tính chất có ứng dụng qua trọng sản xuất như: chuyển D–sorbitol thành L– sorbose, chuyển glycerol thành dihydroxyacetone, … - 25 - Vi khuẩn Acetic IV MÔI TRƯỜNG Dưới số môi trường dinh dưỡng dành cho vi khuẩn acetic cung cấp hãng DSMZ, Đức (DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) [17] 4.1 Moâi trường MRS (Medium 11) a - Áp dụng: Gluconacetobacter intermedius (DSM 11804, 30oC) b Thành phần: Casein peptone, tiên hóa trypsine Chất chiết thịt Chất chiết nấm men Glucose Tween 80 K2HPO4 Na-acetate (NH4)2 citrate MgSO4 x H2O MnSO4 x H2O Nước cất 10.00 g 10.00 g 5.00 g 20.00 g 1.00 g 2.00 g 5.00 g 2.00 g 0.20 g 0.05 g 1000.00 ml Chỉnh pH 6.2 - 6.5 4.2 Môi trường Trypticase đậu nành chất chiết nấm men (Trypticase soy yeast extract medium, Medium 92) a - Áp dụng: Gluconobacter oxydans (DSM 46615, DSM 46616, 30oC) b Thành phần: Trypticase soy broth Chất chiết nấm men Agar Nước cất 30.0 g 3.0 15.0 g 1000.0 ml Chỉnh pH 7.0 – 7.2 - 26 - g Vi khuẩn Acetic 4.3 Môi trường Gluconobacter oxydans (Medium 105) a Áp dụng: - Gluconobacter oxydans (DSM 2003, 26oC); Gluconobacter oxydans (DSM 46615, DSM 46616, 30oC); Gluconobacter oxydans subsp suboxydans (DSM 50049, 28oC); - Gluconacetobacter sacchari (DSM 12717, 28oC); Gluconacetobacter xylinus (DSM 2004, DSM 2325, 26 oC); Gluconacetobacter xylinus (DSM 46604, DSM 46605, DSM 6513, 28oC); Gluconacetobacter diazotrophicus (DSM 5601, 28oC); Gluconacetobacter hansenii (DSM 5602, 28oC); Gluconacetobacter liquefaciens (DSM 5603, 28oC) - Acetobacter aceti (DSM 2002, 26oC); Acetobacter cerevisiae (DSM 14362, 28oC); Acetobacter estunensis (DSM 4493, 28oC); Acetobacter lovaniensis (DSM 4491, 28oC); Acetobacter malorum (DSM 14337, 28oC); Acetobacter orleanensis (DSM 4492, 28oC); Acetobacter pasteurianus (DSM 2324, DSM 2324, 26oC); Acetobacter pasteurianus (DSM 46617, DSM 46618, DSM 46619, 28oC); b Thành phần: Glucose Chất chiết nấm men CaCO3 Agar Nước caát 100.0 g 10.0 g 20.0 g 15.0 g 1000.0 ml Chỉnh pH 6.8 4.4 Môi trường Acetobacter peroxydans (Medium 254) a - Áp dụng: Acetobacter pasteurianus (DSM 2006, DSM 2347) (26oC) b Thành phần: Chất chiết malt Chất chiết nấm men Agar Nước cất 15.0 g 5.0 15.0 g 940.0 ml - 27 - g Vi khuaån Acetic Sau khử trùng, thêm 60ml ethanol (50% v/v) khử trùng lọc 4.5 Môi trường YPM (Medium 360) a Áp dụng: - Acetobacter aceti (DSM 3508, 26oC); Acetobacter estunensis (DSM 4493, 28oC); Acetobacter lovaniensis (DSM 4491, 28oC); Acetobacter orleanensis (DSM 4492, 28oC); Acetobacter o pasteurianus (DSM 3509, 26 C) - Gluconacetobacter hansenii (DSM Gluconacetobacter liquefaciens (DSM Gluconacetobacter xylinus (DSM 6513, 28oC) b Thành phần: Chất chiết nấm men Peptone Mannitol Agar Nước cất 5602, 5603, 5.0 3.0 g 25.0 g 12.0 g 1000.0 ml 28oC); 28oC); g Không chỉnh pH 4.6 Môi trường (Medium 569) a - Methylobacterium với Áp dụng: Acidomonas methanolica (DSM 5432, 30oC) b Thành phần: KNO3 MgSO4 x H2O CaCl2 x H2O Na2HPO4 NaH2PO4 FeSO4 x H2O CuSO4 x H2O H3BO3 MnSO4 x H2O ZnSO4 x H2O 1.00 0.20 0.02 0.23 0.07 1.00 5.00 10.00 10.00 70.00 - 28 - g g g g g mg µg µg µg µg methanol Vi khuẩn Acetic MoO3 Agar Nước cất 10.00 µg 12.00 g 1000.00 ml Cứ với 1l môi trường, chỉnh pH 4.0 – 5.4 thêm 10ml CH3OH 4.7 Môi trường Acetobacter europaeus (Medium 631) a - Áp dụng: Acetobacter europaeus (DSM 6160, DSM 6161, 30oC) b Thành phần: Chất chiết nấm men Peptone Glucose Acetic acid Ethanol Nước cất 2.0 3.0 g 5.0 g 40.0 ml 30.0 ml 930.0 ml g Ethanol vaø acid acetic khử trùng riêng cách lọc, cho vào môi trường vô trùng Acetobacter europaeus không phát triển đóa chứa 1-2% agar, phải dùng hệ thống thạch đóa lớp Một lớp môi trường sinh trưởng (growth medium) chứa 0.5% agar (khoảng 50ml) rót vào đóa đông lại Sau đó, lớp môi trường sinh trưởng mỏng (khoảng – 10ml) chứa 1% agar đổ lên phía Các đóa ủ hộp đựng kín (như hộp plastic) 30 oC 4.8 Môi trường RAE (Medium 848) a Áp dụng: - Gluconacetobacter oboediens (DSM 11826, 30oC); - Acetobacter pomorum (DSM 11825, 30oC) b Thành phần: Glucose Peptone Yeast extract Citric acid x H2O 40.00 g 10.00 g 10.00 g 1.50 g - 29 - Vi khuaån Acetic Na2HPO4 x H2O 3.38 Acid acetic baêng (Glacial acetic acid) 10.00 Ethanol nguyên chất (Absolute ethanol) Nước cất 980.00 g ml 10.00 ml ml Không chỉnh pH Cả môi trường lỏng rắn chuẩn bị cách hấp áp lực chưa cho acid acetic băng ethanol nguyên chất vào Acid acetic băng ethanol nguyên chất khử trùng cách lọc (dùng lọc Teflon) hấp autoclave chai thủy tinh có nắp vặn chặt hoàn toàn và hàn với vách Teflon Để chuẩn bị môi trường rắn, dùng hệ thạch kép tương tự mô tả môi trường Acetobacter europaeus (medium 631), với lớp 5.5% agar lớp 1% agar Ủ hộp đựng kín để giữ độ ẩm cao (90%) 4.9 Môi trường AE (Medium 849) a - Áp dụng: Gluconacetobacter intermedius (DSM 11804, 30oC) b Thành phần: Glucose 5.0 Chất chiết nấm men 3.0 Peptone 4.0 Ethanol nguyên chất (Absolute ethanol) Acid acetic băng (Glacial acetic acid) Agar 9.0 Nước cất 940.0 g g g 30.0 ml 30.0 ml g ml Cả môi trường lỏng rắn chuẩn bị cách hấp áp lực chưa cho acid acetic băng ethanol nguyên chất vào Acid acetic băng ethanol nguyên chất khử trùng cách lọc (dùng lọc Teflon) hấp autoclave chai thủy tinh có nắp vặn chặt hoàn toàn và hàn với vách Teflon Hệ thống thạch kép dường không cần thiết cho phát triển vi khuẩn này, nhiên, đóa thạch nên - 30 - Vi khuẩn Acetic ủ thùng chứa hàn kín để giữ độ ẩm cao (>90%) 4.10 Môi trường thay Acetobacter intermedius (Medium 850) a - Áp dụng: Gluconacetobacter intermedius (DSM 11804, 30oC) b Thành phần: Glucose Yeast extract Agar Nước cất 5.0 3.0 12.0 1000.0 g g g ml 4.11 Môi trường Acetic acid bacterium (Medium 989) a Áp dụng: - Acetobacter cibinongensis (DSM 15549, 30oC); Acetobacter indonesiensis (DSM 15552, 30oC); Acetobacter orientalis (DSM 15550, 30oC); Acetobacter syzygii (DSM 15548, 30oC); Acetobacter tropicalis (DSM 15551, 30oC) b Thành phần: Bacto peptone Chất chiết nấm men Glucose MgSO4 x H2O Nước cất Agar (nếu cần) 5.0 g 5.0 5.0 g 1.0 g 1000.0 ml 15.0 g pH 6.6 – 7.0 - 31 - g Vi khuaån Acetic V ỨNG DỤNG 5.1.Sản xuất dấm: Vi khuẩn acetic acid có khả oxy hóa rượu ethylic thành acid acetic: 2CH3 -CH2OH u khí) 2O2 (hiế CH3COOH + 2H2O Đây trình chuyển hóa sinh học gồm phản ứng với enzym vi khuẩn acetic xúc tác: Alcohol - dehydrogenase CH3-CH2OH (ethanol) CH3CHO + 2H2 (Acetaldehyd) Sau hydrat hóa acetaldehyd diễn phản ứng loại hydro thứ hai: OH aldehyd - dehydrogenase CH3 - CH CH3COOH + 2H OH (Acid acetic) (Acetaldehyd) 5.2.Sản xuất L-sorbose (nguyên liệu đầu để sản xuất vitamin C): D-sorbit chuyển hóa thành L-sorbose nhờ vi khuẩn Gluconobacter suboxydans với enzym xúc tác socbitdehydrogenase: Socbit - dehydrogenase D-socbit L-socbose Trong phản ứng 2H tách khỏi phân tử Dsocbit thành nhóm =C=O socbose D-socbit có nồng độ ban đầu 20% môi trường với có mặt cao nấm men cao ngô Quá trình chuyển hóa kéo dài – ngày bổ sung socbit lần để tổng nồng độ đạt tới 30% Hiệu suất chuyển hóa socbit thành socboza đạt tới 90% - 32 - Vi khuẩn Acetic 5.3.Sản xuất thức uống kombucha: Kombucha loại thức uống có ga, có hàm lượng cồn độ chua thấp, giúp tỉnh táo Được lên men nhờ loại nấm trà hỗn hợp cộng sinh giữ nhiều loại nấm men vi khuẩn acetic Dịch lên men chuẩn bị sau: trà đen tăng độ cách bổ sung sucrose với hàm lượng 70g/L + 10% thức uống kombucha để hạ pH Sau cấy vào lớp màng cellulose nấm trà từ lần lên men trước, lên men điều kiện hiếu khí Nấm men chuyển sucrose thành glucose fructose, tạo thành ethanol CO pH dịch lên men giảm suốt trình lên men hình thành acid acetic acid gluconic nhờ vi khuẩn A.xylinum Cuối trình lên men, A.xylinum tổng hợp màng cellulose mà tế bào nấm men vi khuẩn gắn chặt lên đó, lớp màng ngăn chặn tiếp xúc với oxy không khí - 33 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng - Công nghệ sản xuất Vi Sinh Vật – Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Robert S Breed, E.G.D Murray, Nathan R Smith – Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition – Baillierve, Tindall & Cox, LTD., London, 1957 Dr A Ehrenreich, Prof H Sahm, Prof H Gorisch – Sequencing and analysis of the genome of Gluconobacter oxydans and its application for regiospecific oxidation reations – Germany http://www.genomik.unigoettingen.de/projects/c_projects_III.html DSMZ - Bacterial Nomenclature Up-to-date – Braunschweig, Germany http://www.dsmz.de/ Douglas Krutil – Gluconobacter oxudans – 2000 http://web.umr.edu/~microbio/BIO221_2000/Gluconobacter_oxyda ns.html Duangtip Moonmangmee et al – Vinegar making from Thai traditional alcoholic beverage, Satoh – Thailand http://plantpro.doae.go.th/worldfermentedfood/P_2_Duangtip.pdf K Katsura et al – Asaia siamensis sp nov., an acetic acid bacterium in the alpha-Proteobacteria - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 51, 2001, p 559563 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/51/2/559 M R Raghavendra Rao and J L Stokes – Nutrition of the Acetic Acid Bacteria – Department of Bacteriology, Indiana University, Bloomington, Indiana, 1952 Puspita Lisdiyanti et al – Diversity of Acetic Acid Bacteria isolated from Southeast Asian sources – Thailand and Japan http://plantpro.doae.go.th/worldfermentedfood/O_1_Listdiyanti.pdf 10 Puspita Lisdiyanti et al – Kozakia baliensis gen nov, sp nov., a novel acetic acid bacterium in the alpha-Proteobacteria - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 52, 2002, p 813-818 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/52/3/813 11 Pattaraporn Yukphan , Yuzo Yamada et al – Asaia krungthepensis sp nov, an acetic acid bacterium in the Proteobacteria - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 54, 2004, p 313-316 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/54/2/313 12 Shumichi Yamashita, Tai Uchimura and Kazuo Komagata – Emendation of the genus Acidomonas Urakami, Tamaoka, Suzuki and Komagata 1989 - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 54, 2004, p 865-870 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/54/3/865 13 Swiss Federal Institute of Technology Zurich - Physiology of Acetic acid bacteria http://www.rereth.ethz.ch/agrl/lebensmittel/teuber/pj.06.html 14 W.J du Toit, I.S Pretorius – The occurrence and control of acetic acid bacteria in winemaking – South Africa http://www.newworldwinemaker.com/article_content.asp?id=54 15 Yuzo Yamada et al – Asaia bogorensis gen nov sp nov., an unusual acetic acid bacterium in the alpha-Proteobacteria – International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 50, 2000, p 823-829 http://ijs.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/50/2/823 16 Yuzo Yamada – Taxonomy of Acetic Acid Bacteria utilized for Vinagar fermentation – Thailand http://plantpro.doae.go.th/worldfermentedfood/I_8_Yamada.pdf 17 Caùc website khaùc: - http://www.bacterio.cict.fr/allnamestwo.html - http://www.dsmz.de/ - http://www.ilw.agrl.ethz.ch/ - http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/2517 ... nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn acetic Vi khuẩn acetic cần nguồn nitơ khác sống canh trường khác 2.5 Kết luận: - 22 - Vi khuẩn Acetic Nghiên cứu chứng minh có nhiều loài vi khuẩn acetic có khả sử dụng... p-aminobenzoic không cần thiết cho chủng vi khuẩn có diện vitamin lại, vài trường hợp kích thích phát triển vi khuẩn acetic vitamin nhóm B lại: thiamin, riboflavin, pyridoxin, B12, pteroylglutamic,... B12, pteroylglutamic, biotin inositol có ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn acetic Bảng 2: Nhu cầu vitamin vi khuẩn acetic Chủng vi khuẩn A.suboxydans, chủng MA 8.1 A.suboxydans, chuûng MA 8.3 A.suboxydans,