xây dựng một mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu lipid

Ngày nay bệnh tim mạch có nguồn gốc mạch vành ngày càng trở nên phổ biến trên thế giới. Nguyên nhân chính là do sự gia tăng bất thường của lipid máu, do nhiều yếu tố nguy cơ như di truyền, tiểu đường , hoặc do sự gia tăng của bệnh béo phì, …. trong số đó chế độ dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc gia tăng lipid máu. Tại Việt Nam, tần suất của bệnh này có khuynh hướng gia tăng nhanh chóng cùng với sự đa dạng trong thức ăn hàng ngày. Việc cần thiếtlà phải đưa mức cholesterol và triglycerid trở về bình thường. Do đó, nhu cầu hiện tại là phải tiến hành những nghiên cứu để tìm ra những phương thuốc mới có hiệu quả trong lĩnh vực điều trị bệnh này cũng như cần có những mô hình thực nghiệm liên quan đến tăng lipid huyết. Trong những nghiên cứu trước đây được thực hiện tại khoa Dược Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi đã sử dụng chất tẩy rửa Triton 1339Tyloxapol để gây tăng lipid huyết trên chuột. Mô hình này rất có hiệu quả trong vòng 24 giờ sau khi tiêm Tyloxapol. Tuy nhiên, 48 giờ sau khi tiêm nồng độ cholesterol và triglycerid giảm đáng kể. Do đó, việc tăng lipid huyết gây bởi Tyloxapol chỉ thích hợp trong trường hợp chọn lọc sớm những hoạt chất hoặc những thuốc có tác dụng hạ lipid huyết (screening). Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng một mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu lipid để tạo ra một tình trạng bệnh lý kéo dài hơn, ổn định hơn trên chuột. Nghiên cứu này được tiến hành tại Bộ môn Dược lýDược lâm sàng – Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm những mục tiêu chuyên biệt sau đây: Gây tăng lipid huyết bằng chế độ ăn giàu lipid trên chuột Đánh giá tính khả dụng của mô hình thử nghiệm với việc sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết (Simvastatin)

LỜI MỞ ĐẦU LỜI MỞ ĐẦU Ngày bệnh tim mạch có nguồn gốc mạch vành ngày trở nên phổ biến giới Nguyên nhân gia tăng bất thường lipid máu, nhiều yếu tố nguy di truyền, tiểu đường , gia tăng bệnh béo phì, … số chế độ dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng việc gia tăng lipid máu Tại Việt Nam, tần suất bệnh có khuynh hướng gia tăng nhanh chóng với đa dạng thức ăn hàng ngày Việc cần thiết phải đưa mức cholesterol triglycerid trở bình thường Do đó, nhu cầu phải tiến hành nghiên cứu để tìm phương thuốc có hiệu lónh vực điều trò bệnh cần có mô hình thực nghiệm liên quan đến tăng lipid huyết Trong nghiên cứu trước thực khoa Dược- Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, sử dụng chất tẩy rửa Triton 1339-Tyloxapol để gây tăng lipid huyết chuột Mô hình có hiệu vòng 24 sau tiêm Tyloxapol Tuy nhiên, 48 sau tiêm nồng độ cholesterol triglycerid giảm đáng kể Do đó, việc tăng lipid huyết gây Tyloxapol thích hợp trường hợp chọn lọc sớm hoạt chất thuốc có tác dụng hạ lipid huyết (screening) Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu xây dựng mô hình tăng lipid huyết thực nghiệm chế độ ăn giàu lipid để tạo tình trạng bệnh lý kéo dài hơn, ổn đònh chuột LỜI MỞ ĐẦU Nghiên cứu tiến hành Bộ môn Dược lýDược lâm sàng – Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm mục tiêu chuyên biệt sau : - Gây tăng lipid huyết chế độ ăn giàu lipid chuột - Đánh giá tính khả dụng mô hình thử nghiệm với việc sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết (Simvastatin) KẾT QUẢ 4.1 THĂM DÒ MÔ HÌNH GÂY TĂNG LIPID HUYẾT BẰNG CHẾ ĐỘ ĂN GIÀU LIPID  Giai đoạn : Chuột thử nghiệm chia làm nhóm : ∗ Nhóm chứng : nuôi theo chế độ ăn bình thường ∗ Nhóm tăng lipid huyết : nuôi chế độ ăn đặc biệt giàu lipid Sau 2, tuần, chuột thử nghiệm lấy máu để xác đònh nồng độ cholesterol nồng độ triglycerid huyết tương Nồng độ cholesterol triglycerid huyết chuột thử nghiệm nhóm thể bảng sau : Bảng Nồng độ cholesterol máu nhóm thử nghiệm sau 2,3 tuần theo chế độ ăn LỜI MỞ ĐẦU Nhóm n Cholesterol huyết (mg%) m±SEM tuần tuần tuần Chứng 10 Thử 20 n: số lượng chuột nhóm 88.77 ± 10.01 143.94 ± 27.18 101.78 ± 4.27 148.74 ± 11.20 92.14 ± 3.23 131.68 ± 8.03 Bảng Nồng độ triglycerid máu nhóm thử nghiệm sau 2,3 tuần theo chế độ ăn Nhóm n Triglycerid huyết (mg%) m±SEM tuaàn tuaàn tuaàn 70.90 ±11.75 76.93±6.14 34.23 ± 8.26 66.17±22.84 Chứng 10 Thử 20 n: số lượng chuột nhóm 111.08 ± 20.14 85.14±6.73 Sau tuần theo chế độ ăn giàu lipid, nồng độ cholesterol huyết nhóm thử bắt đầu tăng không khác biệt so với nhóm chứng Ở tuần lễ thứ 3, khác biệt có ý nghóa rõ rệt Việc trì chế độ ăn tuần sau không làm thay đổi đáng kể nồng độ cholesterol máu nhóm Số lượng chuột tăng lipid huyết vào tuần lễ thứ chế độ ăn vào khoảng 60 %, tỷ lệ không thay đổi vào tuần lễ thứ nghiên cứu  Giai đoạn 2: Mục tiêu để đánh giá tính ổn đònh mô hình sau ngưng chế độ ăn giàu lipid Những chuột thử nghiệm tăng nồng độ cholesterol huyết vào tuần lễ thứ chọn chia thành nhóm sau : Nhóm : Quay trở lại chế độ ăn bình thường Nhóm : Duy trì chế độ ăn giàu lipid Xác đònh nồng độ cholesterol triglycerid sau tuần Bảng Nồng độ lipid máu nhóm thử nghiệm LỜI MỞ ĐẦU Nhóm Nhóm Nhóm tuaàn Chol TG 159.49 ± 75.9 ± 6.47 17.21 160.09± 54.93 ± 22.09 9.57 tuaàn Chol 203.72 ± 37.27 179.67 ± 39.01 TG 123.1 ± 73.145 72.35± 11.48 Chol : Cholesterol huyết, TG : Triglycerid huyết Trong nhóm chuột trì chế độ ăn giàu lipid (nhóm 2), nồng độ cholesterol huyết mức cao, mức cholesterol huyết tăng cao nhóm không thay đổi sau tuần ngưng chế độ ăn giàu lipid Những kết cho thấy tính ổn đònh mô hình Từ kết thu được, đònh tiến hành giai đoạn đánh giá tính khả dụng mô hình theo tiến trình sau : - Gây tăng lipid huyết - Chọn dân số thử nghiệm vào tuần lễ thứ dựa theo tiêu chuẩn lựa chọn đề cập (mức cholesterol > 150 mg%) - Sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết để đánh giá tính khả dụng mô hình 3.2.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM BẰNG CÁCH ÁP DỤNG TÁC NHÂN LÀM HẠ LIPID HUYẾT Trọng lượng Trọng lượng chuột xấp xỉ nhóm chứng nhóm thử Trong thời gian thử nghiệm, trọng lượng chuột gia tăng tự nhiên không phụ thuộc vào chế độ ăn giàu lipid không phụ thuộc vào việc điều trò với Simvastatin LỜI MỞ ĐẦU Cholesterol et triglycerid huyết Bảng 10 Nồng độ lipid máu sau tuần theo chế độ ăn giàu lipid Nhóm Chứng Thử Ngày Chol TG 68.07 ± 78.47 ± 13.26 10.44 125.78± 148.06± 28 12.1 96 tuaàn Chol 94.7 ± 14.88 176.7± 7.3 TG 151.75 ± 19.01 101.35± 14.88 Nhận xét :Sau tuần theo chế độ ăn giàu lipid, ghi nhận khác biệt có ý nghóa (p < 0.05) nồng độ cholesterol huyết nhóm thử so với nhóm chứng khác biệt nồng độ triglycerid huyết Hình Nồng độ cholesterol huyết sau tuần theo chế độ ăn giàu lipid LỜI MỞ ĐẦU 250 * 200 150 Chứng [C] mg% Thử 100 50 0 Tuần (∗) P 150 mg% vào tuần lễ thứ - Sử dụng tác nhân làm hạ lipid huyết để đánh giá tính khả dụng mơ hình 3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA MƠ HÌNH THỬ NGHIỆM BẰNG CÁCH ÁP DỤNG TÁC NHÂN LÀM HẠ LIPID HUYẾT Những chuột đáp ứng yêu cầu thử nghiệm sau tuần gây tăng lipid huyết chia thành nhóm sau : − Nhóm chứng (không điều trị): nước cất (0.1 ml /10 g chuột) − Nhóm 1: simvastatin liều 8mg/kg × lần/ngày − Nhóm 2: simvastatin liều 16mg/kg × lần/ngày  Cholesterol triglycerids: Kết trình bày bảng Bảng Nồng độ cholesterol huyết nhóm chuột thử nghiệm Tuần Chứng Sim Sim Sim 125.78±12.1 125.78±12.1 125.78±12.1 125.78±12.1 167.76 ± 6.1 205.54±11.47 176.65±17.29 206.87±17.77 145.46±16.32 152.19±13.98 145.17±16.04 165.4±16.85 175.8±22.83 177.9±18.95 203.57±28.05 203.8±20.17 232.96±23.1 145.37±16.37 145.57±28.48 134.66±18.38 Bảng Nồng độ triglycerid huyết nhóm chuột thử nghiệm Tuần Chứng 148.06±28.96 114.9±16.48 53.46±3.84 57.13±6.7 121.46±33.55 Sim 148.06±28.96 90.47±11.06 60.71±6.07 57.86±4.45 67.89±9.24 Sim 148.06±28.96 59.28±9.27 39.08±8.94 50.68±12.13 76.35±9.57 Sim 148.06±28.96 84.69±13 60.07±6.7 55.06±4.43 83.34±14.86 Chứng: PO nước cất ; Sim 1: PO simvastatin liều mg/kg ; Sim : PO simvastatin liều 16 mg/kg ; Sim 3: PO simvastatin liều 16 mg/kg → 40 mg/kg Nồng độ cholesterol huyết sau tuần điều trị bắt đầu giảm so với nhóm chứng chưa có khác biệt thống kê hai nhóm điều trị Tuy nhiên giá trị lại tăng nhanh vào tuần lễ thứ đợt điều trị Hiện tượng chế bù sinh lý, thông qua việc tăng số lượng LDL-receptor tác động hạ lipid huyết thuốc Ở tuần thứ 3, nồng độ cholesterol cao khơng khác so với thời điểm ban đầu chưa điều trị Điều thời gian điều trị chưa đủ để hiệu thuốc thể rõ nên cần có thời gian điều trị dài với liều (8 mg/kg 16 mg/kg) 19 LỜI MỞ ĐẦU Do đó, chúng tơi chia nhóm thứ thành nhóm nhỏ nhóm tiếp tục điều trị với liều 16 mg/kg nhóm lại tăng liều lên đến 40 mg/kg Tiến hành định lượng nồng độ cholesterol triglycerids sau tuần điều trị Kết định lượng cho thấy, nồng độ cholesterol huyết gần giảm xuống mức bình thường sau tuần điều trị với simvastatin liều 40 mg/kg Như vậy, liều dường hiệu liều 16 mg/kg Xét nồng độ triglycerids, sau tuần điều trị simvastatine cho thấy nồng độ triglycerids dao động cách tự nhiên không phụ thuộc vào chế độ ăn giàu lipid không phụ thuộc vào chế độ trị liệu simvastatin Tuy nhiên, nồng độ triglycerid huyết nhóm chứng nhóm thử khơng khác có ý nghĩa Như vậy, mơ hình gây tăng lipid huyết chế độ ăn giàu lipid làm tăng nồng độ cholesterol huyết tương lại không ảnh hưởng đến nồng độ triglycerides Kết phù hợp với nghiên cứu trướnc mô hình gây tăng lipid chế độ ăn  Lipoprotein Ngồi phân tích cholesterol triglycerid, chúng tơi tiến hành phân tích thay đổi thành phần lipiproteins, bao gồm HDL LDL Hình 10 Biểu đồ nồng độ LDL-C huyết 250 200 150 [C] mg% * * 100 50 Chứng Sim Sim Sim 3 Tuần (*) p < 0.05 Nồng độ LDL-C nhóm điều trị giảm đáng kể so với nhóm khơng điều trị (P 180 U/L ∗ Dung dòch chuẩn: Dung dòch cholesterol chuẩn 200mg% 2g/l 5,17 mmol/l - Mẫu thử − Huyết tương chuột - Tiến hành Mật độ quang : 500nm Nhiệt độ : 57 °C Cống đo: cm Đọc đối chiếu với mẫu trắng Thuốc thử Trắng ml Chuẩn ml Thử ml Nước cất 10µl - - - 10µl - Dung dòch chuẩn 200 mg% Huyết tương chuột 10µl Trộn đều, ủ phút Đọc mật độ quang (OD) Màu cuối ổn đònh - Calculs Nồng độ cholesterol = OD(Thử ) ×n OD(Chuẩn ) n: nồng độ dung dòch chuẩn ∗ Đònh lượng triglycerid - Nguyên tắc Triglycerid đònh lượng phản ứng với enzym sau: Lipoprotei nlipase glycerol + acid béo Triglycerid + H2O   → 25 LỜI MỞ ĐẦU Glycerosek inase Glycerol + ATP      → glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate glyceùrol -3- phosphate oxidase → + O2             H2O2 + DAP peùroxidas e 2H2O2 + 4-APP + p-chlorophenol    → Red quinone + 4H2O DAP: Dihydroxy aceton phosphat 4-APP: 4-aminoantipyrin - Thuốc thử Dung dòch đệm pipes 50 mmol/L (pH= 6,9) p-chlorophenol 2.7 Lipoprotein lipase mmol/L ≥ 2000 Glycerokinase U/L > 5000 Glycero-3-phosphate U/L > 4000 oxydase Peroxidase 4-aminoantipyrine U/L > 500 U/L 0.31 ATP mmol/L 3.15 Mg mmol/L 14.8 2+ mmol/L Potassium ferrocyanate 10 μmol/L ∗ Dung dòch chuẩn : dung dòch chuẩn glycerol oleine 200 mg% (2g/l 2,28 mmol/l) - Mẫu thử - Huyết tương chuột 26 LỜI MỞ ĐẦU - Tiến hành Bước sóng: 500 nm Nhiệt độ: 37 °C Cống đo: cm Đọc đối chiếu với mẫu trắng Thuốc thử Trắng ml Chuẩn ml Thử ml Nước cất 10µl - - Dung dòch chuẩn 200 mg% - 10µl - Huyết tương chuột Trộn đều, ủ phút Đọc mật độ quang (OD) 10µl - Tính toán Nồng độ triglycerid = OD(thử ) ×n OD(Chuẩn ) g/l n: nồng độ dung dòch chuẩn n=2 mg/l n=200 Mmol/l n= 2,28 ∗ Đònh lượng HDL -Nguyên tắc Chylomicrons, VLDL LDL huyết tương kết tủa thuốc thử polyanionic Sau ly tâm, HDL hòa tan phần dòch đònh lượng phương pháp so màu cách sử dụng thuốc thử đònh lượng cholesterol Sự phức tạp phương pháp bao gồm việc sử sụng thoi vô sắc đặc biệt nhạy cảm để làm giảm tối thiểu lượng mẫu thử, đó, làm giảm tối thiểu tương tác hóa chất thành phần - Thuốc thử 27 LỜI MỞ ĐẦU ∗ Thuốc thử A (Thuốc thử tạo tủa) Bột 4x50 ml Dung dòch ñeäm phosphat (pH=7) 4-aminoantipyrine 90 mmol/l 0,40 mmol/l Cholat 3.5 mmol/l Dichlorophenolsulfonate 10 mmpl/l POD ≥ 3000 UI/L CHE ≥ 250 UI/L CHOD ≥ 450 UI/L Chất diện hoạt chất bảo quản ∗ Dung dòch chuẩn: Dung dòch chuẩn HDL 64 mg% - Mẫu thử − Huyết tương chuột - Tiến hành  Chuẩn bò Thuốc thử A : 0,1 ml Huyết tương : 0,1 ml Trộn cách đảo ngược, ly tâm 3000 vòng phút Khuấy mạnh để kết tủa tiếp xúc với phần 15 phút ảnh hưởng đến kết  Đònh lượng (tương tự đònh lượng cholesterol) Mật độ quang: 500nm Nhiệt độ:37 °c Cống đo : cm Đọc đối chiếu với mẫu trắng 28 LỜI MỞ ĐẦU Thuốc thử cholesterol Nước cất Dung dòch HDL chuẩn 64 mg% Trắng ml Chuẩn ml Thử ml 10µl - - - 10µl - Phần dòch 10µl Trộn đều, ủ phút Đọc mật độ quang (OD) Màu cuối ổn đònh - Calculs Nồng độ HDL-C = OD(Thử ) ×n OD(Chuẩn ) n: nồng độ dung dòch chuẩn ∗ Tính toán nồng độ LDL-C VLDL-C LDL-C= Cholesterol toàn phần – (Triglycéride/5 + HDL-C) LDL-C= Cholesterol toàn phần– (VLDL-C + HDLC) 3.2.3 PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ NHỮNG KẾT QUẢ NHẬN ĐƯC Kết nhận được đánh giá Student test (twotail) trình bày dạng “ Trung bình ± SEM” Sự khác biệt với P < 0.05 xác đònh có yù nghóa 29 ... MƠ HÌNH GÂY TĂNG LIPID HUYẾT BẰNG CHẾ ĐỘ ĂN GIÀU LIPID Chuột thử nghiệm chia làm nhóm : ∗ Nhóm chứng : ni theo chế độ ăn bình thường ∗ Nhóm tăng lipid huyết : nuôi chế độ ăn đặc biệt giàu lipid. .. đònh mô hình sau ngưng chế độ ăn giàu lipid Những chuột thử nghiệm có nồng độ lipid huyết tăng cao chọn chia thành nhóm sau đây: Nhóm 1: quay trở lại chế độ ăn thường Nhóm 2: trì chế độ ăn giàu lipid. .. chia thành nhóm : nhóm chứng nhóm tăng lipid huyết với chế độ ăn bình thường chế độ ăn tăng lipid huyết theo nói Sau tuần trì chế độ ăn giàu lipid, chuột có nồng độ choleterol cao 150 mg% chọn chia