Ứng dụng kỹ thuật realtime RT PCR trong giảm sát dịch cúm AH1N1 tại một số đơn vị quân đội phía bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH TÂM NGUYỄN THỊ THANH TÂM ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT HÓA SINH SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2012 HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH TÂM ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 607325 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thu Hà TS Nguyễn Văn Rƣ HÀ NỘI - 2012 LỜI CẢM ƠN Với ng k nh trọng v iết n s u s c t i xin ph p c g i ời c n ch n th nh tới: TS Lê Thu Hà – Chủ nhiệm Khoa Vi sinh Y học, Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội người thầy hướng dẫn trực tiếp dìu d t v giúp ỡ t i suốt trình ề t i TS Nguyễn Văn Rƣ – Trƣởng Bộ mơn Hóa Sinh, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội người ã hết ng giúp ỡ t i trình học tập v ho n th nh uận văn n y T i xin c n anh chị ang c ng tác Khoa Vi sinh Y học – Vi n v sinh Ph ng dịch Qu n ội Khoa Sinh học Ph n t B nh vi n Trung ng Qu n ội 108 nh ng người u n tận tình gi i áp nh ng th c hết cv ng giúp ỡ t i trình thực hi n ề t i T i xin g i ời c n tới an ãnh ạo Trường Đại học Dư c H Nội v thầy c giáo trực tiếp tha gia gi ng dạy v giúp ỡ e suốt trình học tập trường V cuối t i xin y tỏ ng iết n ối với người th n nh ng người u n sát cánh t i chia s ạn è ộng vi n giúp t i ho n th nh kh a học v uận văn tốt nghi p Đề t i c thực hi n ph ng Vi sinh Y học ph n t Vi n V sinh ph ng dịch Qu n ội v Khoa Sinh học ph n t B nh vi n 108 H Nội ng y 14 tháng 11 nă Học vi n Nguyễn Thị Thanh T 2012 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình dịch nh cú A 1.1.1 Tình hình nhiễ cú A/H1N1 tr n giới 1.1.2 Tình hình nhiễ cú A/H1N1 Vi t Na 1.1.3 Đặc iể 1.2 Đặc iể s ng nh cú A/H1N1 virus cúm A 1.2.1 Ph n oại Virus cú 1.2.2 Cấu trúc virus cú 1.3 Kh g y nh v c chế x 1.3.1 Kh g y 1.3.2 C chế x A nhiễ 12 nh 12 nhiễ 13 1.4 Các phư ng thức iến ổi kháng nguy n 14 1.4.1 Hi n tư ng « ch kháng nguy n» 14 1.4.2 Hi n tư ng «trộn kháng nguy n» 15 1.4.3 Hi n tư ng g ycosy hoá 16 1.5 Các kỹ thuật s dụng nghi n cứu virus cú 1.5.1 Kỹ thuật rRT-PCR phát hi n cú A/H1N1 từ A/H1N1 17 nh phẩ nh y họng 17 1.5.2 Kỹ thuật gi i trình tự gen 20 1.5.3 Một số phư ng pháp tạo c y chủng oại phát sinh (Phy ogenetic tree) 21 1.6 Một số nghi n cứu i n quan virus cú A/H1N1 ã thực hi n 22 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tư ng nghi n cứu 24 2.2 Nguyên vật i u 25 2.2.1 Sinh phẩ 25 2.2.2 Trang thiết ị 25 2.2.3 Vật tư ti u hao 25 2.3 Thiết kế nghi n cứu 26 2.4 Ứng dụng rRT-PCR phát hi n cúm A/H1N1 26 2.4.1 Qui trình x nh phẩ 26 2.4.2 Quy trình tách chiết ARN tổng số 27 2.4.3 Phư ng pháp rRT-PCR 28 2.4.4 Phư ng pháp i n di kiể tra v tinh s n phẩ rRT-PCR 29 2.5 Các ước tiến h nh gi i trình tự 31 2.5.1 Real time PCR cho Sequencing 32 2.5.2 Tinh ại s n phẩ 2.5.3 Gi i trình tự tr n 2.6 Phư ng pháp x PCR cho Sequencing 32 áy Sequencing CEQ 8800 33 ý số i u 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Kết qu giá sát dịch tễ cú A/H1N1 ột số n vị qu n ội ph a B c 35 3.1.1 Đặc iể tình hình dịch tễ n vị qu n ội giai oạn tháng 8-12/2009 35 3.1.2 Kết qu giá sát diễn iến dịch cú 3.1.3 Kết qu x t nghi cú A ột số 3.1.4 Kết qu x t nghi cú A/H1N1 n vị qu n ội 36 n vị qu n ội ph a B c 37 ột số n vị qu n ội ph a B c 38 3.1.5 Tỉ nhiễ virus cú A/H1N1 n vị qu n ội nă 2009 40 3.1.6 Ph n ố tỉ nhiễ virus cú A/H1N1 theo tháng nă 2009 – 2010 40 3.2 Kết qu thu nhận Rea ti e –PCR Gi i trình tự xác ịnh gen H1 42 3.2.1 Kết qu thực hi n rRT-PCR 42 3.2.2 Kết qu gi i trình tự v thu nhận chuỗi gen 44 3.3 Phân tích so sánh trình tự gen ã h a kháng nguy n H ẫu gi i trình tự 47 3.3.1 Truy cập ng n h ng gen v ựa chọn chủng virus cú A/H1N1 so sánh ph n t ch với chủng thu thập 47 3.3.2 Kết qu ph n t ch sai khác nuc eotid chủng so sánh 52 3.2.3 Kết qu so sánh ph n t ch trình tự th nh phần acid a in oạn gen H1 ẫu nghi n cứu với chủng quốc tế c ựa chọn so sánh 56 3.3 Kết qu ph n t ch xác ịnh quan h ph h ẫu virus cúm A/H1N1 thu c với chủng tr n giới dựa gen H1 58 Chƣơng BÀN LUẬN 65 4.1 Kết qu giá vực sát dịch nh cúm A/H1N1 n vị qu n ội khu iền B c từ 2009-2011 65 4.2 Kết qu kh o sát ặc iể n vị qu n ội khu vực sinh học ph n t virus cú A/H1N1 iền B c từ 2009-2011 68 KẾT LUẬN 71 ĐỀ XUẤT 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AI Avian Influenza - Cú gia cầ BLAST Basic Local Alignment Search Tool - C ng cụ tì kiế tư ng ồng Bp Base pair - Cặp ase CDC Centers for Disease Control and prevention- Trung t soát v ph ng chống nh tật cDNA Complementary DNA dNTPs Deoxy ribonucleotide triphosphates DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra acetace Acid Et-Br Ethidium Bromide HA Hemagglutinin Kb Kilo base M1,2 Matrix 1,2 protein NCBI National Centre for Biotechnology Information NA Neuraminidase NP Nucleoprotein PA Polymerase acidic protein PB1 Polymerase basic protein PB2 Polymerase basic protein PCR Polymerase Chain Reaction - Ph n ứng khuếch ại chuỗi RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase PCR - Ph n ứng ch p ngư c v/p Vòng /phút VSDT TW Vi n V sinh dịch tễ trung ng WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế Thế giới kiể DANH MỤC BẢNG B ng 1.1 Các nh RNA v chức virus cú B ng 2.1 Th nh phần v nồng ộ chất tha A 11 gia ph n ứng 29 B ng 2.2 Chu kì nhi t ph n ứng 29 B ng 3.1 Đặc iể dịch tễ n vị c nhiễ B ng 3.2 Diễn iến tình hình dịch cú B ng 3.3 Kết qu x t nghi nă cú cú vụ dịch 35 trước v sau c ng ố dịch 36 A ằng kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Probe 2009 37 B ng 3.4 Kết qu x t nghi cú A/H1N1 kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Pro e nă B ng 3.5 Ph n ố tỉ ột số n vị qu n ội ằng 2009 39 nhiễ virus cú A/H1N1 theo tháng nă 41 B ng 3.6 Danh sách chủng virus cú A/H1N1 Vi t Na v giới s dụng gen H1 ph n t ch so sánh th nh phần gen v ối quan h nguồn gốc ph h 49 B ng 3.7 Các vị tr nuc eotid sai khác gen H1 gi a chủng so sánh 55 B ng 3.8 Các vị tr acid a in sai khác trình tự protein H1 oạn gen nghi n cứu với nh chủng virus A/H1N1 so sánh 58 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc kh ng gian virus cú A Hình 1.2 Cấu trúc virus cú A [27] 10 Hình 1.3 C chế x nhiễ virus cú A/H1N1 v o tế o vật chủ 14 Hình 2.1 Thiết kế nghi n cứu dịch tễ học ph n t virus cú A/H1N1 26 Hình 2.2 Qui trình tinh DNA 30 Hình 3.1 Tỷ nhiễ cú A n vị qu n ội 38 Hình 3.2 X t nghi dư ng t nh với cú A/H1N1 n vị qu n ội 39 Hình 3.3 Tỷ nhiễ cú A/H1N1 n vị qu n ội 40 Hình 3.4 Ph n ố tỷ nhiễ virus cú A/H1N1 theo tháng 41 Hình 3.5 Đi n di s n phẩ rRT-PCR virus cú A/H1N1 tr n thạch agarose 1% 43 Hình 3.6 Gi n Chro atogra ột phần trình tự gen virus cúm A/H1N1 45 Hình 3.7 Một phần trình tự gen ã h a kháng nguy n H virus A/H1N1(hai ẫu số v số 7) 46 Hình 3.8 Kết qu BLAST oạn gen gi i trình tự n NCBI ( ẫu số4) 48 Hình 3.9 Kết qu so sánh th nh phần nuc eotid gen H1 chủng nghi n cứu với iến chủng A/H1N1 c ựa chọn so sánh 53 Hình 3.10 Kết qu so sánh th nh phần acid a in gen H1 chủng nghi n cứu với iến chủng A/H1N1 c ựa chọn so sánh 57 Hình 3.11 Mối quan h nguồn gốc ph h gi a chủng cú A/H1N1 xác ập dựa tr n th nh phần nuc eotid gen H1 ằng chư ng trình MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining, với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 ootstrap) 61 Hình 3.12 Mối quan h nguồn gốc ph h gi a chủng cú A/H1N1 xác ập dựa tr n th nh phần acid a in gen H1 ằng chư ng trình MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining, với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 bootstrap) 63 ĐẶT VẤN ĐỀ Đầu nă 2009 tr n to n cầu xuất hi n ột chủng virus cúm A/H1N1 ới với ầy ủ t nh chất ể c thể g y th nh ại dịch Ng y 11/06/2009 ần ầu ti n sau 41 nă dịch cú Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ã ch nh thức c ng ố ại ầu ti n kỷ XXI với t n gọi cú A/H1N1/09 ại dịch Sáu tuần sau dịch ã an rộng 168 nước v vùng ãnh thổ c ch u ục với kho ng 162.380 ca nh v 1153 ca t vong [3], [48] Ng y 31/05/2009 với vi c ghi nhận ca nh cú ầu ti n th nh phố Hồ Ch Minh Vi t Na ã trở th nh quốc gia thứ 54 tr n to n cầu th ng áo xuất hi n dịch cú A/H1N1/09 ầu ti n khu vực ại dịch A/H1N1/09 ại dịch ới n y Ca nh cú iền B c khởi phát ng y 08/06/2009 Đại dịch ã nhanh ch ng an tỉnh th nh phố [3] [48] Cho ến theo ánh giá H thống giá sát cú to n cầu Tổ chức Y tế giới kĩ thuật Real time Reverse transcription-PCR (rRT-PCR) c xe ti u chuẩn v ng cho phát hi n nhờ ộ nhạy v ức ộ ph n t học virus cú ộ ặc hi u cao ph n ứng Hi n ột số ph ng th nghi tuyến trung ng ã triển khai kĩ thuật rRT-PCR phát hi n c su type cú thiết ị hi n ại người c trình ộ chuy n Tuy nhi n y y u cầu trang n cao v giá th nh c n kĩ thuật c ựa chọn s dụng rộng rãi cho c t ục ch chẩn ốn nghi n cứu phư ng pháp rRT-PCR cho kết qu nhanh sớ ch nh xác giúp cho nh qu n ý xác ịnh sớ c tác nh n g y dịch khoanh vùng dịch v sớ ựa chọn nh ng i n pháp ph ng hi u qu Trong ặc i t trường n vị qu n ội n vị huấn uy n v o tạo iều ki n sống v sinh hoạt tập trung ột thời iể n n dễ dẫn tới tình trạng nhiễ nh ng úc nhiều người nh truyền nhiễ H1 (sai khác nucleotid acid a in v nguồn gốc ph h ) tr n iến chủng virus A/H1N1 ph n ập Vi t Na ổi 2009 chưa tạo c iến ang t nh chất ― ch kháng nguy n‖ hay ―trộn kháng nguy n‖ n i cách khác chưa c ột iến trội e doa tạo n n d ng virus A/H1N1 ới Sự ồng nucleotid v acid a in chủng virus A/H1N1 xe x t ối quan h gần gũi nguồn gốc ph h cho thấy chủng nghi n cứu c nguồn gốc tiến h a khác c chủng Nhật B n c nh ng chủng từ Ấn ộ ại c nguồn gốc xa từ Singapore Điều n y t nguồn từ chủng ều c sở cho vi c ựa chọn chủng virus phù h p chiến c s n xuất vaccin Tuy nhi n cần ph i c nghi n cứu giá nguy n v c h gen (HA NA PA M2 ) A/H1N1 Vi t Na iến o hộ sát chặt chẽ gen kháng vụ dịch iến chủng virus cú ới c thể ánh giá ch nh xác ột iễn dịch th ng qua ph n t ch gen nhằ ựa chọn chủng virus ể s n xuất vaccin Hoàn toàn giống ặc iể virus cú A tiến h a th ng qua thay ổi cấu trúc ph n t c iểu hi n ằng tiến h a kháng nguy n thay ổi ặc t nh kháng nguy n v ―trốn thoát‖ phổ quần thể người Vì kiể c ng vi c thường xuy n giá iễn dịch ã c soát thay ổi ph n t virus cúm sát virus cúm Đề t i ang ại nh ng th ng tin v nghi n cứu ưu h nh virus cúm theo mùa A/H1N1 70 KẾT LUẬN Đã s dụng v ứng dụng kỹ thuật Real time RT- PCR ể xác ịnh tỉ nhiễ cú A/H1N1 ột số qu cho thấy số nh ng nhiễ cú A n vị qu n ội ph a ẫu cao ặc i t tháng 7-9 c Vi t Na Kết chúng t i ã x t nghi thấy tỉ cú ưu h nh A/H1N1: 78,04% chủ yếu Chúng s dụng kĩ thuật sinh học ph n t tiến h nh gi i trình tự 10 ẫu PCR virus cú kh o sát ặc iể tổng số ẫu A/H1N1 kết h p phần sinh học ph n t nh phẩ ề tin sinh học ể ột số chủng virus cúm A/H1N1 thu c Đã xác ịnh quan h ph h gi a chủng A/H1N1 nghi n cứu với chủng A/H1N1 ang ưu h nh Vi t Na khu vực v tr n giới Các chủng c nguồn gốc phát sinh chủng oại với chủng virus A/Singapore/ON442/2009(H1N1) v A/Eastern India/261/2009(H1N1) ồng thời c chủng khác ang ưu h nh Vi t Na ối quan h với tiến h a theo ột nhánh khác so với chủng n y Chủng ph n ập nghi n cứu khu trú khu vực qu n ội ph n ánh tư ng ối ầy ủ nh ng iến ổi quan trọng quần thể virus cú A/H1N1 ưu h nh v g y oạn 2009-2010 71 nh Vi t Na giai ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghi n cứu s u v rộng h n cỡ nh ang ầ ẫu v tr n ối tư ng người nh kh ng tri u chứng quốc ể c nh ng kết qu n vị qu n ội tr n to n tin cậy h n n a cúm A/H1N1 hi n ang ưu h nh Qu n ội Vi t Na Tiếp tục nghi n cứu gi i trình tự to n ộ gen virus A/H1N1 ể ph n t ch so sánh với chủng khác Vi t Na c c sở d v tr n giới ể i u ánh giá iến ổi di truyền virus cú ịnh hướng tư ng quan iễn dịch v vaccin ph ng 72 A/H1N1 hi n nh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế (2009) Kế hoạch hành động phòng chống đại dịch cúm A/H1N1 Việt Nam Bộ Y tế (2009) Hướng dẫn Chẩn đốn, điều trị phòng lây nhiễm cúm A/H1N1 Bộ Y tế Cục Y tế dự ph ng (2011) Về tình hình cúm A/H1N1 biện pháp phòng chống triển khai Bộ Y Tế (2009) Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm cúm A/H1N1 Bộ Y Tế (2009) Hướng dẫn giám sát phòng chống dịch cúm A/H1N1 Bùi Thị Thùy Dư ng (2011) Xác định trình tự phân tích gen mã hố kháng ngun NA (Neuraminidase) virus cúm chủng NYMC X-179A sử dụng sản xuất vaccine cúm A/H1N1 năm 2009 Việt Nam Dư ng Tuấn Linh (2009) Giải trình tự gen mã h a kháng nguyên H N số chủng virus cúm A subtype H1N1 từ dịch h u họng bệnh nhân trung đoàn X- uân đoàn – Vi n V Sinh Ph ng Dịch Qu n Đội Vi n Nghi n Cứu Cú - Trung T Lê Thanh Hòa Trư ng Na Cú Quốc Gia Nga tr 1-5 H i N ng Văn H i Đinh Duy Kháng Phan Văn Chi Quyền Đình Thi L Trần Bình (2009) ―Nguồn gen chế tiến h a phân tử virus cúm A/H1N1-2009 gây đại dịch người nay” Tạp ch C ng ngh sinh học 7(2) 133-153 Nguyễn Trần Hiển (2010), Virut cúm A/H1N1 đại dịch năm 2009, Nhà xuất n Y học H Nội 10.Nguyễn Thi Thi Th Phan Trọng L n (2009) ―Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng chùm ca bệnh cúm A/H1N1 đ u tiên Việt Nam― Tạp ch Y học dự ph ng Tập XIX 7(106) pp.116-123 11.Nguyễn Thị Thi Th (2011) Đặc điểm dịch tễ học số yếu tố nguy bệnh cúm A/H1N1/09 đại dịch khu vực miền Bắc, Việt Nam, 2009 – 2011 Luận văn tiến sỹ 12.Nguyễn Trần Hiển Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng virus học cúm A/H1N1 đại dịch tỉnh miền Bắc-Trung-Tây nguyên Vi n VSDT Trung ng 13.Phạ áo cáo s n phẩ tr 5-15 Hùng V n (2009) PCR va Realtime PCR-Các vấn đề ứng dụng thường gặp Nh xuất n Y học tr 81-110, 145-148 14.Vi n v sinh dịch tễ Trung ng (2010) Virus y học Nh xuất n y học Tài liệu tiếng anh 15 Andrew Rambaut, Oliver G Pybus, Martha I Nelson, Cecile Viboud, Jeffery K.Taubenberger,and Edward C.Holmes,The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A Virus Nature.2008 May 29; 453(7195): 615–619 16 Anonymous Epidemiological summary of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus – Ontario, Canada, June 2009 Wkly Epidemiol Rec 2009; 84: 485–491 17 Baillie, G J., Galiano, M., Agapow, P M., Myers, R., Chiam, R., Gall, A., Palser, A L., Watson, S J., Hedge, J & other authors (2012) Evolutionary dynamics of local pandemic H1N1/2009 influenza virus lineages revealed by whole-gen analysis J Virol 86, 11–18 18 Bernard N Fields, David M Knipe, and Peter M Howley 1996 Fundamental Virology Third Edition Lippincott Williams & Wilkins, page 220-239 19 Boni MF, Manh BH, Thai PQ, Farrar J, Hien TT, et al (2009) Modelling the progression of pandemic influenza A/H1N1 in Vietnam and the pportunitiesfor reassortment with other influenza viruses BMC Medicine 7: 43 20 Bose ME, Beck ET, Ledeboer N, Kehl SC, Jurgens LA, Patitucci T, Witt L, LaGue E, Darga P, He J, Fan J, Kumar S, Henrickson KJ: Rapid semiautomated subtyping of influenza virus species during the 2009 swine origin influenza A/H1N1 virus epidemic in Milwaukee Wisconsin J Clin Microbiol 2009, 47:2779–2786 21.Carr MJ, Gunson R, Maclean A, Coughlan S, Fitzgerald M, Scully M, O‘Her ihy B Ryan J O‘F anagan D Conne J Car an WF Ha WW: Development of a real-time RT-PCR for the detection of swine-lineage influenza A/H1N1 virus infections J Clin Virol 2009, 45:196–199 22.Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Update: novel influenza A/H1N1 virus infection – Mexico, March-May, 2009 MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58: 585–589 23.Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Evaluation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A/H1N1 virus – United States, 2009 MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58: 826–829 24.Dawood FS, Jain S, Finelli L , Novel Swine-Origin Influenza A/H1N1 Virus Investigation Team Emergence of a novel swine-origin influenza A/H1N1 virus in humans [published correction appears in N Engl J Med 2009;361(1):102] N Engl J Med 2009;360(25):2605-2615 25.Evaluation of four realtime PCR assays for detection of Influenza A/H1N1 v Viruses Eurosurveillance, Volume 14, Issue 22, 04 June 2009 Sultan Qaboos Univ Med J 2010 August; 10(2): page 187-195 26.Garten RJ, Davis CT, Russell CA, Shu B, Lindstrom S, Balish A, Sessions WM, Xu X, Skepner E, Deyde V, Okomo-Adhiambo A, Gubareva L, Barnes J, Smith CB, Emery SL, Hillman MJ, Rivailler P, Smagala J, de Graaf M, Burke DF, Fouchier RAM, Pappas C, AlpucheAranda CM, Lopez-Gatell H, Olivera H, Lopez I, Myers CA, Faix D, Blair PJ, Yu C, Keene KM, Dotson PD Jr, Boxrud D, Sambol AR, Abid SH, St George K, Bannerman T, Moore AL, Stringer DJ, Blevins P, Demmler-Harrison GJ, Ginsberg M, Kriner P, Waterman S, Smole S, Guevara HF, Belongia EA, Clark PA, Beatrice ST, Donis R, Katz J, Finelli L, Bridges CB, Shaw M, Jernigan DB, Uyeki TM, Smith DJ, Klimov AI, Cox NJ: Antigenic and Genetic Characteristics of SwineOrigin 2009 A/H1N1 Influenza Viruses Circulating in Humans Science 2009, 325(5937):197-201 27.Garten RJ, Davis CT, Russell CA, et al Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A/H1N1 influenza viruses circulating in humans Science 2009;325(5937):197-202 28 Gaydos JC, Top FH, Jr, Hodder RA, Russell PK Swine influenza a outbreak, Fort Dix, New Jersey, 1976 Emerg Infect Dis 2006;12(1):23-28 29.Hong Kai Lee, Chun Kiat Lee, Tze Ping Loh, Julian Wei-Tze Tang, Lily Chiu,Paul A Tambyah,Sunil K Sethi and Evelyn Siew-Chuan Koay Diagnostic Testing for Pandemic Influenza in Singapore: A Novel DualGene Quantitative Real-Time RT-PCR for the Detection of Influenza A/H1N1/2009 Journal of Molecular Diagnostics, Vol 12, No 5, September 2010 30.Jiang T, Kang XP, Deng Y, Zhao H, Li X, Yu X, Yu M, Qin E, Zhu Q, Yang Y, Qin C: Development of a real-time RT-PCR assay for a novel Influenza A/H1N1 virus J Virol Methods 2010, 163:470–473 31.John C Sherris (editor), James J Champoux, Lawrence Corey, Frederick C Neidhardt, James J Plorde, C George Ray, and Kenneth J Ryan 1990 Medical Microbiology: An introduction to infectious diseases Prentice-Hall International Inc 32.Kilbourne ED Influenza pandemics of the 20th century Emerg Infect Dis 2006;12(1):9-14 33.Mathieu Fourment,1,2 Sek Mardy,1 Mey Channa,1 and Philippe Buchy (2010) Evidence for Persistence of and Antiviral Resistance and Reassortment Events in Seasonal Influenza Virus Strains Circulating in Cambodia JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan 2010, Vol 48, p 295–297 34.M KAYE, S SKIDMORE, H OSMAN, M WEINBREN AND R WARREN, Surveillance of respiratory virus infections in adult hospital admissions using rapid methods Epidemiol Infect (2006), 134, 792–798 35.Nelson, M I., C Viboud, L Simonsen, R T Bennett, S B Griesemer, K St George, J Taylor, D J Spiro, N A Sengamalay, E Ghedin, J K Taubenberger, and E C Holmes 2008 Multiple reassortment events in the evolutionary history of H1N1 influenza A virus since 1918 PLoS Pathog.4:e1000012 36.Novel Swine-Origin Influenza A/H1N1 Virus Investigation Team Emergence of a Novel Swine-Origin Influenza A/H1N1 Virus in Humans N Engl J Med 22 May 2009 37 Poon LL, Chan KH, Smith GJ, Leung CSW, Guan Y, Yuen KY, Peiris JSM: Molecular detection of a novel human influenzA/H1N1 of pandemic potential by conventional and real-time quantitative RTPCR assays Clin Chem 2009, 55:1555–1558 38.Rambaut, A., Pybus, O G., Nelson, M I., Viboud, C., Taubenberger, J K & Holmes, E C (2008) The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus Nature 453, 615–619 39.S J Flint, L.W Enquist, V R Racaniello, and A M Skalka 2004 Principles of Virology: Molecular Biology, Pathologu, and control of animal Viruses Second Edition ASM Press Washington, D.C.212-224 40.Shinde V, Bridges CB, Uyeki TM, et al Triple-reassortant swine influenza A (H1) in humans in the United States, 2005-2009 [published correction appears in N Engl J Med 2009;361(1):102] N Engl J Med 2009;360(25):2616-2625 41.Smith, G J., D Vijaykrishna, J Bahl, S J Lycett, M Worobey, O G Pybus, S K Ma, C L Cheung, J Raghwani, S Bhatt, J S Peiris, Y Guan, and A Rambaut 2009 Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic Nature 459:1122–1125 42.The Domestic and International Impacts of the 2009-H1N1 Influenza A Pandemic Institute of Medicine (US) Forum on Microbial Threats Washington (DC): National Academies Press (US); 2010 43.Trifonov V, Khiabanian H, Rabadan R: Geographic dependence, surveillance, and origins of the 2009 influenza A/H1N1 virus N Engl J Med 2009, 361:115-119 44.Wang R, Sheng ZM, Taubenberger JK: Detection of novel (swine origin) H1N1 influenza A virus by quantitative real-time reverse transcriptionPCR J Clin Microbiol 2009, 47:2675–2677 45.Whiley DM, Bialasiewicz S, Bletchly C, Faux CE, Harrower B, Gould AR, Lambert SB, Nimmo GR, Nissen MD, Sloots TP: Detection of novel influenza A/H1N1 virus by real-time RT-PCR J Clin Virol 2009, 45:203– 204 46.World Health Organization (WHO) CDC protocol of rRT-PCR for Influenza A/H1N1 30 April 2009, page 1-9 47.Zimmer SM, Burke DS Historical perspective—emergence of influenza A/H1N1 viruses N Engl J Med 2009;361(3):279-285 Tài liệu điện tử 48 Cục Y tế dự ph ng: http://vncdc.gov.vn/en/index.php?option=com_content&view=ar ticle&id=166:cum&catid=51:bnh-truyn-nhim 49 http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%BAm_gia_c%E1%BA%A7m 50 NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 51 http://www.who.int/topics/influenza/en/ PHỤ LỤC Kết qu gi i trình tự gen 10 ẫu nghi n cứu: Mẫu số 1: A/VietNa /01/2009/H1N1 Mẫu số 2: A/VietNa /02/2009/H1N1 Mẫu số 3: A/VietNa /03/2009/H1N1 Mẫu số 4: A/VietNam/04/2009/H1N1 Mẫu số 5: A/VietNa /05/2009/H1N1 Mẫu số 6: A/VietNa /06/2009/H1N1 Mẫu số 7: A/VietNa /07/2009/H1N1 Mẫu số 8: A/VietNa /08/2009/H1N1 Mẫu số 9: A/VietNa /09/2009/H1N1 Mẫu số 10: A/VietNa /10?2009/H1N1 ... THỊ THANH TÂM ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT- PCR TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 607325 Người... Real time RT- PCR giám sát dịch cúm A/H1N1 số đơn vị quân đội phía Bắc, Việt Nam với - Xác ịnh tỉ nhiễ cú A/H1N1 ột số ục ti u: n vị qu n ội ph a B c vụ dịch 2009-2010 ằng kỹ thuật rRT -PCR - Xác... Các kỹ thuật s dụng nghi n cứu virus cú 1.5.1 Kỹ thuật rRT -PCR phát hi n cú A/H1N1 từ A/H1N1 17 nh phẩ nh y họng 17 1.5.2 Kỹ thuật gi i trình tự gen 20 1.5.3 Một số phư