Tiếp tục nghiên cứu hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ XN HỒNG TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU HỆ TỰ NHŨ HĨA SIÊU BÃO HỊA CHỨA SILYMARIN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ XUÂN HOÀNG MÃ SINH VIÊN: 1301164 TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU HỆ TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HỊA CHỨA SILYMARIN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thạch Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Bộ môn Dược lực Viện KNATVSTPQG HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo TS Nguyễn Thạch Tùng TS Trần Cao Sơn luôn tận tâm hướng dẫn, động viên, chia sẻ, giúp đỡ em trình học tập, nghiên cứu hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới nhóm nghiên cứu thuộc môn Dược lực hợp tác, giúp đỡ em hoàn thành đề tài Thay mặt nhóm nghiên cứu, em xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ đề tài mã số 106-YS.05-2016.01 Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên mơn Bào chế, mơn Dược lực, mơn Hóa phân tích – Độc chất, mơn Hóa lý, anh chị công tác Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh an tồn thực phẩm Quốc gia hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn người bạn, người anh, chị, em – người bên cạnh, quan tâm, giúp đỡ, động viên em vượt qua khó khăn sống học tập, động lực để em học tập, rèn luyện nghiên cứu Trường Đại học Dược Hà Nội Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Hồ Xuân Hoàng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan silymarin 1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất hóa lý .2 1.1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.2 Đặc điểm dược động học 1.1.3 Cơ chế tác dụng 1.1.4 Chỉ định 1.1.5 Liều dùng 1.1.6 Một số chế phẩm chứa silymarin thị trường .4 1.1.7 Một số nghiên cứu cải thiện sinh khả dụng silymarin 1.1.7.1 Tạo phức hợp với phospholipid 1.1.7.2 Tạo phức với β-cyclodextrin 1.1.7.3 Tạo hệ phân tán rắn 1.1.7.4 Tạo nano nhũ tương 1.1.7.5 Hệ tự vi nhũ hóa 1.1.7.6 Tạo polyme micell 1.2 Mơ hình nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan silymarin 1.2.1 Mơ hình nghiên cứu sử dụng carbon tetraclorid (CCl4) 1.2.2 Mơ hình nghiên cứu sử dụng paracetamol .11 1.2.3 Mơ hình nghiên cứu sử dụng ethanol .11 1.2.4 Mơ hình nghiên cứu sử dụng D-Galactosamin 12 1.2.5 Mơ hình nghiên cứu sử dụng thioacetamid 12 1.2.6 Một số thông số điểm để đánh giá mức độ tổn thương gan .12 1.3 Tổng quan hệ tự nhũ hóa rắn 13 1.3.1 Các kỹ thuật hóa rắn cho hệ tự nhũ hóa 13 1.3.1.1 Phun sấy 13 1.3.1.2 Hấp phụ trực tiếp lên chất mang rắn .13 1.3.2 Các chất mang rắn phổ biến .14 1.3.2.1 Chất mang rắn vô có độ xốp cao 14 1.3.2.2 Các chất mang có chất polyme 14 1.3.3 Sự thay đổi thông số dược động học hệ tự nhũ hóa rắn .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .17 2.1.1 Nguyên vật liệu 17 2.1.2 Động vật nghiên cứu 18 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Đánh giá in vivo hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin .19 2.2.2 Nghiên cứu chất mang rắn cho hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu .19 2.3.1 Phương pháp bào chế 19 2.3.1.1 Bào chế S - SMEDDS chứa SLM 19 2.3.1.2 Bào chế S – SMEDDS rắn 19 2.3.2 Phương pháp định lượng silybin .20 2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector UV 20 2.3.2.2 Phương pháp định lượng silybin 20 2.3.3 Phương pháp đánh giá in vivo 21 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng thỏ .21 2.3.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột .23 2.3.4 Đánh giá phần trăm giải phóng silybin S – SMEDDS rắn .25 2.3.5 Xử lý số liệu tính tốn kết 26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết định lượng hàm lượng silybin mẫu .27 3.1.1 Thẩm định số tiêu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 27 3.1.2 Kết định lượng mẫu 28 3.2 Kết đánh giá in vivo .29 3.2.1 Kết đánh giá sinh khả dụng thỏ 29 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt 32 3.3 Kết nghiên cứu chất mang rắn cho S-SMEDDS 35 3.3.1 Nghiên cứu khả hấp phụ loại chất mang khác 36 3.3.2 Nghiên cứu khả ảnh hưởng chất mang tới khả giải phóng DC 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALP Alkalin phosphatase (phosphatase kiềm) ALT Alanin aminotransferase AUC Area under the curve - Diện tích đường cong AST Aspartat aminotransferase CAT Catalase * Gốc tự tricloromethyl CCl3OO* Gốc tự tricloromethylperoxy CCl4 Carbon tetraclorid DC Dược chất EP European Pharmacopoeia – Dược điển Châu Âu GSH Glutathion MS Khối phổ (mass spectrometry) LDH Lactat dehydrogenase CCl3 LC - MS/MS Liquid chromatography tandem-mass spectrometry – Sắc ký lỏng khối phổ lần MDA Malondialdehyd NaCMC Natri carboxymethyl cellulose ROS Reactive oxygen species - Gốc oxy hoạt động SEDDS Self - emulsifying drug delivery systems - Hệ tự nhũ hóa SLM Silymarin SKD Sinh khả dụng SOD Superoxid dismutase S - SMEDDS Smix USP Supersaturatable self - microemulsifying drug delivery system - Hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa Surfactant mixture – Hỗn hợp chất diện hoạt, đồng diện hoạt United States Pharmacopoeia - Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hóa rắn SEDDS…………………………………….16 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu……………………………………………………… 18 Bảng 2.3 Các thông số kỹ thuật phương pháp phân tích LC - MS/MS 22 Bảng 2.4 Chương trình dung mơi phương pháp LC - MS/MS……………… 23 Bảng 3.1 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp HPLC ………………… 28 Bảng 3.2 Kết định lượng hàm lượng silybin mẫu………………… 28 Bảng 3.3 Các thông số dược động học silybin isosilybin thỏ S SMEDDS Legalon®………………………………………………………………30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hệ S-SMEDDS chế phẩm đối chiếu Legalon® mức liều khác đến nồng độ MDA, GSH hoạt độ SOD gan chuột gây hoại tử gan CCl4 .34 Bảng 3.5 Phần trăm DC giải phóng sau 45 phút mẫu rắn sau hấp phụ với chất mang khác nhau……………………………………………………… 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Con đường chuyển hóa SLM Hình 1.2 Con đường chuyển hóa CCl4………………………………………….10 Hình 1.3 Các tổn thương gan CCl4 gây 10 Hình 1.4 Cơ chế gây độc gan paracetamol ……………………………………11 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ với diện tích pic silybin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với detector UV 27 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ silybin huyết tương thỏ theo thời gian S- SMEDDS Legalon®…………………………………………….29 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ isosilybin huyết tương thỏ theo thời gian S- SMEDDS Legalon®……………………………………….30 Hình 3.4 Ảnh hưởng S-SMEDDS Legalon® mức liều khác đến hoạt độ ALT, AST huyết chuột gây hoại tử gan CCl4……33 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả hấp phụ chất mang khác ……37 Hình 3.6 Phần trăm giải phóng silybin theo thời gian S- SMEDDS rắn với chất mang Aerosil 200………………………………………………………………… 39 Hình 3.7 Phần trăm giải phóng silybin theo thời gian S- SMEDDS rắn với chất mang Tá dược A 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Silymarin (SLM) hỗn hợp flavonoid phân lập từ Kế sữa (Silybum marianum L Gaertn), sử dụng lâm sàng với mục đích điều trị bệnh gan hiệu điều trị SLM thường không ổn định gặp phải vấn đề SKD thấp [49] Trên giới có nhiều nghiên cứu tiếp cận cách khác để cải thiện sinh khả dụng (SKD) SLM, số đó, hệ tự vi nhũ hóa (SMEDDS) sử dụng rộng rãi để tăng SKD đường uống dược chất (DC) khó tan nước nhờ khả tạo giọt vi nhũ tương đường tiêu hóa Đã có nhiều báo cáo SMEDDS có vài hạn chế tái kết tinh DC bị pha loãng đường tiêu hóa, việc sử dụng lượng lớn chất diện hoạt gây nhiều tác dụng phụ [64] Để giải vấn đề này, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa (S – SMEDDS) chứa SLM nhằm cải thiện SKD SLM đồng thời khắc phục hạn chế SMEDDS Trong báo cáo trước, nhóm nghiên cứu tối ưu hóa cơng thức S – SMEDDS chứa SLM, kết in vitro chứng minh hiệu ức chế kết tinh Polyme sử dụng công thức tối ưu [2] Tuy nhiên, tương quan kết in vitro với in vivo cần phải kiểm chứng Bên cạnh đó, S – SMEDDS tồn trạng thái lỏng nên thường sử dụng dạng nang mềm, dẫn đến số nhược điểm tăng chi phí sản xuất, tương tác dịch nhân với vỏ nang,… [33] Gần đây, số kỹ thuật chuyển S – SMEDDS thành dạng rắn áp dụng để giải vấn đề Thông thường, S – SMEDDS hấp phụ trực tiếp lên chất mang rắn xốp để chuyển thành bột khô Trong phương pháp này, Aerosil chất mang thường dùng có khả hấp phụ lượng lớn hệ lỏng, số báo cáo cho thấy S – SMEDDS rắn tương ứng thường giải phóng DC khơng hồn tồn [46], [60] Vì vậy, cần phải tìm chất mang rắn phù hợp cho S – SMEDDS cho vừa có khả mang thuốc tốt lại không ảnh hưởng tới khả giải phóng S – SMEDDS Với lý trên, nhóm nghiên cứu thực đề tài “Tiếp tục nghiên cứu hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin” với mục tiêu sau: Đánh giá in vivo hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin Sàng lọc chất mang rắn phù hợp cho hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin Từ kết quả, nhận thấy tỷ lệ chất mang với S- SMEDDS không làm ảnh hưởng tới khả giải phóng DC S- SMEDDS rắn Điều trái với giả thiết ban đầu Kết kích thước lỗ xốp hẹp chất mang làm cản trở nhiều đến khả nhũ hóa S – SMEDDS, dẫn đến khả giải phóng DC không tăng tăng lượng S – SMEDDS Với kết nghiên cứu chất mang rắn cho S – SMEDDS chứa SLM cho thấy, Tá dược B có khả hấp phụ tốt hệ lỏng đảm bảo khả giải phóng DC so với S- SMEDDS lỏng Vì vậy, Tá dược B phù hợp làm chất mang rắn cho S – SMEDDS chứa SLM 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thực đề tài: “Tiếp tục nghiên cứu hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin”, thu kết sau: + Sinh khả dụng silybin, isosilybin thỏ hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin cao 10,15 lần 3,25 lần so với sản phẩm thị trường Legalon® + Tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin thể tác dụng tốt so với Legalon®, đặc biệt mức liều tương đương 10 mg silybin/kg + Nghiên cứu chất mang rắn cho hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin cho thấy Tá dược B có khả hấp phụ tốt đảm bảo khả giải phóng, phù hợp với mục tiêu đặt Vì vậy, Tá dược B lựa chọn làm chất mang rắn hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin KIẾN NGHỊ + Nghiên cứu phát triển dạng trung gian sau hấp phụ hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin lên chất mang rắn thành viên nén pellet + Nghiên cứu đánh giá in vivo hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa rắn chứa silymarin 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y Tế (2013), "Dược liệu học, Tập I", NXB Y học, Hà Nội, pp 375 - 376 Hoàng Thị Trang (2017), "Nghiên cứu phát triển hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa Silymarin sử dụng Co-polyme làm chất ức chế kết tinh", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, p 43 Mạc Thị Mai (2017), "Hồn thiện mơ hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng áp dụng đánh giá tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Phạm Đức Tân (2016), "Nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Trịnh Thị Điệp; Bùi Thị Bằng (2006), "Nghiên cứu phương pháp định lượng silymarin quang phổ tử ngoại", Tạp chí Dược liệu, Tập 11(số 4/2006), pp 148-151 Tài liệu tiếng Anh Abouzid S (2012), "Silymarin, natural flavonolignans from milk thistle", Phytochemicals-A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, InTech Arcari M., Brambilla A., Brandt A., et al (1992), "A new inclusion complex of silibinin and beta-cyclodextrins: in vitro dissolution kinetics and in vivo absorption in comparison with traditional formulations", Bollettino chimico farmaceutico, 131(5), pp 205-209 Barzaghi N., Crema F., Gatti G., et al (1990), "Pharmacokinetic studies on IdB 1016, a silybin-phosphatidylcholine complex, in healthy human subjects", European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 15(4), pp 333-338 Bijak M (2017), "Silybin, a major bioactive component of milk thistle (Silybum marianum L Gaernt.)—Chemistry, bioavailability, and metabolism", Molecules, 22(11), p 1942 10 Carrier R L., Miller L A., Ahmed I (2007), "The utility of cyclodextrins for enhancing oral bioavailability", Journal of Controlled Release, 123(2), pp 7899 11 Craig D Q (2002), "The mechanisms of drug release from solid dispersions in water-soluble polymers", International journal of pharmaceutics, 231(2), pp 131-144 12 Chatterjee B., Hamed Almurisi S., Ahmed Mahdi Dukhan A., et al (2016), "Controversies with self-emulsifying drug delivery system from pharmacokinetic point of view", Drug delivery, 23(9), pp 3639-3652 13 Dahlstrom D., Bloomhuff A (2014), "ACGIH®(American Conference of Governmental Industrial Hygienists)" 14 Delgado-Montemayor C., Cordero-Pérez P., Salazar-Aranda R., et al (2015), "Models of hepatoprotective activity assessment", Medicina universitaria, 17(69), pp 222-228 15 Dixit N., Baboota S., Kohli K., et al (2007), "Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhancement approaches", Indian journal of pharmacology, 39(4), p 172 16 Humberstone A J., Charman W N (1997), "Lipid-based vehicles for the oral delivery of poorly water soluble drugs", Advanced drug delivery reviews, 25(1), pp 103-128 17 Hwang D H., Kim Y.-I., Cho K H., et al (2014), "A novel solid dispersion system for natural product-loaded medicine: silymarin-loaded solid dispersion with enhanced oral bioavailability and hepatoprotective activity", Journal of microencapsulation, 31(7), pp 619-626 18 Ingawale D K., Mandlik S K., Naik S R (2014), "Models of hepatotoxicity and the underlying cellular, biochemical and immunological mechanism (s): a critical discussion", Environmental toxicology and pharmacology, 37(1), pp 118-133 19 Ismail A F., Salem A A., Eassawy M M (2016), "Hepatoprotective effect of grape seed oil against carbon tetrachloride induced oxidative stress in liver of γirradiated rat", Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 160, pp 1-10 20 Ito Y., Kusawake T., Ishida M., et al (2005), "Oral solid gentamicin preparation using emulsifier and adsorbent", Journal of Controlled Release, 105(1-2), pp 2331 21 Jaeschke H., Williams C D., Mcgill M R., et al (2013), "Models of druginduced liver injury for evaluation of phytotherapeutics and other natural products", Food and Chemical Toxicology, 55, pp 279-289 22 James L P., Mayeux P R., Hinson J A (2003), "Acetaminophen-induced hepatotoxicity", Drug Metabolism and Disposition, 31(12), pp 1499-1506 23 Javed S., Kohli K., Ali M (2011), "Reassessing bioavailability of silymarin", Alternative medicine review, 16(3), p 239 24 Kidd P., Head K (2005), "A review of the bioavailability and clinical efficacy of milk thistle phytosome: a silybin-phosphatidylcholine complex (Siliphos®)", Alternative medicine review, 10(3), p 193 25 Kidd P M (2009), "Bioavailability and activity of phytosome complexes from botanical polyphenols: the silymarin, curcumin, green tea, and grape seed extracts", Altern Med Rev, 14(3), pp 226-246 26 Kumar A., Sharma S., Kamble R (2010), "Self emulsifying drug delivery system (SEDDS): Future aspects", Int J Pharm Pharm Sci, 2(4), pp 7-13 27 Li X., Huang Y., Chen X., et al (2009), "Self-assembly and characterization of Pluronic P105 micelles for liver-targeted delivery of silybin", Journal of drug targeting, 17(10), pp 739-750 28 Morazzoni P., Magistretti M., Giachetti C., et al (1992), "Comparative bioavailability of silipide, a new flavanolignan complex, in rats", European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 17(1), pp 39-44 29 Morazzoni P., Montalbetti A., Malandrino S., et al (1993), "Comparative pharmacokinetics of silipide and silymarin in rats", European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 18(3), pp 289-297 30 O’driscoll C M (2002), "Lipid-based formulations for intestinal lymphatic delivery", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 15(5), pp 405-415 31 Parveen R., Baboota S., Ali J., et al (2011), "Oil based nanocarrier for improved oral delivery of silymarin: in vitro and in vivo studies", International journal of pharmaceutics, 413(1-2), pp 245-253 32 S C S (2009), "Martindale : the complete drug reference, 36 ed", Pharmaceutical Press, London", p p1452 33 Tang B., Cheng G., Gu J.-C., et al (2008), "Development of solid selfemulsifying drug delivery systems: preparation techniques and dosage forms", Drug discovery today, 13(13-14), pp 606-612 34 Taylor L S., Zografi G (1997), "Spectroscopic characterization of interactions between PVP and indomethacin in amorphous molecular dispersions", Pharmaceutical research, 14(12), pp 1691-1698 35 Voinovich D., Perissutti B., Grassi M., et al (2009), "Solid state mechanochemical activation of Silybum marianum dry extract with betacyclodextrins: Characterization and bioavailability of the coground systems", Journal of pharmaceutical sciences, 98(11), pp 4119-4129 36 Wang A.-Y., Lian L.-H., Jiang Y.-Z., et al (2010), "Gentiana manshurica Kitagawa prevents acetaminophen-induced acute hepatic injury in mice via inhibiting JNK/ERK MAPK pathway", World Journal of Gastroenterology: WJG, 16(3), p 384 37 Wang L., Khambu B., Zhang H., et al (2015), "Autophagy in alcoholic liver disease, self-eating triggered by drinking", Clinics and research in hepatology and gastroenterology, 39, pp S2-S6 38 Weber L W., Boll M., Stampfl A (2003), "Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model", Critical reviews in toxicology, 33(2), pp 105-136 39 Wen Z., Dumas T E., Schrieber S J., et al (2008), "Pharmacokinetics and metabolic profile of free, conjugated, and total silymarin flavonolignans in human plasma after oral administration of milk thistle extract", Drug Metabolism and Disposition, 36(1), pp 65-72 40 Wu Y., Huo M., Zhou J (2009), "Preparation of silymarin-loaded amphiphilic chitosan micelle and its in situ absorption in rat intestine", Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica, 44(6), pp 651-657 41 Yanyu X., Yunmei S., Zhipeng C., et al (2006), "The preparation of silybin– phospholipid complex and the study on its pharmacokinetics in rats", International journal of pharmaceutics, 307(1), pp 77-82 42 Zangar R C., Benson J M., Burnett V L., et al (2000), "Cytochrome P450 2E1 is the primary enzyme responsible for low-dose carbon tetrachloride metabolism in human liver microsomes", Chemico-biological interactions, 125(3), pp 233243 43 Zhao J., Agarwal R (1999), "Tissue distribution of silibinin, the major active constituent of silymarin, in mice and its association with enhancement of phase II enzymes: implications in cancer chemoprevention", Carcinogenesis, 20(11), pp 2101-2108 44 Agarwal V., Siddiqui A., Ali H., et al (2009), "Dissolution and powder flow characterization of solid self-emulsified drug delivery system (SEDDS)", International journal of pharmaceutics, 366(1-2), pp 44-52 45 Beg S., Katare O., Saini S., et al (2016), "Solid self-nanoemulsifying systems of olmesartan medoxomil: Formulation development, micromeritic characterization, in vitro and in vivo evaluation", Powder Technology, 294, pp 93-104 46 Chavan R B., Modi S R., Bansal A K (2015), "Role of solid carriers in pharmaceutical performance of solid supersaturable SEDDS of celecoxib", International journal of pharmaceutics, 495(1), pp 374-384 47 Cheng G., Hu R., Ye L., et al (2016), "Preparation and in vitro/in vivo evaluation of puerarin solid self-microemulsifying drug delivery system by spherical crystallization technique", AAPS PharmSciTech, 17(6), pp 1336-1346 48 Cherniakov I., Domb A J., Hoffman A (2015), "Self-nano-emulsifying drug delivery systems: an update of the biopharmaceutical aspects", Expert opinion on drug delivery, 12(7), pp 1121-1133 49 Fraschini F., Demartini G., Esposti D (2002), "Pharmacology of silymarin", Clinical drug investigation, 22(1), pp 51-65 50 Gao P., Morozowich W (2006), "Development of supersaturatable selfemulsifying drug delivery system formulations for improving the oral absorption of poorly soluble drugs", Expert opinion on drug delivery, 3(1), pp 97-110 51 Gumaste S G., Dalrymple D M., Serajuddin A T (2013), "Development of solid SEDDS, V: compaction and drug release properties of tablets prepared by adsorbing lipid-based formulations", Pharmaceutical research, 30(12), pp 31863199 52 Gumaste S G., Freire B O., Serajuddin A T (2017), "Development of solid SEDDS, VI: Effect of precoating with PVP on drug release from adsorbed selfemulsifying lipid-based formulations", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 110, pp 124-133 53 Gumaste S G., Serajuddin A T (2017), "Development of solid SEDDS, VII: Effect of pore size of silica on drug release from adsorbed self-emulsifying lipidbased formulations", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 110, pp 134-147 54 Girish C., Pradhan S (2012), "Hepatoprotective activities of picroliv, curcumin, and ellagic acid compared to silymarin on carbon-tetrachloride-induced liver toxicity in mice", Journal of pharmacology & pharmacotherapeutics, 3(2), p 149 55 Inugala S., Eedara B B., Sunkavalli S., et al (2015), "Solid self-nanoemulsifying drug delivery system (S-SNEDDS) of darunavir for improved dissolution and oral bioavailability: in vitro and in vivo evaluation", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 74, pp 1-10 56 Kamel R., El Morsy E M (2013), "Hepatoprotective effect of methylsulfonylmethane against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats", Archives of pharmacal research, 36(9), pp 1140-1148 57 Koh P H., Mokhtar R a M., Iqbal M (2012), "Antioxidant potential of Cymbopogon citratus extract: alleviation of carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative stress and toxicity", Human & experimental toxicology, 31(1), pp 8191 58 Li X., Yuan Q., Huang Y., et al (2010), "Development of silymarin selfmicroemulsifying drug delivery system with enhanced oral bioavailability", AAPS PharmSciTech, 11(2), pp 672-678 59 Madrigal-Santillán E., Madrigal-Bujaidar E., Álvarez-González I., et al (2014), "Review of natural products with hepatoprotective effects", World Journal of Gastroenterology: WJG, 20(40), p 14787 60 Qi X., Qin J., Ma N., et al (2014), "Solid self-microemulsifying dispersible tablets of celastrol: Formulation development, charaterization and bioavailability evaluation", International journal of pharmaceutics, 472(1-2), pp 40-47 61 Takada Y., Noguchi T., Okabe T., et al (1982), "Superoxide dismutase in various tissues from ratbits bearing the Vx-2 carcinoma in the maxillary sinus", Cancer Research, 42(10), pp 4233-4235 62 Tan A., Rao S., Prestidge C A (2013), "Transforming lipid-based oral drug delivery systems into solid dosage forms: an overview of solid carriers, physicochemical properties, and biopharmaceutical performance", Pharmaceutical research, 30(12), pp 2993-3017 63 Wasowicz W., Neve J., Peretz A (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clinical chemistry, 39(12), pp 2522-2526 64 Wei Y., Ye X., Shang X., et al (2012), "Enhanced oral bioavailability of silybin by a supersaturatable self-emulsifying drug delivery system (S-SEDDS)", Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 396, pp 2228 65 Woo J S., Kim T.-S., Park J.-H., et al (2007), "Formulation and biopharmaceutical evaluation of silymarin using SMEDDS", Archives of pharmacal research, 30(1), pp 82-89 66 Wu W., Wang Y., Que L (2006), "Enhanced bioavailability of silymarin by selfmicroemulsifying drug delivery system", European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 63(3), pp 288-294 67 Yang K Y., Du Hyeong Hwang A M Y., Kim D W., et al (2013), "Silymarinloaded solid nanoparticles provide excellent hepatic protection: physicochemical characterization and in vivo evaluation", International journal of nanomedicine, 8, p 3333 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Hình ảnh sắc ký đồ silybin phương pháp HPLC PHỤ LỤC 2: Kết thẩm định phương pháp LC – MS/MS nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng thỏ PHỤ LỤC 3: Bảng kết nồng độ silybin, isosilybin huyết tương thỏ thời điểm PHỤ LỤC 1: Hình ảnh sắc ký đồ silybin phương pháp HPLC Hình PL.1.1 Hình ảnh sắc ký đồ silybin phương pháp HPLC điều kiện chưa điều chỉnh, nồng độ 100 µg/ml Hình PL.1.2 Hình ảnh sắc ký đồ silybin phương pháp HPLC điều kiện điều chỉnh, nồng độ 100 µg/ml PHỤ LỤC 2: Kết thẩm định phương pháp LC – MS/MS nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng thỏ Hình PL.2.1 Quercetin lựa chọn làm chất chuẩn nội có cấu trúc hóa học nhóm flavonoid với silybin isosilybin Bảng PL.2.1 Các ion phân tử ion phân tích khối phổ Chất phân tích Mảnh mẹ Silybin, isosilybin 481 Quercetin 301 Mảnh CE (eV) Ghi 125 30 Định lượng 152 42 Định tính 151 22 Định lượng 183 38 Định tính Kết khảo sát lượng bắn phá ion (CE) cho thấy với lượng phù hợp, mảnh mẹ silybin isosilybin với khối lượng 481 vỡ thành hai mảnh Mảnh 125 dùng để định lượng mảnh 152 dùng để định tính Quercetin có khối lượng 301 vỡ thành mảnh 151 để định lượng 183 để định tính silybin isosilybin quercetin Hình PL.2.2 Sắc ký đồ dd quercetin 50ng/ml, silybin 100ng/ml isosilybin 100ng/ml Từ sắc ký đồ cho thấy điều kiện chạy sắc ký hoàn toàn tách riêng chất quercetin, silybin, isosilybin Bảng PL.2.2: Giá trị độ thu hồi silybin, isosilybin quercetin sử dụng dung môi chiết khác Từ kết này, lựa chọn ethylacetat làm dung môi chiết quy trình chiết lỏnglỏng Dung mơi Diện tích pic silybin % thu hồi phương pháp chiết isosilybin quercetin silybin isosilybin quercetin Ethylacetat 459 511 277 94,4% 92,9% 86,6% Ether 423 463 130 87,0% 84,2% 40,6% Chuẩn 486 550 320 y = 0,013379x - 0,034311 R² = 0,999952 Tỷ lệ diện tích pic 0 100 200 300 400 500 Nồng độ silybin (ng.mL-1) 600 12 y = 0,019304x - 0,017112 R² = 0,999886 Tỷ lệ diện tích pic 10 0 100 200 300 400 500 Nồng độ isosilybin (ng/mL-1) 600 Hình PL.2.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ dung dịch chuẩn với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn diện tích pic nội chuẩn quercetin a Đường chuẩn silybin b Đường chuẩn isosilybin PHỤ LỤC 3: Bảng kết nồng độ silybin, isosilybin huyết tương thỏ thời điểm Bảng PL.3.1 Nồng độ silybin, isosilybin huyết tương thỏ thời điểm lơ Legalon® t (giờ) 0,083333 0,25 0,5 0,75 24 Nồng độ silybin (ng/ml) Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 1,0875 2,1823 0,0001 x 0,0001 3,3794 2,4351 x 0,0000 2,7499 1,7519 x 0,0001 2,0569 0,0001 0,0000 1,0119 x 1,0484 1,2016 0,0000 2,9598 1,6217 1,3309 0,0000 1,4906 1,1698 0,0001 0,0000 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000 2,3988 0,0001 1,2197 0,0001 0,0000 1,7605 x Nồng độ isosilybin (ng/ml) Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 0,0001 1,0613 0,0001 0,0000 2,0405 2,3891 1,4350 x 1,8979 5,0033 4,3813 x 1,7540 4,4545 4,3879 x 1,7537 4,7766 2,3628 0,0001 1,9833 x 2,1746 1,5602 0,0001 4,4505 2,7396 2,0111 0,0001 1,8941 2,6066 1,8823 0,0001 1,7711 1,8277 2,5621 0,0001 3,1992 1,6898 2,2018 0,0000 0,0001 0,0001 x Bảng PL.3.1 Nồng độ silybin, isosilybin huyết tương thỏ thời điểm lô S - SMEDDS Nồng độ silybin (ng/ml) t (giờ) Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,083333 18,8758 6,0850 47,3889 32,5474 0,25 74,0924 32,9219 71,7048 79,4708 0,5 125,9081 58,7147 31,5004 53,9340 0,75 112,3575 46,2742 20,4797 56,2619 61,0250 32,3667 11,4684 48,0210 13,8503 9,7889 4,5489 26,1342 3,7439 2,7456 2,4108 7,5375 0,0001 1,1237 1,6536 1,3864 1,2114 4,6497 1,3431 24 0,0000 12,3519 0,0001 0,0001 Nồng độ isosilybin (ng/ml) Thỏ Thỏ Thỏ Thỏ 0,0001 0,0001 0,0000 0,0000 8,8539 3,1772 21,9048 15,3620 38,7177 17,5447 32,7621 37,1669 62,6957 25,9072 13,9390 29,4560 54,6982 23,3430 8,7183 30,5156 32,3721 18,9237 5,7677 25,9984 9,7990 6,6295 2,4498 17,4540 2,6435 1,3632 1,1528 6,0509 1,2854 0,0001 1,0658 1,9450 1,0297 2,9695 0,0001 0,0000 4,9784 0,0000 0,0001 ... Với lý trên, nhóm nghiên cứu thực đề tài Tiếp tục nghiên cứu hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin với mục tiêu sau: Đánh giá in vivo hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin Sàng lọc... bị nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Đánh giá in vivo hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin .19 2.2.2 Nghiên cứu chất mang rắn cho hệ tự vi nhũ hóa siêu. .. SLM, nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa siêu bão hòa chứa SLM, sử dụng Polyme X làm chất ức chế tái kết tinh DC [2] 1.2 Mô hình nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan silymarin Trên giới có nhiều nghiên