Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4

BỘ Y TẾ s TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THÚY HẰNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SILYMARIN HỆ TỰ NHŨ HĨA SIÊU BÃO HỊA TRÊN MƠ HÌNH GÂY ĐỘC GAN CẤP BẰNG CCl4 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THÚY HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1301131 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SILYMARIN HỆ TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HỊA TRÊN MƠ HÌNH GÂY ĐỘC GAN CẤP BẰNG CCl4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thùy Dương Ths Phạm Đức Vịnh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Bằng tất lòng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, Ths Phạm Đức Vịnh, PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh - Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, ln quan tâm giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thạch Tùng, Bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội góp ý giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực trực tiếp tham gia giúp đỡ em thời gian nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới tất thầy, cô giáo Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội truyền thụ cho em học quý báu, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu môn Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian em học tập trường Em xin cảm ơn anh chị, bạn bè nghiên cứu khoa học Bộ môn Dược lực Bộ môn Bào chế đồng hành, hỡ trợ, động viên để em hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên cạnh, ủng hộ chỗ dựa tinh thần em gặp khó khăn học tập sống Hà Nội, tháng năm 2018 Sinh viên Phan Thị Thúy Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thông tin chung silymarin 1.1.1 Thành phần và cấu trúc hóa học của silymarin .3 1.1.2 Tác dụng dược lý của silymarin 1.1.3 Đặc điểm sinh dược học và dược động học 1.1.4 Các phương pháp cải thiện sinh khả dụng của silymarin 1.2 Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 1.2.1 Khái niệm hệ tự nhũ hóa và hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa .8 1.2.2 Thành phần của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 1.2.3 Cơ chế hấp thu và cải thiện sinh khả dụng đường uống của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa 10 1.3 Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 12 1.3.1 Cơ chế gây độc gan cấp bằng CCl4 .12 1.3.2 Lựa chọn điều kiện thí nghiệm để triển khai mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 .13 1.3.3 Các thông số đánh giá 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Chế phẩm thử .15 2.1.2 Động vật thí nghiệm 15 2.1.3 Hóa chất thuốc thử .16 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu .17 2.3.1 Khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 17 2.3.2 So sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và Legalon ® mơ hình gây đợc gan cấp bằng CCl4 19 2.4 Phương pháp xác định thông số nghiên cứu .20 2.4.1 Hoạt độ AST và ALT huyết 20 2.4.2 Hàm lượng MDA gan 20 2.4.3 Hàm lượng GSH gan 21 2.4.4 Hoạt độ SOD gan 22 2.5 Xử lý số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ 25 3.1 Kết xác định mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 25 3.1.1 Ảnh hưởng của S-SMEDDS đến hoạt độ AST và ALT huyết của chuột gây hoại tử gan bằng CCl4 .25 3.1.2 Ảnh hưởng của S-SMEDDS đến hàm lượng MDA huyết của chuột gây hoại tử gan bằng CCl4 26 3.2 Tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS so với Legalon® mơ hình gây độc gan cấp bằng CCl4 28 3.2.1 Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon ® đến hoạt đợ AST và ALT hút của chuột gây hoại tử gan bằng CCl4 28 3.2.2 Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đới chiếu Legalon ® đến hàm lượng MDA gan của chuột gây hoại tử gan bằng CCl4 29 3.2.3 Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đới chiếu Legalon ® đến hàm lượng GSH gan của chuột gây hoại tử gan bằng CCl4 31 3.2.4 Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon® đến hoạt đợ SOD gan của cḥt gây hoại tử gan bằng CCl4 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 4.1 Về kết thăm dò mức liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 34 4.2 Về kết tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa so với Legalon® mơ hình gây độc gan cấp bằng CCl4 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanin amino transferase AST Aspartat amino transferase CCl4 Carbon tetraclorid DMSO Dimethyl sulfoxid DMF Dimethylformamid DTNB 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) GSH Glutathion dạng khử kl/tt Khối lượng/thể tích MDA Malondialdehyd NaCMC Natri carboxymethyl cellulose SOD Superoxid dismutase S-SMEDDS Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin SMEDDS Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa THF Tetrahydrofuran DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Công thức bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin [5] 15 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các thành phần chính của silymarin: silibinin A (1a), silibinin B (1b), isosilibinin A (1c), isosilibinin B (1d), silychristin A (1e), silydianin (1f) taxifoli (1g) [11] Hình 1.2 Các dẫn chất thân nước từ vi sinh vật của silibinin [62] Hình 1.3 Vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết và tĩnh mạch cửa [63] .11 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .17 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của SSMEDDS mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 18 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm so sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và Legalon® mơ hình gây độc gan cấp bằng CCl4 20 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo phức MDA và acid thiobarbituric .21 Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng tạo phức GSH và DTNB 22 Hình 2.6 Sơ đồ phản ứng khử của anion superoxid và NBT .23 Hình 3.1 Ảnh hưởng của S-SMEDDS các mức liều khác đến hoạt độ AST ALT huyết chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 .25 Hình 3.2 Ảnh hưởng của S-SMEDDS các mức liều khác đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng của S-SMEDDS Legalon® các mức liều khác đến hoạt độ AST, ALT huyết chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 .28 Hình 3.4 Ảnh hưởng của S-SMEDDS Legalon ® các mức liều khác đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 30 Hình 3.5 Ảnh hưởng của S-SMEDDS Legalon® các mức liều khác đến hàm lượng GSH gan chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 31 Hình 3.6 Ảnh hưởng của S-SMEDDS Legalon® các mức liều khác hoạt độ SOD gan chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Silymarin là hỗn hợp các flavonoid phân lập từ Kế sữa (Silybum marianum, L Gaertn), đã sử dụng lâm sàng với mục đích điều trị một số rối loạn chức gan viêm gan nhiễm độc, bệnh gan rượu, viêm gan virus…[25], [68] Tuy nhiên, hiệu điều trị của silymarin thường không ổn định tính thấm và khả hòa tan nước [33], [70] Để cải thiện độ hòa tan cũng tăng hấp thu đường uống của silymarin, một số giải pháp khác đã áp dụng bao gồm tạo phức hợp silibinin-phosphatidylcholin, liposome, hệ tự nhũ hóa và hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa (SMEDDS) Trong đó, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chú ý có độ nhớt thấp và có tính ổn định về nhiệt động học, động lực học [41] Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa (SMEDD) là một hệ giao thuốc đường uống chứa chất mang lipid, có thể làm tăng sinh khả dụng của các thuốc khó tan nước thông qua nhiều chế khác cải thiện độ tan, tăng tính thấm qua niêm mạc đường tiêu hóa và tăng cường vận chuyển thuốc vào hệ thống bạch huyết [40] Những ưu điểm này dự đoán có thể cải thiện khả hấp thu và tăng hiệu điều trị của một dược chất khó tan nước và có hiệu ứng qua gan bước một mạnh silymarin Kết thực tế cho thấy, một số nhóm nghiên cứu thế giới đã sử dụng thành công hệ sự nhũ hóa để làm tăng khả giải phóng, hòa tan và hấp thu silymarin [22], [39] Tuy nhiên, mối tương quan cải thiện sinh khả dụng in vitro in vivo với tác dụng bảo vệ gan của hệ tự nhũ hóa chứa silymarin chưa chứng minh nghiên cứu này Với mục đích phát triển một dạng bào chế ưu việt so với các dạng bào chế quy ước thị trường nay, nhóm nghiên cứu thuộc Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành xây dựng và tối ưu hóa công thức của hệ tự nhũ hõa siêu bão hòa chứa silymarin (S-SMEDDS) Các kết nghiên cứu bước đầu cho thấy S-SMEDDS làm tăng tỷ lệ khuếch tán dược chất qua túi thẩm tích nghiên cứu giải phóng in vitro và cải thiện rõ rệt sinh khả dụng thỏ, đó AUC của dược chất chính silibinin tăng khoảng 10 lần so với biệt dược tham chiếu [5] Tuy nhiên, đặc tính dược động học đặc biệt của silymarin với mức độ tích lũy cao hệ thống gan – mật và chu kì gan – ruột kéo dài, cũng hạn chế về phương pháp định lượng, sự tăng nồng độ thuốc đo máu chưa thể dự đoán chính xác tác dụng bảo vệ gan của dạng bào chế này Do đó, để đánh giá mức độ cải thiện tác dụng dược lý của S1 SMEDDS, đề tài “Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4” thực với hai mục tiêu: Xác định mức liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 So sánh tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa và Legalon® mơ hình gây đợc gan cấp bằng CCl4 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về kết xác định mức liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 Trong các nghiên cứu trước đây, nhóm nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc các loại tá dược, cũng tỉ lệ các thành phần công thức để bào chế hệ S-SMEDDS Kết đánh giá in vitro cho thấy, tỉ lệ dược chất khuếch tán từ S-SMEDDS qua túi thẩm tích sau giờ cao gấp 1,37 lần so với chế phẩm đới chiếu Legalon® [5] Tuy nhiên, đã có nghiên cứu rằng kết đánh giá giải phóng in vitro có thể không dự đoán chính xác đáp ứng in vivo của S-SMEDDS các giọt nhũ tương hình thành sau S-SMEDDS tiếp xúc với dịch tiêu hóa có thể bị phân giải lipase ruột non, làm ảnh hưởng đến khả mang thuốc của thành phần lipid và gây tái kết tinh dược chất [55] Do đó, dạng bào chế này tiếp tục đánh giá sinh khả dụng thỏ, đó S-SMEDDS đã thể sự vượt trội so với Legalon® về tớc đợ và mức đợ hấp thu cụ thể: Nồng độ đỉnh AUC0-24h huyết tương của silibinin đạt sau sử dụng S-SMEDDS lần lượt cao gấp khoảng 41 lần 10 lần so với chế phẩm tham chiếu Legalon® Tuy nhiên, liệu nồng độ thuốc huyết tương có thể chưa phản ánh đầy đủ sự tích lũy thuốc gan trước th́c vào vòng t̀n hồn chung silibinin phân bố chủ yếu mật, nồng độ của silibinin mật cao gấp nhiều lần so với nồng độ huyết tương Mặt khác, nghiên cứu dược động học thực với liều nhất của chế phẩm, chưa thể loại hoàn toàn sự tích lũy của thuốc sử dụng với liều lặp lại, đặc biệt silymarin chất có chu kì gan- ruột Do đó, kết thể thông qua thông số dược động học cần tiếp tục kiểm chứng bằng cách so sánh tác dụng bảo vệ gan của hai chế phẩm Để lựa chọn mức liều thích hợp cho thử nghiệm so sánh với Legalon®, chúng tiến hành thăm dò mức liều có tác dụng của S-SMEDDS mơ hình gây hoại tử gan cấp bằng CCl4, một mô hình sử dụng phổ biến nhất để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của nhiều tác nhân khác bao gồm silymarin Trên mơ hình này, silymarin thường chọn làm th́c đối chứng với mức liều dao động từ 50 – 800 mg/kg Sự biến thiên tương đối của mức liều thể tác dụng bảo vệ gan của silymarin nghiên cứu trước có thể khác biệt liên quan đến tác nhân gây độc, chủng động vật sử dụng và đặc biệt là hàm lượng hoạt chất silibinin 34 nguyên liệu silymarin Do đó, để tính tốn xác liều của chế phẩn cũng để làm so sánh với chế phẩm khác, nhóm nghiên cứu đã tiến hành định lượng silibinin nguyên liệu silymarin Dựa kết định lượng, chúng đã lựa chọn khoảng liều của S-SMEDDS thí nghiệm thăm dò là – 50 mg/kg silibinin tương ứng khoảng 10 – 100 mg/kg silymarin toàn phần Đây là mức liều tương đương với phần lớn nghiên cứu đã công bố trước về tác dụng bảo vệ gan của silymarin đồng thời có cân nhắc đến sự tăng sinh khả dụng của chế phẩm so với dạng bào chế quy ước [65] Kết nghiên cứu thăm dò cho thấy mối tương quan nhất định liều dùng tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS Ngoại trừ mức liều mg/kg, S-SMEDDS đều thể tác dụng bảo vệ gan rõ rệt hai nhóm thơng sớ đánh giá chính của mơ hình hoạt đợ transaminase hút và hàm lượng MDA gan Ngoài ra, khoảng liều có tác dụng từ 10 – 50 mg/kg, tác dụng ức chế sản sinh MDA giảm rò rỉ AST, ALT có xu hướng tăng dần tăng liều Theo tổng quan y văn của chúng tôi, hầu chưa có báo cáo về tác dụng bảo vệ gan của silymarin mức liều tương đương 10 mg/kg silibinin đường uống việc S-SMEDDS thể tác dụng mức liều có thể liên quan đến sự vượt trội về sinh khả dụng đường uống của chế phẩm so với dạng bào chế thông thường Do đó, lựa chọn hai mức liều của S-SMEDDS cho thí nghiệm tiếp theo, bao gồm liều 10 mg/kg 25 mg/kg 4.2 Về kết tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa so với Legalon® mơ hình gây độc gan cấp bằng CCl4 Trong nghiên cứu này, chúng đã thực nghiên cứu so sánh đối đầu SSMEDDS và chế phẩm tham chiếu Legalon® Để hạn chế ảnh hưởng liên quan đến sự khác biệt về nguyên liệu, liều dùng của hai chế phẩm quy đổi theo hoạt chất chính silibinin dựa kết định lượng hàm lượng thực tế chế phẩm Các tiêu chí so sánh lựa chọn bao gồm hoạt độ AST, ALT huyết thanh, nồng độ MDA, GSH và SOD gan Đây là thông số đặc trưng phản ánh hai khía cạnh bệnh học điển hình nhất của tổn thương gan cho CCl4 là hoại tử tế bào gan stress oxy hóa Kết cho thấy sau ngày sử dụng với các mức liều 10 và 25 mg/kg/ngày, S-SMEDDS làm giảm mức độ hoại tử tế bào gan, thể thông qua ức chế tăng các enzym điểm tổn thương tế bào gan (AST và ALT) Bên cạnh đó, dạng bào chế này 35 cũng làm giảm tình trạng stress oxy hóa, một đặc điểm bệnh học đặc trưng của tổn thương gan CCl4 Tác dụng này thể thông qua giảm sản sinh MDA (sản phẩm giáng hóa cuối của quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào), cải thiện mức dự trữ tác nhân chống oxy hóa nội sinh gan bao gồm GSH và SOD Ngoại trừ hàm lượng GSH dịch nghiền đồng thể gan, các tác dụng kể ghi nhận với hai mức liều 10 và 25 mg/kg của S-SMEDDS Trong đó, tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm đối chiếu thể rõ rệt mức liều cao 25 mg/kg so với mức liều 10 mg/kg, nhiên mức liều cao Legalon® cũng cải thiện các tiêu chí AST, ALT, GSH và SOD So với chế phẩm đối chiếu Legalon®, tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS vượt trội mức liều thấp 10 mg/kg Tại mức liều này, chế phẩm đối chiếu cải thiện 1/5 tiêu chí (ALT) với S-SMEDDS 4/5 tiêu chí (AST, ALT, MDA SOD) Khi sử dụng với mức liều cao 25 mg/kg, mức độ cải thiện tởn thương gan CCl4 của Legalon® thấp đáng kể so S-SMEDDS (thơng qua tiêu chí AST, MDA, GSH và SOD) Do tác dụng bảo vệ gan của hai chế phẩm đều phụ thuốc rõ rệt vào liều, kết gợi ý rằng chế phẩm S-SMEDDS thể tác dụng mức liều thấp so với Legalon® Như vậy, cải thiện sinh khả dụng có mối tương quan với cải thiện dụng dược lý của silymarin Sự khác biệt về tác dụng bảo vệ gan của hai chế phẩm có thể hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa làm tăng tính thấm độ tan nước của silymarin dẫn tới tăng lượng dược chất hấp thu vào biểu mô ruột thông qua các chế kích thước giọt nhũ tương nhỏ làm tăng khả hấp thu trực tiếp của silymarin, nồng độ dạng tự của silymarin cao làm tăng chênh lệch nồng độ hai bên màng dẫn tới tăng vận chuyển dược chất đến tế bào biểu mô ruột Ngoài độ tan kém, sinh khả dụng đường uống của silymarin thấp và dao động còn silymarin có hiệu ứng qua gan bước một mạnh dẫn tới phần lớn lượng silymarin hấp thu liên hợp với acid glucoronid đươc thải trừ qua mật Thành phần của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa có chứa tá dược triglycerid mạch carbon dài làm tăng hấp thu của dược chất qua hệ bạch huyết, hạn chế lượng dược chất hấp thu vào tĩnh mạch cửa đổ vào gan Do đó, dạng bào chế này đã cải thiện nhược điểm của silymarin là hiệu ứng qua gan bước một mạnh thông qua tăng cường hấp thu dược chất qua hệ bạch huyết Tuy nhiên, cũng không thể loại trừ các nguyên nhân khác tá dược làm tăng tính thấm của dược chất vào tế bào gan, cũng sự tích lũy của 36 thuốc sử dụng đa liều nhất là đối với thuốc có chu kì gan – ruột silymarin Các giả thuyết này củng cố thêm các bằng chứng cho thấy chế bảo vệ gan của silymarin không giới hạn tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc tự mà có thể còn thông qua các chế khác chưa nghiên cứu đầy đủ ổn định màng tế bào gan, tăng hoạt tính của ARN polymerase, dẫn đến tăng tổng hợp protein thúc đẩy tái tạo tế bào gan Cải thiện sinh khả dụng có tương quan với cải thiện tác dụng dược lý nhiên sự tương quan này không hoàn toàn Khi sử dụng một mức liều 30 mg/kg, sinh khả dụng của S-SMEDDS tăng gấp khoảng 10 lần so với chế phẩm tham chiếu Legalon®, nhiên đánh giá tác dụng bảo vệ gan mức liều 25 mg/kg, mức độ của giảm hoạt độ AST huyết thanh, hoạt độ SOD, hàm lượng GSH và MDA gan so với lơ chứng bệnh nhóm điều trị bằng S-SMEDDS tương ứng cao gấp 1,3; 1,2; 2,2 lần so với chế phẩm tham chiếu Legalon® Ngun nhân dẫn tới sự tương quan khơng hồn tồn có thể hàm lượng silibinin silymarin toàn phần khác chế phẩm Dựa kết định lượng, chế phẩm S-SMEDDS, silibinin chiếm 56% silymarin toàn phần, đó giá trị này chế phẩm đối chiếu là 38% Nghiên cứu so sánh tác dụng bảo vệ gan của hai chế phẩm sử dụng một mức liều của silibinin hàm lượng của silibinin silymarin toàn phần của S-SMEDDS cao Legalon® nên với mợt mức liều silibinin, lượng silymarin của chế phẩm tham chiếu cao so với S-SMEDDS Ngoài silibinin, các thành phần flavonoid silymarin cũng có thể có tác dụng bảo vệ gan, đó cũng có thể là nguyên nhân dẫn tới tác dụng dược lý của S-SMEDDS không tăng tương ứng với mức độ cải thiện sinh khả dụng Ngoài ra, cũng không thể loại trừ khả tăng sinh khả dụng đường uống chủ yếu tăng độ tan của silibinin Silibinin đã biết tới là chất có hiệu ứng qua gan bước một mạnh, việc xác định các nồng độ silibinin liên hợp cũng là một yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu điều trị, nhiên việc phải thực phản ứng thủy phân trước định lượng khó thực hiện, tốn và bị ảnh hưởng nhiều yếu tố nên nhóm nghiên cứu chưa thể định lượng dạng liên hợp của silibinin đó sự tăng sinh khả dụng đường uống có thể chủ yếu S-SMEDDS làm tăng độ tan của silibinin, dẫn tới kết đánh giá sinh khả dụng chưa phản ánh chính xác tác dụng dược lý của hai chế phẩm Bên cạnh đó, nghiên cứu sinh khả dụng thực với liều nhất, 37 nghiên cứu tác dụng dược lý thực với chế độ liều lặp lại dẫn tới có thể có sự khác biệt về tích luỹ của thuốc gan, nhất là thuốc có chu kì gan - ruột kéo dài silibinin, cũng có thể là nguyên nhân có thể dẫn tới sự tương quan khơng hồn toàn của kết đánh giá sinh khả dụng và tác dụng dược lý Ngoài ra, nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng là nghiên cứu phức tạp, tốn kém, khó có thể tiến hành lặp lại nên cỡ mẫu của nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng thường nhỏ, đó sự khác về đặc tính sinh dược học của cá thể dẫn tới sự khác về đặc tính dược động học cá thể cũng có thể dẫn tới sự có sự khác biệt về kết đánh giá sinh khả dụng và tác dụng dược lý Không thế, nghiên cứu sinh khả dụng đánh giá thỏ, thỏ có thời gian lưu trữ thức ăn dài so với chuột đó sự khác biệt về nhu động ruột và thời gian lưu trữ thức ăn cũng có thể là nguyên nhân dẫn tới có sự khác biệt sinh khả dụng và tác dụng dược lý của hai chế phẩm Do đó, các thông số đánh giá sinh khả dụng của S-SMEDDS cần tiếp tục kiểm chứng các động vật thí nghiệm khác chó, khỉ,… Trong công thức của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa thường sử dụng các chất diện hoạt và đồng diện hoạt làm giảm sức căng bề mặt qua đó làm tăng độ tan của dược chất Công thức bào chế của S-SMEDDS có Transcutol sử dụng làm chất đồng diện hoạt Tuy nhiên, độc tính của Transcutol đã ghi nhận là một chất có độc tính tài liệu trước đó Nhìn chung, độc tính cấp của Transcutol báo cáo là rất thấp nhiều động vật thí nghiệm Tuy nhiên sử dụng một thời gian dài, tá dược này có thể gây các độc tính thận hình thành tinh thể oxalat, thiểu niệu, hoại tử ống thận cấp dẫn tới suy thận, xuất protein và hồng cầu nước tiểu, viêm bàng quang ngoài còn có một số tổn thương khác gan thiếu máu [13], [59] Ngoài ra, sử dụng với mức liều 20 ml/kg/ngày hỗn hợp bao gồm Transcutol/Labrafil/Labrasol (với tỷ lệ thể tích tương ứng là 2/4/4) chuột cống tuần , ngoài tác dụng không mong muốn thận, Delongeas và cộng sự còn ghi nhận tượng tăng hoạt độ ALT huyết [17] Trong thành phần của S-SMEDDS có chứa các tá dược bao gồm Transcutol, Labrafil, Poloxame 407 Cremophor RH40, tá dược này lựa chọn dựa khả làm tăng độ hòa tan nước và tăng vận chuyển silibinin qua hệ bạch huyết, nhiên độc tính của chúng chưa kiểm chứng Do đó, không thể loại trừ nguyên nhân tá dược có độc tính gan dẫn đến kết 38 đánh giá tác dụng dược lý không tăng tương ứng với kết đánh giá dược động học Mặt khác, silymarin dùng để điều trị một số tổn thương gan mạn tính xơ gan, viêm gan virut, gan nhiễm mỡ nên cần tiếp tục đánh giá độc tính trường diễn và bán trường diễn của S-SMEDDS động vật thí nghiệm để đánh giá tiềm ứng dụng thực tiễn của dạng bào chế này Như vậy, dạng bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa ngoài việc cải thiện đáng kể các thông số dược động học AUC, Cmax, Tmax, đã làm tăng đáng kể tác dụng dược lý của silibinin so với chế phẩm tham chiếu S-SMEDDS đảm bảo tác dụng sử dụng liều thấp so với liều thông thường của silymarin đem lại nhiều lợi ích hạn chế tác dụng phụ của thuốc, giảm liều thuốc qua đó giảm tần suất sử dụng thuốc, dẫn tới tăng tuân thủ điều trị, giảm nhầm lẫn thuốc bệnh nhân dùng quá nhiều loại thuốc cũng làm giảm chi phí điều trị Do đó, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa có thể coi một dạng bào chế tiềm dành cho các thuốc có độ tan và hiệu ứng qua gan bước một mạnh silymarin Bên cạnh đặc điểm ưu việt về khả hấp thu cũng tăng vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết, dạng bào chế này còn tồn một số nhược điểm về độ ổn định cấu trúc hóa lý của hệ là dạng hỗn dịch có pha phân tán là polyme, quá trình bảo quản polyme có thể tách ra, vón cục, cũng thành phần thân dầu sử dụng công thức dễ bị oxy hóa làm giảm hiệu của hệ Do đó, công thức bào chế của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa cần tiếp tục hoàn thiện 39 ``KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã lựa chọn mức liều có tác dụng bảo vệ gan S-SMEDDS mơ hình gây độc gan cấp CCl4 Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hai mức liều của S-SMEDDS để so sánh tác dụng bảo vệ gan mức liều tương đương của chế phẩm đới chiếu Legalon® mơ hình gây đợc gan cấp bằng CCl4 là 10 và 25 mg silibinin/kg cân nặng thơng qua tiêu chí (AST, ALT, MDA) Tác dụng bảo vệ gan S-SMEDDS so với Legalon® mơ hình gây độc gan cấp CCl4 So với chế phẩm đới chiếu Legalon®, tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS vượt trội ỏ với mức liều thấp 10 mg/kg Tại mức liều này, S-SMEDDS cải thiện nhiều tiêu chí đánh giá tổn thương gan CCl4 so với Legalon® (tiêu chí AST, ALT, MDA SOD) Khi sử dụng với mức liều cao 25 mg/kg, mức độ cải thiện tổn thương gan CCl4 của Legalon® thấp đáng kể so S-SMEDDS (thơng qua tiêu chí AST, MDA, GSH SOD) Những kết gợi ý rằng chế phẩm S-SMEDDS thể tác dụng mức liều thấp so với Legalon® 40 KIẾN NGHỊ Tiếp tục hồn thiện cơng thức bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin Tiếp tục nghiên cứu độc tính trường diễn và bán trường diễn của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt C Bộ môn Bào chế (2004), "Một số chuyên đề bào chế đại", Trường đại học Dược Hà Nội, pp 124-187 Hải Lê Xuân Hải, Trần Thị Oanh (2006), "Tác dụng bảo vệ gan của bài thuốc VID mô hình gây viêm gan bằng carbon tetrachlorid cḥt nhắt trắng", Tạp chí dược học, 46(2), pp 19-22 Lợi Vũ Đức Lợi, Lê Thị Ngọc Thảo và cộng sự (2013), "Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn dịch chiết Flavonoid từ lá đầu trồng tỉnh Hà Giang", Tạp chí dược liệu, 6, pp 385-389 Mai Mạc Thị Mai (2017), "Hoàn thiện mô hình gây độc cấp bằng carbon tetraclorid chuột nhắt trắng và áp dụng đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm Vượng Can", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ pp Trang Hoàng Thị Trang (2017), "Nghiên cứu phát triển hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin sử dụng copolyme làm chất ức chế kết tinh", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội., pp Viện Dược liệu (2006), "Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược liệu," NXB Khoa học Kỹ thuật, pp 171-184 Abenavoli L., Capasso R., et al (2010), "Milk thistle in liver diseases: past, present, future", Phytother Res, 24(10), pp 1423-32 Abourashed Ehab A, Mikell Julie R, et al (2012), "Bioconversion of silybin to phase I and II microbial metabolites with retained antioxidant activity", Bioorganic & medicinal chemistry, 20(9), pp 2784-2788 Al-Rasheed N., Faddah L., et al (2016), "Protective Effects of Silymarin, Alone or in Combination with Chlorogenic Acid and/or Melatonin, Against Carbon Tetrachloride-induced Hepatotoxicity", Pharmacogn Mag, 12(Suppl 3), pp S337-45 10 Barzaghi N., Crema F., et al (1990), "Pharmacokinetic studies on IdB 1016, a silybin- phosphatidylcholine complex, in healthy human subjects", Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 15(4), pp 333-8 11 Biedermann D., Vavrikova E., et al (2014), "Chemistry of silybin", Nat Prod Rep, 31(9), pp 1138-57 12 Bijak M (2017), "Silybin, a Major Bioactive Component of Milk Thistle (Silybum marianum L Gaernt.)-Chemistry, Bioavailability, and Metabolism", Molecules, 22(11), pp 13 Bingham E., Cohrssen, B (2012), "Patty’s Toxicology", John Wiley & Sons, Inc 6, pp 641–787 14 Chang W C., Hung C T., et al (2018), "Amelioration of carbon tetrachloride- induced hepatic injury by emulsified Antrodia extract", Iran J Basic Med Sci, 21(3), pp 230-235 15 Chen Z Q., Liu Y., et al (2012), "Improved oral bioavailability of poorly water- soluble indirubin by a supersaturatable self-microemulsifying drug delivery system", Int J Nanomedicine, 7, pp 1115-25 16 Choi J H., Kim D W., et al (2011), "Protective effects of hyperoside against carbon tetrachloride-induced liver damage in mice", J Nat Prod, 74(5), pp 1055-60 17 Delongeas J L., de Conchard G V., et al (2010), "Assessment of Labrasol/Labrafil/Transcutol (4/4/2, v/v/v) as a non-clinical vehicle for poorly watersoluble compounds after 4-week oral toxicity study in Wistar rats", Regul Toxicol Pharmacol, 57(2-3), pp 284-90 18 El-Samaligy M S., Afifi N N., et al (2006), "Evaluation of hybrid liposomes- encapsulated silymarin regarding physical stability and in vivo performance", Int J Pharm, 319(1-2), pp 121-9 19 Fraschini Franco, G Demartini, et al (2002), "Pharmacology of silymarin", " Clinical drug investigation,, 22(1), pp 51-65 20 Fuchs E C., Weyhenmeyer R., et al (1997), "Effects of silibinin and of a synthetic analogue on isolated rat hepatic stellate cells and myofibroblasts", Arzneimittelforschung, 47(12), pp 1383-7 21 Ganie S A., Haq E., et al (2011), "Antioxidant and Protective Effect of Ethyl Acetate Extract of Podophyllum Hexandrum Rhizome on Carbon Tetrachloride Induced Rat Liver Injury", Evid Based Complement Alternat Med, 2011, pp 22 Gao P., Akrami A., et al (2009), "Characterization and optimization of AMG 517 supersaturatable self-emulsifying drug delivery system (S-SEDDS) for improved oral absorption", J Pharm Sci, 98(2), pp 516-28 23 Gao P., Guyton M E., et al (2004), "Enhanced oral bioavailability of a poorly water soluble drug PNU-91325 by supersaturatable formulations", Drug Dev Ind Pharm, 30(2), pp 221-9 24 Gao P., Morozowich W (2006), "Development of supersaturatable self- emulsifying drug delivery system formulations for improving the oral absorption of poorly soluble drugs", Expert Opin Drug Deliv, 3(1), pp 97-110 25 Ghosh Amitava, Ghosh Tanmoy, et al (2010), "Silymarin- A review on the Pharmacodynamics and Bioavailability Enhancement Approaches", Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2(10), pp 348-355 26 Guo Y., Liang X., et al (2017), "Hepatoprotective effects of Yulangsan flavone against carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatic fibrosis in rats", Phytomedicine, 33, pp 28-35 27 Giri Archana, Dhingra Vikas, et al (2001), "Biotransformations using plant cells, organ cultures and enzyme systems: current trends and future prospects", Biotechnology advances, 19(3), pp 175-199 28 Ha B J., Lee J Y (2003), "The effect of chondroitin sulfate against CCl4- induced hepatotoxicity", Biol Pharm Bull, 26(5), pp 622-6 29 Haus D.J., Fogal, S.E., Ficorilli, J.V., Price, C.A., Roy, T., Jayara, A.A., Keirns (1998), "Lipid-based delivery systems for improving the bioavailability and lymphatic transport of a poorly water-soluble LTB4 inhibitor", J Pharm Sci, 87, pp 164–169 30 Hauss D J (2007), "Oral lipid-based formulations", Adv Drug Deliv Rev, 59(7), pp 667-76 31 Ingawale D K., Mandlik S K., et al (2014), "Models of hepatotoxicity and the underlying cellular, biochemical and immunological mechanism(s): a critical discussion", Environ Toxicol Pharmacol, 37(1), pp 118-33 32 Janakat S., Al-Merie H (2002), "Optimization of the dose and route of injection, and characterisation of the time course of carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in the rat", J Pharmacol Toxicol Methods, 48(1), pp 41-4 33 Javed S., Kohli K., et al (2011), "Reassessing bioavailability of silymarin", Altern Med Rev, 16(3), pp 239-49 34 Kamal Muhammad Shahzad, Razzak Shaikh A, et al (2016), "Catalytic oxidation of volatile organic compounds (VOCs)–A review", Atmospheric Environment, 140, pp 117-134 35 Koh P H., Mokhtar R A., et al (2012), "Antioxidant potential of Cymbopogon citratus extract: alleviation of carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative stress and toxicity", Hum Exp Toxicol, 31(1), pp 81-91 36 Konig J., Nies A T., et al (1999), "Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family: localization, substrate specificity, and MRP2mediated drug resistance", Biochim Biophys Acta, 1461(2), pp 377-94 37 Křen Vladimír, Gažák Radek, et al (2009), "Chemoenzymatic preparative separation of silybins A and B", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 61(3e4), pp 247-251 38 Leak L V (1976), "The structure of lymphatic capillaries in lymph formation", Fed Proc, 35(8), pp 1863-71 39 Li F., Hu R., et al (2017), "Self-microemulsifying drug delivery system for improving the bioavailability of huperzine A by lymphatic uptake", Acta Pharm Sin B, 7(3), pp 353-360 40 Li Fang, Hu Rongfeng, et al (2017), "Self-microemulsifying drug delivery system for improving the bioavailability of huperzine A by lymphatic uptake", Acta pharmaceutica sinica B, 7(3), pp 353-360 41 Li X., Yuan Q., et al (2010), "Development of silymarin self-microemulsifying drug delivery system with enhanced oral bioavailability", AAPS PharmSciTech, 11(2), pp 672-8 42 Lorenz D., Lucker P W., et al (1984), "Pharmacokinetic studies with silymarin in human serum and bile", Methods Find Exp Clin Pharmacol, 6(10), pp 655-61 43 Luo G., Garner C E., et al (2007), "Effect of DPC 333 [(2R)-2-{(3R)-3-amino- 3-[4-(2-methylquinolin-4-ylmethoxy)phenyl]-2-oxopyrrolidin- 1-yl}-N-hydroxy-4methylpentanamide], a human tumor necrosis factor alpha-converting enzyme inhibitor, on the disposition of methotrexate: a transporter-based drug-drug interaction case study", Drug Metab Dispos, 35(6), pp 835-40 44 Magliulo E., Carosi P G., et al (1973), "Studies on the regenerative capacity of the liver in rats subjected to partial hepatectomy and treated with silymarin", Arzneimittelforschung, 23, pp Suppl:161-7 45 Manibusan M K., Odin M., et al (2007), "Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review", J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev, 25(3), pp 185-209 46 Miranda S R., Lee J K., et al (2008), "Hepatic metabolism and biliary excretion of silymarin flavonolignans in isolated perfused rat livers: role of multidrug resistance-associated protein (Abcc2)", Drug Metab Dispos, 36(11), pp 2219-26 47 Muriel P., Garciapina T., et al (1992), "Silymarin protects against paracetamol- induced lipid peroxidation and liver damage", J Appl Toxicol, 12(6), pp 439-42 48 Muriel P., Mourelle M (1990), "Prevention by silymarin of membrane alterations in acute CCl4 liver damage", J Appl Toxicol, 10(4), pp 275-9 49 Nickovic V P., Novakovic T., et al (2018), "Pre- vs post-treatment with melatonin in CCl4-induced liver damage: Oxidative stress inferred from biochemical and pathohistological studies", Life Sci, pp 50 Niu Liman, Cui Xueling, et al (2016), "Involvement of TGF-β1/Smad3 signaling in carbon Tetrachloride-induced acute liver injury in mice", PloS one, 11(5), pp e0156090 51 Porter C J., Trevaskis N L., et al (2007), "Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs", Nat Rev Drug Discov, 6(3), pp 23148 52 Pouton C W., Porter C J (2008), "Formulation of lipid-based delivery systems for oral administration: materials, methods and strategies", Adv Drug Deliv Rev, 60(6), pp 625-37 53 Pradhan S C., Girish C (2006), "Hepatoprotective herbal drug, silymarin from experimental pharmacology to clinical medicine", Indian J Med Res, 124(5), pp 491504 54 Phan C T., Tso P (2001), "Intestinal lipid absorption and transport", Front Biosci, 6, pp D299-319 55 Qi J., Zhuang J., et al (2017), "In vivo fate of lipid-based nanoparticles", Drug Discov Today, 22(1), pp 166-172 56 Qu L., Xin H., et al (2012), "Hepatoprotective Activity of the Total Saponins from Actinidia valvata Dunn Root against Carbon Tetrachloride-Induced Liver Damage in Mice", Evid Based Complement Alternat Med, 2012, pp 216061 57 Salamone F., Galvano F., et al (2012), "Silibinin modulates lipid homeostasis and inhibits nuclear factor kappa B activation in experimental nonalcoholic steatohepatitis", Transl Res, 159(6), pp 477-86 58 Song Z., Deaciuc I., et al (2006), "Silymarin protects against acute ethanol- induced hepatotoxicity in mice", Alcohol Clin Exp Res, 30(3), pp 407-13 59 Sullivan D W., Jr., Gad S C., et al (2014), "A review of the nonclinical safety of Transcutol(R), a highly purified form of diethylene glycol monoethyl ether (DEGEE) used as a pharmaceutical excipient", Food Chem Toxicol, 72, pp 40-50 60 Takada Yoshikazu, Noguchi Tomoo, et al (1982), "Superoxide dismutase in various tissues from ratbits bearing the Vx-2 carcinoma in the maxillary sinus", Cancer Research, 42(10), pp 4233-4235 61 Tsai J H., Liu J Y., et al (2008), "Effects of silymarin on the resolution of liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats", J Viral Hepat, 15(7), pp 508-14 62 Theodosiou Eleni, Purchartová Kateřina, et al (2014), Bioavailability of silymarin flavonolignans: Drug formulations and biotransformation, pp 1-18 63 Trevaskis N L., Charman W N., et al (2008), "Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update", Adv Drug Deliv Rev, 60(6), pp 702-16 64 van Wenum E., Jurczakowski R., et al (2013), "Media effects on the mechanism of antioxidant action of silybin and 2,3-dehydrosilybin: role of the enol group", J Org Chem, 78(18), pp 9102-12 65 Wang M., Zhang X J., et al (2017), "Hepatoprotective properties of Penthorum chinense Pursh against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice", Chin Med, 12, pp 32 66 Wasowicz W., Neve J., et al (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clin Chem, 39(12), pp 2522-6 67 Weber L W., Boll M., et al (2003), "Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model", Crit Rev Toxicol, 33(2), pp 105-36 68 Wei Yinghui, Ye Xiaoli, et al (2012), "Enhanced oral bioavailability of silybin by a supersaturatable self-emulsifying drug delivery system", Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 396(22-28), pp 69 Wen Z., Dumas T E., et al (2008), "Pharmacokinetics and metabolic profile of free, conjugated, and total silymarin flavonolignans in human plasma after oral administration of milk thistle extract", Drug Metab Dispos, 36(1), pp 65-72 70 Yang G., Zhao Y., et al (2015), "Enhanced oral bioavailability of silymarin using liposomes containing a bile salt: preparation by supercritical fluid technology and evaluation in vitro and in vivo", Int J Nanomedicine, 10, pp 6633-44 71 Yu J N., Zhu Y., et al (2010), "Enhancement of oral bioavailability of the poorly water-soluble drug silybin by sodium cholate/phospholipid-mixed micelles", Acta Pharmacol Sin, 31(6), pp 759-64 72 Zhao J., Agarwal R (1999), "Tissue distribution of silibinin, the major active constituent of silymarin, in mice and its association with enhancement of phase II enzymes: implications in cancer chemoprevention", Carcinogenesis, 20(11), pp 2101-8 ... PHAN THỊ THÚY HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1301131 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SILYMARIN HỆ TỰ NHŨ HÓA SIÊU BÃO HỊA TRÊN MƠ HÌNH GÂY ĐỘC GAN CẤP BẰNG CCl4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:... liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 34 4.2 Về kết tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão... của silymarin thấp là độ tan nước và có hiệu ứng qua gan bước mô t mạnh 1.3 Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 1.3.1 Cơ chế gây độc gan cấp bằng CCl4 Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4