Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐỀ TÀI : BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO MÃ SỐ CS 2005 23 92 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Trần Thanh Thúy TP HỒ CHÍ MINH - 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐỀ TÀI : BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO MÃ SỐ CS 2005 23 92 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Trần Thanh Thúy TP HỒ CHÍ MINH - 2006 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Lƣợc sử nghiên cứu probiotic 1.1.2 Thành phần đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng probiotic 1.1.3 Cơ chế tác động probiotic 1.1.4 Vai trò probiotic 1.1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic TG VN 11 1.2 Sơ lƣợc vi sinh vật probiotic 13 A Vi khuẩn lactic 13 1.2.1 Đặc điểm hình thái 14 1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic 14 1.2.3 Quá trình lên men lactic 16 1.2.3.1 Lên men lactic đồng hình 16 1.2.3.2 Lên men Lactic dị hình 17 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn lactic 17 1.2.4.1 Nguồn cacbon 17 1.2.4.2 Nguồn nitơ 18 1.2.4.3 Các muối vô 18 1.2.4.4 Các chất sinh trƣởng 18 1.2.4.5 Oxy 19 1.2.4.6 Nhiệt độ 19 1.2.4.7 pH 20 1.2.5 ứng dụng vi khuẩn lactic sản xuất chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20 B Nấm men 21 1.3 Tổng quan heo 24 1.3.1 Vị trí phân loại heo 24 1.3.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa heo 24 1.3.2.1 Đặc điểm máy tiêu hóa 24 1.3.2.2 Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột 25 1.3.3 Các bệnh đƣờng ruột heo 25 1.3.3.1 Bệnh tiêu chảy heo E coli 25 1.3.3.2 Tiêu chảy Saimonella (Phó thƣơng hàn) 26 1.3.4 Các biện pháp phòng điều trị 26 1.3.4.1 Phòng bệnh 26 1.3.4.2 Điều trị 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Môi trƣờng (xem Phần phụ lục) 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch [13] 29 2.2.2 Xác định khả sinh axit tổng phƣơng pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37] 29 2.2.3 Định lƣợng axit lactic phƣơng pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25], [36], [37] 30 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 30 2.2.5 Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định phƣơng pháp khoan lỗ thạch [12], [13], [25], [36], [37] 32 2.2.6 Hoạt tính đề kháng với chất kháng sinh vi khuẩn lactic 33 2.2.7 Phƣơng pháp bảo quản giống VK lactic phƣớng pháp đông khô 34 2.2.8 Xác định gián tiếp mật độ tế bào phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc mọc môi trƣờng thạch [12], [13], [36], [37] 35 2.2.9 Khảo sát sinh trƣởng và yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng vi khuẩn lactic phƣơng pháp đo mật độ quang [12], [13] 35 2.2.10 Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng đến khả tạo sinh khối tế bào nấm men phƣơng pháp cân sinh khối tƣơi 38 2.2.11 Phƣơng pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37] 38 2.2.12 Tạo chế phẩm probiotic 39 2.2.13 Phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm heo sau cai sữa 40 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng VSV có đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm probiotic 42 3.1.1 Phân lập sơ tuyển chọn Vklactic 42 3.1.2.Tuyển chọn chủng VK lactic - probiotic 42 3.1.2.1 Khả sinh axit lactic chủng 43 3.1.2.2 Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định 44 3.1.2.3 Khảo sát hoạt tính đề kháng với chất kháng sinh 46 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 48 3.2.1 Các đặc điểm hình thái chủng B, N4, L2 48 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng B, N4, L2 48 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men 52 3.3.1 Khả đề kháng kháng sinh chủng Saccharomyces cerevisiae 52 3.3.2 Khảo sát khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định 53 3.3.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men 54 3.4 Ảnh hƣởng số điều kiện môi trƣờng đến tạo thành sinh khối chủng nghiên cứu 55 A Vi khuẩn lactic 55 3.4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy 55 3.4.2 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng đến tạo thành sinh khối chủng vi khuẩn lactic 57 3.4.2.1 Nhiệt độ nuôi cấy 57 3.4.2.2 pH ban đầu 59 3.4.2.3 Nguồn thức ăn nitơ 60 3.4.2.4 Nồng độ cao nấm men 62 3.4.2.5 Nguồn thức ăn cacbon 63 3.4.2.6 Nồng độ saccharose 64 3.4.3 Động thái trình tạo sinh khối tế bào chủng vi khuẩn lactic điều kiện tối ƣu 65 B Nấm men 66 3.5 Tạo chế phẩm probiotic 68 3.5.1 Đông khô chủng VSV 68 3.5.2 Xác định tỷ lệ phối trộn chủng chế phẩm 68 3.5.3 Đóng gói tạo chế phẩm probiotic 71 3.6 Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm 72 3.6.1 Khả sống sót chủng vsv sau trình đơng khơ 72 3.6.2 Khả đối kháng với VK kiểm định chủng chế phẩm 73 3.7 Xây dựng quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm probiotic 75 3.8 Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 heo sau cai sữa 76 3.8.1 Tỷ lệ tiêu chảy heo sau cai sữa 76 3.8.2 Tăng trọng heo sau cai sữa 78 3.8.3 Hệ số tiêu tốn thức ăn 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 84 PHỤ LỤC i BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT CNSH Công nghệ sinh học ĐHNN Đại học Nông nghiệp ĐHQG Đại học Quốc gia ĐHSP Đại học Sƣ phạm MT Môi trƣờng PTN Phòng thí nghiệm SHPT Sinh học phân tử TB Tế bào TBC Tế bào chất TG Thế giới VK Vi khuẩn VN Việt Nam VSV Vi sinh vật Mẫu 1.10 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo Mã số: CS.2005.23.92 Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy Tel:0908 402 475 Email: thanhthuydhsp2000@yahoo.com Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM Cơ quan cá nhân phối hợp thực : TS Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội TS Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM Thời gian thực hiện: năm Mục tiêu: Sử dụng số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế phẩm có khả phòng trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu Nội dung chính: - Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic, nấm men có hoạt tính cần thiết chủng probiotic - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân loại chủng VSV tuyển chọn - Nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho tạo sinh khối chủng - Tạo chế phẩm probiotic - Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm - Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm heo sau cai sữa Thành đạt đƣợc (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội): - Đã có báo : "Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02", Tạp chí Khoa học Trƣờng ĐHSP TP.HCM năm 2006 " Đặc điểm chủng vi khuẩn lactic dùng chế phẩm probiotic phòng trị bệnh tiêu chảy cho heo," Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trƣờng ĐHBK Hà Nội, năm 2006) - Hoàn thành luận văn Thạc Sĩ Sinh học, cử nhân Sinh học Mẫu 1.10 SUMMARY Project Title: Onfirst study on utilliation microorganisms stains to produce the preparation probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs Code number: CS.2005.23.92 Coordinator: Dr Trần Thanh Thủy Tel: 0908 402 475 Implementing Institution : Hồ Chí Minh city University of Pedagogy Cooperating Institution(s): Dr Nguyễn Thị Hoài Hà - Center of Biotechnology Việt Nam national University, Hà Nội Dr Võ Thị Hạnh - Institute of Tropical Biology, National center for Science and Technology of Việt Nam Duration: from 6/ 2005 to 6/2006 Objectives: On first study on utilization microorganisms stains to produce the preparation probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs Main contents: - Isolation and selection of some acid lactic bacteria, yeast strains with high probiotic activity - Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains - Studies the optimal conditions for their receiving biomass - Research on technology to produce probiotic - To appraise the quality of products - On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls Results obtained : + " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20th scientfic conference Ha Noi University of Technology, 10/2006 + "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02, Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006 + Finish dissertation of Biology master, dỉssertation Biology bachelors MỞ ĐẦU Đã từ lâu, VK lactic nấm men vốn tiếng với vai trò quan trọng thực phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe ngƣời Những năm gần đây, nhóm VSV đƣợc biết đến nhiều với chức "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế dịch bệnh cho ngƣời vật ni Probiotic chế phẩm có bổ sung vi sinh vật sống có lợi giúp cải thiện cân hệ VSV tự nhiên nơi đƣờng ruột, có khả cạnh tranh đối kháng với mầm bệnh, tiết chất trung hòa độc tố, tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, bổ sung dƣỡng chất (protein, khống, vitamin), kích thích miễn dịch thể ngƣời nhƣ vật nuôi Trong chăn nuôi heo, bệnh tiêu chảy bệnh phổ biến, gây thiệt hại không nhỏ đến suất chất lƣợng sản phẩm nuôi Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh thƣờng dẫn đến tƣợng loạn khuẩn khiến tiêu chảy kéo dài với hậu nghiêm trọng cho sức khỏe ngƣời nhƣ môi trƣờng sinh thái Phƣơng pháp hữu hiệu khắc phục tình trạng tái lập cân hệ vi khuẩn đƣờng ruột cách bổ sung hệ vi khuẩn có lợi dƣới dạng chế phẩm probiotic Phòng bệnh chế phẩm tiền sinh học hay gọi probiotic nhằm tăng cƣờng khả tự đề kháng bệnh cho vật ni cách làm có hiệu lâu bền an toàn sinh học Trên thị trƣờng lƣu hành nhiều loại chế phẩm probiotic ngoại nhập nhƣ Bye (Mỹ), Neo-Perk-Porcine (Anh), Lacfeed 66G (Nhật), cho kết tốt nhƣng khơng ổn định giá thành cao Do đó, việc nghiên cứu sử dụng VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc phục tình trạng việc làm cần thiết điều kiện Đó lý khiến chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo chế phẩm Probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo" Mục tiêu đề tài: Sử dụng số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả phòng trị bệnh đƣờng ruột cho heo hiệu Nhiệm vụ đề tài: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic, nấm men có hoạt tính cần thiết chủng probiotic Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân loại chủng VSV tuyển chọn Nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho tạo sinh khối chủng Xác định tỷ lệ tổ hợp giống tạo chế phẩm probiotic Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm heo sau cai sữa Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mô PTN Đề tài thực tại: - Phòng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trƣờng ĐHSP Tp.HCM - Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM - Phòng thí nghiệm CNSH SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG Hà Nội - Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trại chăn ni heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng Khả đề kháng với Đề kháng mạnh với kháng kháng sinh sinh (Neomycin, Axit atidixic,Kanamycin, Gentamycin Ampicillin, Ctoramphenicol, Noefloxacin, Tetracylin) , Khả đối khắng vđỉ Đề kháng mạnh với E vi khuẩn kiểm dinh coli, Samonella typhymurium, Samonelia choieraesuis Đề kháng mạnh với Bacillus subtilis, Streptococcus sp., Sacrina lutea So sánh đặc điểm chủng nấm men Saccharomyces sp.02 với đặc điểm chung chi Saccharomyces theo khoá phân loại Lodder (1971), Cletus p Kurtzman (1998) chúng có đặc điểm tƣơng đồng Do vậy, chủng nấm men Saccharomyces sp.02 thuộc chi Saccharomyces Kết xác định so sánh bình tự gen rADN 16S chủng Saccharomyces sp.02 với bình tự gen rADN 16S đƣợc đăng ký ngân hàng liệu gen Nhật Bản cho thấy chủng có độ tƣơng đồng cao tới 99% so với lồi Saccharomyces cerevisiae (phòng Thí nghiệm SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG Hà Nội) Từ kết luận chủng thuộc lồi Saccharomyces cerevisiae 3.4 Ảnh hƣởng số điều kiện môi trƣờng đến tạo thành sinh khối chủng nghiên cứu A VI KHUẨN LACTIC 3.4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy Thời gian( giờ) Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng MT nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng B Thời gian ( giờ) Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng MT nuối cấy đến tạo thành sinh khối Thời gian ( giờ) Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng MT nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng L2 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy Thời gian ( giờ) Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tạo thành sinh khối chủng L2 3.4.3 Ảnh hƣởng pH ban đầu Thời gian ( giờ) Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng pH ban díu đến tạo thành sinh khối chủng L2 3.4.4 Ảnh hƣởng nguồn thức ăn nitơ Thời gian ( giờ) Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng nguồn thức ăn nitơ đến tạo (hành sinh khối chủng B 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ cao nấm men Thời gian ( giờ) Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến tạo thành sinh khối chủng L2 10 3.4.6 Ảnh hƣởng nguồn thức ăn cacbon Thời gian (giờ) Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng nguồn thức ăn cacbon đến tạo thành sinh khối chủng L2 3.4.7 Ảnh hƣởng nồng độ saccharose Thời gian ( giờ) Biểu đồ 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ saccharose đến tạo thành sinh khối chủng L2 3.4.8 Động thái trình tạo sinh khối tế bào chủng vi khuẩn lactic điều kiện tối ƣu Bảng 3.3 Động thái trình tạo sinh khối, sinh axit lactic vặ độ pH chủng VK lactic Thời gian (giờ) 12 18 24 30 36 42 48 Các giá trị N4 B OD600 0,149 1,517 2,214 2.370 2,422 2,466 2,482 2,482 2,515 pH 6,019 4,332 3,577 3,490 3,431 3,426 3,401 3,390 3,386 H lƣợng a lactic OD600 (g/l) 0,198 0,441 1,062 1,224 1,341 1,395 1,431 1,449 1,467 0,157 1,635 2,157 2,242 2.346 2,395 2.395 2,395 2,482 pH 6,011 4.252 3,539 3.463 3.413 3,411 3,406 3.401 3,389 H lƣợng a lactic (g/l) 0,207 0,459 1,053 1,260 1,314 1,359 1,404 1,422 1,440 L2 OD600 0,131 0,586 1,005 1,430 1,827 1,974 2,016 2,054 2,121 pH 5,360 4,568 3,685 3,606 3,585 3,563 3,517 3,502 3,476 H.lƣựng a lactic (g/l) 0,288 0,414 0,981 1,134 1,179 1,224 1,242 1,278 1,332 11 Bảng 3.4 Tổng hợp điều kiện để thu sinh khối chủng VK lactic Điền kiện tối ƣu MT thay pH ban đầu Nguồn N Tỷ lệ cao NM (%) Nguồn C Tỷ lệ saccarose (%) Nhiệt độ MT(0C) Thời gian thu sinh khối (h) Chủng B Nƣớc cà chua 6-6.5 Cao nấm men -1,5 Saccarose 1-1.5 30-350C 18-30h Chủng N4 Nƣớc cà chua 6-6,5 Cao nấm men -1.5 Saccarose 1-1,5 30-350C 18-30h Chủng L2 Nƣớc cà chua 5,5 -6,0 Cao nấm men -2 Saccarose -2 35 - 400c 24-3 6h B NẤM MEN Kết khảo sát ảnh hƣởng MT đến tạo thành sinh khối chủng Sac cerevisiae, xác định đƣợc điều kiện tối nhƣ sau: - Môi trƣờng cao nấm men - Tỷ lệ giống cấy ban đầu 10% - Nhiệt độ 350C - pH ban đầu 6,0 - Chế độ lắc thơng khí 170 vòng/phút - Nồng độ cao nấm men 0,3% - Nồng độ saccharose thích hợp 3,5% - Thời gian thu sinh khối tốt 18 Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến tạo thành sinh khối nấm men Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng cường độ thơng khí đến tạo sinh khối nấm men 12 Đồ thị 3.7 Đồ thị tăng trưởng cùa Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng pH lên tạo chủng nấm men loại môi thảnh sinh khối chúng nấm men trường 3.5 Tạo chế phẩm probiotic 3.5.1 Đơng khơ chủng VSV Mục đích việc đơng khơ chủng VSV nghiên cứu nhiệm vụ bảo quản giếng mà đƣợc dùng làm nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic Các chủng B, N4 L2, đƣợc nuôi MT nƣớc chiết cà chua với điều kiện tối ƣu tới pha ổn định (24 đến 36 giờ), ly tâm (3500 vòng/15 phút) thu sinh khối Chủng nấm men đƣợc nuôi MT cao nấm men điều kiện tối ƣu tới pha ổn định (18 - 21h), ly tâm thu sinh khối Thực đông khơ chủng Mẫu VK Iactic đơng khơ có dạng bột mịn, màu trắng sữa mùi đặc trƣng Mẫu nấm men đơng khơ có dạng bột mịn, màu ƣấng ngà Cố thể bảo quản chế phẩm nhiệt độ phòng (300C) tủ lạnh (40C) Hình 3.7 Đơng khô chủng VK lactic (a)và chủng Sac cerevisiae (b) 13 3.5.2 Xác định tỷ lệ phối trộn chủng chế phẩm 3.5.2.1 Chế phẩm P-SP-01 Bảng 3.5 Hoạt tính đối kháng tỷ lệ phối trộn với chủng VK kiểm định (D - d, mm) Tỷ lệ phối trộn Khả đối kháng tỷ lệ phối trộn với VK kiểm định (D d, mm) VK Kiểm định E coli S typhimurium S choleraesuis Serratia sp Streptococcus sp Bacttlus subtilis 1:1:1 2:1:1 1:2:1 1:1:2 15 14 25 11 26 25 15 14 20 12 28 25 19 15 29 17 31 28 14 13 19 15 29 24 3.5.2.2 Chế phẩm P-SP-02 Bảng 3.6 Khả đối kháng VK kiểm định tỷ lệ phối trộn Vi khuẩn kiểm định E coli s choleraesuis Khả đối kháng VKKD tỷ lệ phối trộn (D - d, mm) :1 :1,5 1,5 : 1 :2 23 21 30 27 26 25 24 22 Hình 3.8 Khả đối kháng với vsv kiểm định tổ hợp giống (VK lactic/nấm men) : 1,5 3.5.3 Đóng gói tạo chế phẩm probiotic Trộn sinh khối Lac agilis : Lac acidophilus : Lac salivarius theo tỷ lệ 1:2: Enzim a amylase protease viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp đƣợc kiểm tra hoạt tính trƣớc sử dụng Phối trộn loại enzim theo tỷ lệ 1: Hoạt tính enzym α-amylase đƣợc kiểm tra phƣơng pháp Smith & Roe, kết đạt 1453,963 UI (mg tinh bột/g/phút) Hoạt tính enzym protease đƣợc kiểm tra phƣơng pháp Anson cải tiến, kết đạt 21.867 Anson (μmol Tyrosin/g/phút) 14 Sinh khối chủng VK lactic trộn với sinh khối nấm men theo tỷ lệ 1:1,5 Các nguyên liệu đƣợc đƣa vào máy ƣộn siêu tốc tự động đóng gói chế phẩm bao nhơm với lƣợng 25g/gói * Chế phẩm probiotic P-SP-01 gồm : - Sinh khối chủng VK Iactic : 10g - Enzim α amylase protease(tỷ lệ 1:1): 15g * Chế phẩm probiotic P-SP- 02 gồm : - Sinh khối chủng VK lactic nấm men : 10g - Enzim protease, amylase (tỷ lệ 1:1) : 15g Bảo quản chế phẩm ỏ nhiệt độ phòng hay tủ lạnh (40C) Hình 3.9 Chế phẩm probiotic P-SP-02 3.6 Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm 3.6.1 Khả sống sót chủng VSV sau q trình đơng khơ Chất lƣợng hiệu sử dụng chế phẩm phụ thuộc nhiều vào khả sống sốt chủng VSV đƣợc sử dụng chế phẩm sau thời gian bảo quản Bảng 3.7 Khả sống sót chủng VSV sau q trình đơng khơ Mật độ tế bào(CFU/R) Ký hiệu Trƣớc đông Sau 30 ngày San 60 ngày Sau 90 ngày chủng khô Chủng B 2,76 x 1010 2,26 x 1010 9,28 x 109 6,22 x 109 Chủng N4 3,34 x 1010 2.91 x 1010 9,70 x 109 85 x 109 Chủng L2 3,37 x 109 2,66 x 109 9,44 x 109 6,81 x 109 Sau 30 ngày sế lƣợng tế bào chủng B, N4 L2 thay đổi không đáng kể Sau 60 ngày, đặc biệt sau 90 ngày đông khô, số lƣợng tế bào chủng có giảm song đạt 109 tế bào/1g chế phẩm Đây mức yêu cầu mật độ tế bào chủng VSV chế phẩm probiotic cho hiệu cao sử dụng 15 3.6.2 Khả đối kháng với VK kiểm định chế phẩm Bảng 3.8 Khả đối kháng với VK kiểm định chủng chế phẩm Khỉ ức chế (D-d, mm) Chủng VSV ức chế vi khuẩn kiếm định Gây bệnh Trước đông Sau đông khô khô Sac cerevisiae với E.coli Viêm một, liêu cháy 25 23 Sac cerevisiae với Sal choleraesuis Chủng B với E.coli Tiêu chảy heo Viêm một, tiêu chảy 25 14 22 13 Chủng B với Sal choleraesuis Tiêu chảy heo 27 26 Chủng N4 với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 12 11 Chủng N4 với Sai choleraesuis Chủng 12 với E.coli Chủng 12 với Sai choleraesuis Tiêu chảy heo Viêm ruột, tiêu cháy Tiêu chảy heo 25 13 22 24 13 22 Kiểm tra khả đề kháng với VK kiểm định đề kháng với kháng sinh Sac cerevisiae cho thấy kết tƣơng tự Với đặc tính trên, cố thể bƣớc đầu yên tâm sử dụng thử nghiệm chế phẩm probiotic heo sau cai sữa 3.7 Xây dựng quy trình cơng nghệ Hình 3.10 So đồ quy bình cơng nghệ tạo chế phẩm probiotic 16 3.8 Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 heo sau cai sữa Mục đích thí nghiệm nghiên cứu tác dụng chế phẩm P-SP-01 đến việc phòng, trị bệnh tiêu chảy, hệ số chuyển hố thức ăn khả tăng trọng heo sau cai sữa (giai đoạn từ 28 ngày đến Số ngày tuổi) So sánh hiệu chế phẩm P-SP-01 so với hiệu chế phẩm BioI (đối chứng) Viện sinh học nhiệt đới TP HCM sản xuất lƣu hành phổ biến thị trƣờng 3.8.1 Tỷ lệ tiêu chảy heo sau cai sữa Bổ sung trộn lg chế phẩm P-SP-01/kg thức ăn cho heo sau cai sữa 28 ngày tuổi Tỷ lệ tiêu chảy heo đƣợc tính sế ngày heo tiêu chảy tái phát tổng số ngày ni lơ thí nghiệm Bảng 3.9 Tỷ lệ tiêu chảy heo sau cai sữa (%) Lô Lô ĐC Chỉ tiêu Lô ĐC Lô TN3 Lô TN Lô TN Tổng số ngày heo bị tiêu chảy 35 27 13 19 20 Tổng số ngày ni lơ thí nghiệm 224 224 224 224 224 Tỷ lệ tiêu chảy (%) 15,63 12,05 5,80 8,48 8,93 Giảm so với ĐC (%) - 22,90 62,89 45,75 42,87 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ tiêu chảy lơ thí nghiệm * Nhận xét Kết khảo sát cho thấy, lơ thí nghiệm có bổ sung chế phẩm P-SP-01 có tỷ lệ tiêu chảy thíp so với lơ ĐC2 - bổ sung Biol lô ĐC1 - không bổ sung chế phẩm Việc sử dụng chế phẩm cho heo có tác dụng làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 42,87% - 62,89% so với lô 17 ĐC1 Điều chứng tỏ, P-SP-01 tác dụng cạnh tranh dối kháng để loại trừ VK gây bệnh, cung cấp thêm lƣợng VSV có lợi, giúp trì cân hệ VSV dƣờng ruột, từ dó làm giảm tình trạng tiêu chảy heo Đặc biệt, lơ thí nghiêm 3, 4, 5, khơng cố tỷ lệ tái phát bệnh, lơ khơng dùng chế phẩm tỷ lệ tái phát bệnh tiêu chảy cao (66,66%) 3.8.2 Tăng trọng heo sau cai sữa Kết khảo sát trọng lƣợng tăng trọng bình quân heo từ 28 đến 56 ngày tuổi đƣợc bình bày qua bảng 3.16 Bảng 3.10 Tăng trọng bình quân heo từ 28 đến 56 ngày tuổi Lơ Chỉ tiêu Thời gian thí nghiệm (ngày) Trọng lƣợng 28 ngày tuổi (kg/con) Trọng lƣợng 56 ngày tuổi (kg/con) Tăng trọng bình quân (kg/con) Tăng trọng trung bình ngày (g/ngày/con) Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô TN3 Lô TN4 Lô TN5 28 6,2 15,3 9,1 325 28 7,1 17,9 10,8 385,7 28 9,0 21,9 12,9 460,1 28 5,8 15,3 9,5 339,3 28 5,9 15,8 9,9 353,6 Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ tiêu chảy thí nghiệm * Nhận xét :Kết khảo sát cho thấy, tăng trọng bình qn lơ có bổ sung chế phẩm (lô 3, 4, 5, ĐC2) cao so với lơ ĐC1 Tuy nhiên, tăng trọng bình qn lơ 3, 4, khơng Vì mà lơ 3, tăng trọng bình qn cao so với lô 4, lô ĐC2 (12,9kg/con so với 9,lkg/con lô ĐC1) 18 3.8.3 Hệ số tiêu tốn thức ăn Bảng 3.11 Hệ số tiêu thức ăn thời gian thí nghiệm Lơ Chỉ tiêu Số kg thức ăn tiêu thụ (kg/lô) Tăng trọng (kg/Iô) Hệ số tiêu tốn thức ăn Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô Lô Lô 121,5 72,7 1,67 100 86,1 1,16 135 103 1,31 94,2 76,2 1,24 102 79 1,29 Biểu đồ 3.8 Hệ số tiêu tốn thức ăn lơ thí nghiệm * Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy, hệ số tiêu tốn thức ăn lơ có bổ sung chế phẩm P-SP-01 (lô : 1,31; lô : 1,24; lô : 1,29) Biol (lô ĐC2 : 1,16), thấp nhiều so với lô ĐC1 (1,67) Hệ số gần xấp xỉ với 1,4 giá trị hệ số tiêu thức ăn cho hiệu kinh tế theo kinh nghiệm nhà chăn nuôi Nhƣ vậy, bổ sung probiotic vào phần ăn, VSV có lợi nhanh chống phát triển, chúng kết hợp với enzym hỗ trợ cho việc tiêu hóa thức ăn làm cho heo ăn nhiều hơn, hấp thu dƣỡng chất tết dẫn đến tăng trọng mau làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm heo sau cai sữa (28 ngày tuổi) cho thấy khả phòng trị bệnh tiêu chảy cho heo chế phẩm P-SP-01 cho kết tốt Hiệu tƣờng đƣơng với hiệu sử dụng chế phẩm BioI Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đƣợc lƣu hành phổ biến thị trƣờng Tuy nhiên, số liệu ghi nhận đƣợc bƣớc đầu số lƣợng heo thử nghiệm hạn chế khó khăn chúng tơi triển khai thực nghiệm thời kỳ dịch cúm HSN1 bùng phát Việt Nam 19 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ thực nghiệm trên, cố kết luận sau : Đã phân lập tuyển chọn đƣợc chủng VK lactic, chủng nấm men có đặc tính cần thiết chủng probiotic : - Có khả sinh chất kháng khuẩn cao - Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với VSV kiểm định (chuyên gây bệnh tiêu chảy cho heo) nhƣ E coli, Salmonella choleraesuis - Có khả đề kháng tết với chất kháng sinh (trị dƣờng ruột) nhƣ neomicin (Ne), nalidixic axit (Ng), kanamicin (Kn), gentamicin (Ge) - Có khả trì hoạt tính sinh học sống sốt cao sau q bình đơng khơ Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố phân loại chủng đến loài : Chủng B Lactobacillus agilis Chủng N4 Lactobacillus salivarius Chủng L2 Lactobacillus acidophilus Chủng nấm men Sac sp 02 Sác Cerevisiae Đã xác định đƣợc điều kiện tối ƣu cho tạo thành sinh khối chủng VK lactic chủng nấm men Đã khảo sát xác định đƣợc công thức tạo loại chế phẩm probiotic P-SP-01 P-SP-02 Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau trình bảo quản từ1 đến vả tháng cho thấy khả sống sốt chủng cao, sau tháng mật độ tế bào mức cho phép (109 CFU/g) Chất lƣợng tƣơng đƣơng với chế phẩm BioI lƣu hành rộng rãi thị trƣờng Đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm P-SP-01 P-SP-02 quy mơ phòng thí nghiệm Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 heo sau cai sữa, giai đoạn 28 đến 56 ngày tuổi Kết thu đƣợc : Tỷ lệ tiêu chảy 7,74% ; Tỷ lệ tái phát 0%; Tăng trọng trung bình 384,3g/ngày ; Hệ 20 số tiêu thức ăn 1,28% So với lô sử dụng Biol, đạt chất lƣợng tốt hay tƣơng đƣờng ĐỀ NGHỊ Từ kết nghiên cứu đạt đƣợc, để sớm đƣa chế phẩm vào ứng dụng thực tiễn, xin đề nghị số vấn đề sau : - Tiếp tục hoàn thiện quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm Probiotic - Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-02 ƣơng phòng bị tiêu chảy cho heo sau cai sữa làm sở cho việc sản xuất sử dụng chế phẩm nghiên cứu đƣợc quy mô đại trà SẢN PHẨM THU ĐƢỢC SAU ĐỀ TÀI Bài báo : "Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nám men Saccharomyces sp.02", Tạp chí Khoa học, Trƣờng ĐHSP TP Hồ Chí Minh, Năm 2006 Bài báo : "Đặc điểm chủng vi khuẩn lactic dùng chế phẩm probiotic phòng trị bệnh tiêu chảy cho heo", Hội nghị Khoa học lần thứ 20 kỷ niệm 50 năm thành lập Trƣờng ĐHBK Hà Nội, Năm 2006 Hai chế phẩm Probiotic P-SP-0I P-SP-02 ... VK Vi khuẩn VN Vi t Nam VSV Vi sinh vật Mẫu 1.10 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm probiotic. .. vi c nghiên cứu sử dụng VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc phục tình trạng vi c làm cần thiết điều kiện Đó lý khiến chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật. .. vật tạo chế phẩm Probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo" Mục tiêu đề tài: Sử dụng số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả phòng trị bệnh đƣờng ruột cho heo hiệu