Qui trình nhân giống cây phong lan phi điệp

PHÕNG GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO… TRƢỜNG THCS… BÁO CÁO NGHIÊN CỨU TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM BẰNG CƠNG NGHỆ IN VITRO Lĩnh vực: 19 – Khoa học thực vật NHĨM THỰC HIỆN: …… - Lớp 9D Nhóm trƣởng …… - Lớp 9C Thành viên NGƢỜI HƢỚNG DẪN: … , tháng … năm … i MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn .4 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) 1.2 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào 1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan công nghệ nuôi cấy mô tế bào 1.3.1 Trên giới .9 1.3.2 Trong nước 10 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nội dung nghiên cứu 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 11 2.2.2 Nghiên cứu khử trùng mẫu 11 2.2.3 Nghiên cứu môi trường tạo protocorm phát sinh chồi in vitro 12 2.2.4 Nghiên cứu môi trường để nhân nhanh chồi 12 2.2.5 Nghiên cứu môi trường thích hợp cho rễ 13 2.2.6 Nghiên cứu huấn luyện giai đoạn ngôi: 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15 3.1 Tạo mẫu 15 3.2 Môi trường tạo protocorm phát sinh chồi in vitro 15 3.2.1 Môi trường tạo protocorm 15 3.2.2 Môi trường tạo chồi 17 3.3 Môi trường nhân nhanh chồi 18 3.4 Môi trường rễ 20 3.4 Ra 21 3.4.1 Ảnh hưởng chế độ huấn luyện đến tỷ lệ sống lan 21 3.4.2 Ảnh hưởng loại giá thể trồng lên tỷ lệ sống lan .21 3.4.3 Ảnh hưởng chế độ che sáng đến sinh trưởng lan 22 3.5 Quy trình nhân giống phong lan Phi điệp tím cơng nghệ in vitro .23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 Kết luận 25 Kiến nghị 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM BẰNG CƠNG NGHỆ IN VITRO” MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) lồi lan có thân thòng, mọc hai hàng theo thân Hoa biến thiên từ màu trắng đến tím đậm, lưỡi mở hình tim, phủ lơng mịn nhung, có ánh kim Lan Phi điệp tím có hoa đẹp, độ bền bơng cao, lồi thích hợp để trồng nhà, dễ hoa Loài lan ưa chuộng thị trường, nhiên số lượng lồi tự nhiên có nguy sụt giảm nghiêm trọng nạn khai thác mức Phương pháp nhân giống lan Phi điệp tím nhân giống hạt nhân giống cách tách chồi non mọc từ mắt ngủ [5,8] Cả hai phương pháp nhân giống có nhiều hạn chế Nhân giống hạt có tỉ lệ nhân giống thấp tỉ lệ nảy mầm hạt lan thấp, cần có cộng sinh số loại nấm Nhân giống chồi non có hệ số thấp số lượng chồi mọc từ thân khơng nhiều, chồi có khả sinh trưởng khơng đồng Chính hai phương pháp nhân giống cung cấp số lượng giống lớn, đáp ứng nhu cầu ngày nhiều người loài hoa lan đẹp Ngày nay, công nghệ sinh học ứng dụng ngày rộng rãi nhân giống trồng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào (in vitro) chứng minh có nhiều ưu điểm tạo tạo với số lượng lớn con, chất lượng đảm bảo, bệnh, giá thành phù hợp không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Chính phương pháp ngày sử dụng nhiều nhân giống trồng, có nhân giống nhiều loài lan Việt Nam giới [9] Từ đó, câu hỏi đặt sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào để nhân giống lồi lan Phi điệp tím khơng? Mơi trường thích hợp cho nhân giống lan Phi điệp tím gồm thành phần nào? Quy trình nhân giống lan Phi điệp tím cơng nghệ ni cấy mơ tế bào nào? Để trả lời câu hỏi trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống phong lan Phi điệp tím cơng nghệ in vitro” đề xuất thực Kết nghiên cứu góp phần tạo nguồn giống phong lan Phi điệp tím chất lượng tốt với số lượng nhiều, đáp ứng nhu cầu ngày lớn thị trường, góp phần giảm nguy biến loài lan tự nhiên Mục tiêu đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho lồi lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) 3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu chuyên đề cung cấp dẫn liệu khoa học điều kiện nuôi cấy mô tế bào lồi lan Phi điệp tím 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Quy trình ni cấy mơ tế bào lan Phi điệp tím sử dụng để nhân giống loài lan với số lượng lớn, nhanh chóng tạo nguồn giống chất lượng cung cấp cho xã hội, đem lại hiệu kinh tế cao cho người sản xuất Đồng thời, góp phần tích cực vào cơng tác bào tồn lồi lan q CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố lan Phi điệp tím Lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) thuộc: Ngành: Angiospermatophyta Lớp: Liliopsida Lớp phụ: Liliidae Bộ: Orchhidales Họ: Orchidaceae Chi: Dendrobium Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) Lồi lan Phi điệp tím thường mọc quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á người trồng nhiều nơi giới [3] 1.1.2 Đặc điểm lan Phi điệp tím Đây loài lan đa thân, thân cứng, thân dài tới 1,20 m buông rũ xuống Lá mọc so le, đối cách dài 8-12 cm, rộng từ 4-7 cm, dày Hoa to tới 10 cm mọc từ 1-3 đốt rụng lá, nở vào mùa xuân, xn hè Dendrobium anosmum có hai mầu sắc chính: Tím, tím hồng trắng Tuy nhiên có nhiều biến dạng từ màu trắng đến tím đậm hay hồng nhạt, hồng thẫm cánh trắng lưỡi tím tuỳ theo phân bố (miền Nam hay Bắc Việt Nam)… Lưỡi hoa mở hình tim, phủ lơng mịn nhung, có ánh kim, hoa có kích thước lớn 5-8 cm [3] Hoa D anosmum hầu hết lâu tàn 3-4 tuần lễ thơm Một mạnh khỏe tới 50-70 hoa Hình 1.1 Lan Phi điệp tím Lan Phi điệp tím cần nhiều ánh sáng khoảng từ 4000-4500 ánh nến, nghĩa trồng nắng với lưới che Nhiệt độ từ 60°F (15.6°C) vào ban đêm 95°F (35°C) vào ban ngày Khi non mọc mạnh tưới thật nhiều nước bón phân Ẩm độ lý tưởng 605 70% Vào mùa thu, ngừng tăng trưởng, ban đêm cần lạnh xuống 60°F (15°C) thời gian cần vòng 4-5 tuần lễ để nụ, bắt đầu rụng 1.2 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mơ - tế bào thực vật 1.2.1.1 Tính tồn tế bào Mỗi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Mỗi tế bào riêng rẽ phân hóa mang tồn lượng thơng tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Đặc điểm tính tồn tế bào [9] Tính tồn tế bào sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phơi sinh “Sự phân hoá tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận chức khác thể”[9] Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành mơ chức chúng khơng hồn tồn khả phân chia Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phôi sinh lại phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hố tế bào, ngược lại với phân hoá tế bào Quá trình phát sinh hình thái ni cấy mơ – tế bào thực vật thực chất kết q trình phân hóa phản phân hóa tế bào Kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào xét kĩ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi ni cấy tách rời điều kiện nhân tạo, vô trùng) cách định hướng dựa phân hóa phản phân hóa tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái mơ ni cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật auxin cytokinin Tỷ lệ hai nhóm chất mơi trường kéo theo phát sinh hình thái khác thực vật [9] 1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào Tùy thuộc vào đối tượng khác nhau, q trình ni cấy mơ tế bào thực vật có giai đoạn khác Tuy nhiên, nhìn chung trình gồm giai đoạn vào mẫu, nhân nhanh (ở số loài hay với số mẫu có giai đoạn tạo chồi nhân nhanh chồi) [9] 2.2.2.1 Giai đoạn vào mẫu (giai đoạn nuôi cấy khởi động) Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Khi có nguồn ngun liệu ni cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý mẫu cấy điều kiện vô trùng Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: loại mô, giai đoạn phát triển: người ta thường lấy chồi đỉnh, chồi nách, phôi non để ni cấy in vitro Ngồi sử dụng đoạn thân, mảnh lá, để tiến hành nuôi cấy Người ta thường sử dụng số loại hoá chất như: HgCl2 0,1 %, cồn 70 , H2O2, Ca(OCl)2 để khử trùng mẫu cấy Mẫu sau khử trùng cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động [9] 2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh Một ưu lớn phương pháp nhân giống in vitro so với phương pháp nhân giống truyền thống có hệ số nhân cao Vì giai đoạn nhân nhanh coi giai đoạn then chốt tồn q trình nhân giống Giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái tăng nhanh số lượng thơng qua đường: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định tạo phơi vơ tính [9] 2.2.2.4 Giai đoạn tạo hoàn chỉnh Đây giai đoạn chồi đạt kích thước định chuyển từ mơi trường công đoạn sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành hồn chỉnh Ở giai đoạn môi trường cần giảm lượng cytokinin tăng lượng auxin để rễ phát triển Các chất NAA, IBA, IAA thường sử dụng nồng độ - mg/l để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Từ chồi riêng lẻ xuất rễ trở thành hoàn chỉnh [9] 2.2.2.5 Giai đoạn đưa mơ ngồi vườn ươm Đây giai đoạn chuyển dần từ ống nghiệm nhà kính ngồi trời để tạo điều kiện cho tự dưỡng hồn tồn thích nghi dần với môi trường tự nhiên 1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.2.3.1 Điều kiện vô trùng Đây điều kiện tiên thành công q trình ni cấy mơ - tế bào Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn thối chết Do đó, dụng cụ ni cấy, mơi trường mẫu cấy phải vô trùng Thao tác cấy phải thực buồng cấy (box) vô trùng [9] 1.2.3.2 Ánh sáng nhiệt độ Các mẫu nuôi cấy thường đặt phòng ni ổn định ánh sáng nhiệt độ Tất trường hợp ni cấy cần có ánh sáng trừ số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, trình nhân giống chúng cần có ánh sáng Nhiệt độ phòng ni thường trì từ 25-28 C nhờ máy điều hồ nhiệt độ [9] 1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 1.2.4.1 Thành phần hóa học mơi trường Thành phần môi trường nuôi cấy mô- tế bào thay đổi tuỳ theo lồi thực vật, loại tế bào, mơ quan nuôi cấy Đối với loại mô, quan mục đích ni cấy khác môi trường nuôi cấy khác Mơi trường ni cấy thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng phát triển mẫu cấy [9] Mặc dù có đa dạng thành phần chất môi trường nuôi cấy gồm thành phần sau: - Thành phần vô cơ: Bao gồm muối khoáng (đa lượng vi lượng) bổ sung vào mơi trường ni cấy + Muối khống đa lượng nguyên tố cần phải cung cấp nitơ, photpho, kali + Muối khoáng vi lượng sử dụng nồng độ < 30 ppm Các nguyên tố vi lượng Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot đóng vai trò quan trọng - Thành phần hữu cơ: + Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol: Các vitamin hay sử dụng vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngồi mơi trường ni cấy sử dụng số vitamin khác vitamin H, vitamin M, vitamin B 2, vitamin C, vitamin E với nồng độ khác (Vitamin B1: 0,1- 5,0 mg/l; Vitamin B6: 0,1- 1,0 mg/l ; Vitamin H: 0,01- 1,0 mg/l ) Myo-inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng phát triển giống vitamin nhiều trường hợp có vai trò nguồn cacbon môi trường nuôi cấy Hàm lượng sử dụng 100 mg/l môi trường + Thành phần hữu phức hợp: dùng môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin khống chất Chúng sử dụng mơi trường khống xác định không đạt kết mong muốn sinh trưởng phát triển mẫu nghiên cứu - Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng thành phần thiếu môi trường ni cấy, có vai trò quan trọng phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu tác động chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng ni cấy + Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy: IAA (Indole acetic acid), IBA (Indole butyric acid), NAA (Naphthaleneacetic acid), 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid) + Nhóm Cytokinin: Kích thích phân chia tế bào, hình thành sinh trưởng chồi in vitro Các cytokinin có biểu ức chế tạo rễ sinh trưởng mơ sẹo có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phơi vơ tính mẫu ni cấy Các loại cytokinin thường dùng nuôi cấy mô là: Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but8 2-enylamino] purine), Kinetin (6-furfurylamino purine), BAP (Bezylamino purine), TDZ (Thidiazuzon) - Nguồn cacbon: Các mẫu ni cấy thực vật nói chung khơng thể quang hợp quang hợp cường độ thấp Vì phải đưa thêm hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy Loại hydratcacbon sử dụng phổ biến đường sucrose với hàm lượng từ - 6% Những loại đường khác fructose, glucose, maltose, sorbitol, dùng - Các thành phần khác: + Tác nhân tạo gel: định trạng thái vật lý môi trường nuôi cấy Chất tạo gen sử dụng phổ biến agar + Than hoạt tính: dùng để hấp thụ chất màu, hợp chất phenol, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp chất có tác dụng gây ức chế sinh trưởng mẫu nghiên cứu Mặt khác, bổ sung vào môi trường, than hoạt tính làm cho mơi trường trở nên sẫm kích thích q trình tạo rễ có tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính [9] 1.2.4.2 pH môi trường pH đa số môi trường nuôi cấy điều chỉnh phạm vi 5,5-6,0 pH 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, pH lớn 6,0 agar cứng 1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan công nghệ nuôi cấy mô tế bào 1.3.1 Trên giới Năm 1931, White Gautheret tìm môi trường nuôi cấy Phong lan Trên môi trường White Gautheret hạt lan nảy mầm khơng cần có mặt nấm Rhiroctonia Từ đó, nhiều cơng trình nhân giống phong lan cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực hiện, có lồi phong lan thuộc chi Hồng thảo (Dendrobium) Năm 1997, Nayka cộng đánh giá ảnh hưởng nhân nhanh chồi kết hợp cytokinin auxin hai đối tượng Dendrobium aphyllum Dendrobium moschatum, cho kết tần số tái sinh chồi đạt tối ưu nồng độ 44µM BA (9,91 mg/l BA) [11] Năm 2011, Kaewduangta Reamkatog báo cáo cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium parishii đánh giá ảnh hưởng môi trường cải biến lên sinh trưởng phát triển lồi lan Kết mơi trường nhân chồi phù hợp loài lan Dendrobium parishii là: VW + than hoạt tính( 2g/l) + nước dừa( 150ml/l) + chuối nghiền( 50g/l) + bột nhộng (5g/l) + gạo nâu( 5g/l) cho kết sau tuần nuôi cấy chồi có chiều cao 0,98cm/chồi có 7,83 lá/chồi [10] Tuhuteru cộng (2012) tiến hành đánh giá sinh trưởng Các công thức môi trường bổ sung thêm 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar Hệ số nhân nhanh chồi (lần) = - Chỉ tiêu đánh giá: hệ số nhân nhanh chồi, đặc điểm chồi Tổng số chồi Số chồi cấy ban đầu 2.2.5 Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho rễ - Vật liệu nghiên cứu: chồi in vitro cao - cm, có từ - tạo thành từ giai đoạn - Cơng thức thí nghiệm: Thí nghiệm Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho rễ bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo cơng thức thí nghiệm sau: Cơng thức R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 Môi trƣờng K* K* + 0,1 mg/l NAA K* + 0,2 mg/l NAA K* + 0,3 mg/l NAA K* + 0,1 mg/l IAA K* + 0,2 mg/l IAA K* + 0,3 mg/l IAA Các công thức môi trường bổ sung thêm 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar - Chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ mẫu rễ, số rễ/cây Tỷ lệ mẫu rễ (%) Số mẫu rễ x 100 = Tổng số mẫu ban đầu 2.2.6 Nghiên cứu huấn luyện giai đoạn ngôi: * Ảnh hưởng chế độ huấn luyện ống nghiệm - Vật liệu nghiên cứu: bình hồn thành giai đoạn rễ - Cơng thức thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí cơng thức: H1: bình để ngun khơng mở nắp đặt nhà lưới tuần H2: bình để ngun khơng mở nắp đặt nhà lưới tuần, tuần mở nắp bình H3: bình mở nắp đặt nhà lưới tuần, H4: chuyển nhà lưới, phun ẩm lần/ngày nhà lưới ngày - Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ sống (%) * Ảnh hưởng loại giá thể trồng đến tỷ lệ sống lan Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể trồng (dớn, xơ dừa, than củi) đến tỷ lệ sống sinh trưởng lan Phi điệp tím mơ sau trồng ngồi nhà lưới - Cây mơ bố trí thí nghiệm công thức sau: G1: 100 % Dớn cọng 13 G2: 100% Rêu G3: 50% Dớn cọng + 50% Rêu Giá thể sử dụng công thức xử lí sơ với thuốc diệt nấm theo nồng độ thích hợp (1/2 nồng độ ghi bao bì) Vớt lên, để nước đem trồng - Chỉ tiêu đánh giá : Tỷ lệ sống, số rễ, chiều dài rễ, số lá, chiều dài * Ảnh hưởng chế độ che sáng đến sinh trưởng lan Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng chế độ che sáng (25%, 50%) so với ánh sáng tự nhiên lên lan đến sinh trưởng lan mơ sau trồng ngồi nhà lưới Thí nghiệm bố trí cơng thức: CT1: Che 25% ánh sáng tự nhiên (che lưới đen lớp phía bên) CT2: Che 50% ánh sáng tự nhiên (che lưới đen lớp bên xung quanh) - Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống, kích thước lá, chiều dài rễ (động thái lá, động thái rễ) + Động thái = Số hình thành – Số ban đầu + Động thái rễ = Số rễ hình thành – Số rễ ban đầu - Thời điểm thu thập: sau 1, 2, tháng tuổi Số sống Tỷ lệ sống (%) = ban đầu Tổng số trồng x 100 Tổng số rễ Số rễ/mẫu (rễ) = Số mẫu ban đầu Tổng số Số lá/mẫu (lá) = Số mẫu ban đầu Tổng chiều dài (rễ) Chiều dài (rễ) = Tổng số (rễ) ban đầu 14 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tạo mẫu Trong đề tài, để tạo mẫu tiến hành khử trùng với Natri hypochlorit (NaOCl) nồng độ 2,5% Quả lan sau khử trùng cắt bỏ đầu tiến hành tách lớp vỏ theo chiều dọc Phôi hạt lấy cấy vào bình mơi trường ni cấy Kết khử trùng mẫu sau tuần nuôi cấy thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khử trùng mẫu công thức sau tuần nuôi cấy Công thức Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu tái Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) sống (%) sinh (%) chết (%) KT1 KT2 KT3 KT4 88,89 57,78 3,33 1,11 2,22 14,44 1,11 31,11 8,89 24,44 95,56 24,44 3,33 43,33 a B c d Hình 3.1 Hình thái mẫu sau khử trùng a Mẫu nhiễm, b mẫu sồng, c mẫu tái sinh, d mẫu chết Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần thời gian khử trùng tăng Khi khử trùng thời gian 10 phút với NaClO 2,5%, tỷ lệ mẫu bị nhiễm lên tới 88,89% Trong đó, tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm rõ rệt khử trùng với thời gian 20 phút, 3,33% mẫu bị nhiễm Tỷ lệ giảm xuống 1,11% thời gian khử trùng 25 phút Tuy nhiên, khử trùng với thời gian 25 phút, tỷ lệ mẫu chết tăng lên tới 43,33% tỷ lệ mẫu tái sinh đạt mức 24,44% Tỷ lệ mẫu tái sinh đạt cao công thức thí nghiệm với thời gian khử trùng 20 phút, 95,56% Như vậy, thời gian khử trùng tốt sử dụng NaClO 2,5% mẫu phi điệp tím 20 phút 3.2 Môi trƣờng tạo protocorm phát sinh chồi in vitro 3.2.1 Môi trường tạo protocorm Trong nuôi cấy in vitro lan số loài mầm (chuối, dứa, hoa loa kèn, ) có giai đoạn đặc trưng gọi giai đoạn protocorm (hay giai đoạn giẻ hành) Do vậy, việc tìm mơi trường tạo protocorm việc cần làm tiếp sau 15 giai đoạn khử trùng vào mẫu, tạo mẫu sạch; để cung cấp vật liệu cho trình tái sinh chồi Trong đó, hạt lan khơng có nội nhũ tỷ lệ tái sinh hạt lan tự nhiên thấp [14] Các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin auxin có ảnh hưởng tích cực đến khả tái sinh in vitro hạt lan Dựa kết nghiên cứu nhân giống in vitro vài đối tượng thuộc chi Dendrobium, tiến hành khảo sát khả tạo protocorm hạt lan môi trường Knudson cải tiến (K*) có bổ sung NAA, BAP Kinetin nồng độ khác Kết trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Tạo protocorm môi trường sau tuần nuôi cấy Công thức Tỷ lệ tạo protocorm (%) Đặc điểm TC0 50 + TC1 100 ++ TC2 100 +++ TC3 100 + TC4 100 ++ TC5 100 ++ TC6 100 + Ghi chú: +++: protocorm màu xanh đậm; ++: protocorm màu xanh nhạt; +: protocorm màu vàng/nâu Trên môi trường sau tuần nuôi cấy, protocorm tạo môi trường ni cấy Cơng thức TC0 có tỷ lệ tạo protocorm đạt 50% cơng thức lại (từ TC1 đến TC6) có tỷ lệ tạo protocorm đạt 100%; Do môi trường công thức TC0 có khống bản, khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích hình thành thể chồi protocorm có tạo tỷ lệ đạt sau tuần nuôi cấy thấp Hình thái protocorm tạo lại có khác biệt quan sát mơi trường Hình thái protocorm phát sinh đối tượng công thức TC2 có màu xanh đậm đặc trưng - loại protocorm thích hợp cho phát sinh chồi Trong cơng thức lại: protocorm tạo có màu xanh nhạt (TC1, TC4), chí màu vàng/nâu cơng thức (TC3, TC6) Protocorm có hình thái khơng thuận lợi cho tái sinh Có thể hàm lượng BAP/Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cấy mức thấp (0,1 mg/l) dẫn đến tình trạng chưa đủ tác dụng kích thích/hoặc cao gây tượng ức chế (0,5 mg/l) q trình tạo protocorm Phi điệp tím Đồng thời qua kết khảo sát trên, bước đầu thấy rằng: hai loại Cytokinin sử dụng: BAP Kinetin BAP thích hợp cho tạo protocorm Phi điệp tím, hình thái protocorm tạo thuận lợi cho tái sinh Như vậy, đối tượng Phi điệp tím mơi trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA 0,3 mg/l BAP thích hợp cho q trình tạo protocorm q trình ni cấy 16 TC1 TC2 TC3 Hình 3.2 Hình thái protocorm số mơi trường Các protocorm xanh đậm hình thành cụm bề mặt môi trường Các protocorm sử dụng để làm nguyên liệu cho trình phát sinh chồi - cung cấp vật liệu cho giai đoạn nuôi cấy 3.2.2 Môi trường tạo chồi Bảng 3.3 Tạo chồi môi trường sau tuần nuôi cấy Công thức Tỷ lệ tạo chồi (%) Đặc điểm TC0 TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 23,33 63,33 100 100 56,67 96,67 + + +++ ++ + ++ TC6 93,33 ++ Ghi chú: +++: chồi màu xanh đậm, cân đối; ++: chồi màu xanh nhạt, cân đối ; +: chồi màu vàng, số phát sinh mô sẹo Để thu in vitro hoàn chỉnh đồng thời cung cấp nguyên liệu cho trình nhân nhanh chồi từ protocorm thu bước cần kích thích chúng phát sinh hình thái mà cụ thể theo hướng phát sinh chồi Trong nghiên cứu để tạo chồi, lại tiếp tục nghiên cứu cho loại môi trường Các protocorm thu thí nghiệm chọn cấy vào bình 03 cụm protocorm, cụm có đường kính 5mm Mơi trường tạo chồi khơng cần cho tỷ lệ phát sinh chồi cao mà đồng thời chồi tạo phải đảm bảo chất lượng (chồi xanh, cân đối) để thuận lợi cho phát triển giai đoạn Kết thử nghiệm tạo chồi từ protocorm công thức môi trường sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.3 Qua bảng số liệu, ta thấy có khác biệt tỷ lệ tạo chồi nghiệm thức Ở công thức TC1, TC2, TC3: BAP bổ sung mức 0,1 - 0,5 mg/l cho tỷ lệ tạo chồi cao: thấp 63,33% - TC1 (BAP 0,1 mg/l), tăng lượng BAP lên mức 0,3; 0,5 mg/l tất mẫu tạo chồi Điều chứng tỏ BAP thích hợp để 17 kích thích tạo chồi, đặc biệt hàm lượng 0,3 ; 0,5 mg/l môi trường Ở công thức tiếp (TC4 -T C6): Kinetin bổ sung vào môi trường mức từ 0,1 - 0,5 mg/l môi trường Ở công thức này: lượng Kinetin thích hợp cho phát sinh chồi 0,3 mg/l - tỷ lệ tạo chồi đạt 96,67%; tăng hàm lượng Kinetin bổ sung vào môi trường lên mức 0,5 mg/l tỷ lệ lại giảm xuống 93,33% TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 Hình 3.3 Kết tạo chồi số mơi trường Hình thái chồi tạo mơi trường có khác biệt: cơng thức TC2, TC3, TC5, TC6 chồi tạo có hình thái bình thường, cân đối có màu xanh đậm/ xanh nhạt thuận lợi cho tái sinh chồi số cơng thức TC1, TC4 chồi tạo có màu vàng số phát sinh mơ sẹo Những dạng chồi có kèm mơ sẹo khó tái sinh tiếp thực q trình nhân nhanh có nhân nhanh tạo khơng cân đối Do vậy, yêu cầu hình thái chồi tạo sau trình nhân nhanh phải xanh, cân đối, không phát sinh thêm mô sẹo Từ kết nhận thấy môi trường tạo chồi thích hợp cho Phi Điệp tím mơi trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP Trên môi trường vừa cho tỷ lệ phát sinh chồi cao, vừa cho hình thái chồi tạo thuận lợi 3.3 Môi trƣờng nhân nhanh chồi Nhân giống trồng in vitro có ưu điểm hẳn phương pháp nhân giống khác cho hệ số nhân giống cao tạo bệnh Do vậy, giai đoạn nhân nhanh coi giai đoạn then chốt trình nhân giống nhằm tìm mơi trường cho hệ số nhân cao nhất, chồi nhân tạo mập, khỏe Với thí nghiệm nhân nhanh chồi, tiến hành nghiên cứu công thức môi trường Cụm chồi gồm từ - chồi đẹp, cân đối cấy chuyển sang mơi trường nhân nhanh chồi, cụm chồi/bình 18 Kết thu từ Hình 3.4 cho thấy: Hệ số nhân thu môi trường khác khác cao so với đối chứng Trên cơng thức mơi trường có bổ sung BAP: Hệ số nhân chồi thu môi trường có bổ sung 0,2 mg/l NAA 0,3 mg/l BAP cao - 3,57 lần; hệ số giảm dần theo môi trường: NN3 (2,35 lần), NN1 (2,07 lần) Trong mơi trường có bổ sung Kinetin hệ số nhân thu cao 3,07 lần giảm dần công thức NN6 (2,3 lần), NN4 (1,9 lần) Tuy nhiên để trình nhân nhanh đạt hiệu chồi tạo phải đảm bảo sinh trưởng tốt môi trường nuôi cấy, để tìm mơi trường nhân nhanh chồi chúng tơi đánh giá hai tiêu chiều cao/chồi số lá/chồi Khi đánh giá tiêu chiều cao/chồi nhận thấy chiều cao/chồi công thức NN3 cao (0,74 cm), xấp xỉ công thức NN2, NN6 (0,64 cm), NN1 giá trị 0,55 cm N6 - 0,56 cm Sở dĩ NN3, NN6: hàm lượng BAP/ Kinetin bổ sung cao nên tác dụng kích thích theo hướng kéo dài chồi phát huy lớn nhất, hiệu lực kéo dài chồi giảm theo giảm hàm lượng BAP/ Kinetin bổ sung vào môi trường 4.00 Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi/chồi (cm) Số lá/chồi (lá) 3.00 2.00 1.00 Công thức 0.00 NN0 NN1 NN2 NN3 NN4 NN5 NN6 Biểu đồ 3.4 Kết nhân chồi môi trường NN1 NN2 NN3 Hình 3.5 Kết nhân chồi số môi trường Về tiêu số lá/chồi: xét đến tiêu chúng tơi thấy cơng thức ưu trội lại NN2 (giống với xét cho hệ số nhân) với 3,05 lá; NN3, NN4 lại có 19 số thấp hơn, NN1 NN6 Như hàm lượng BAP/ Kinetin bổ sung vào mơi trường cao ưu tiên phát triển kéo dài chồi số lá/chồi không cao Từ kết thấy môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi lan Phi điệp tím mơi trường có bổ sung 0,2 mg/l NAA + 0,3mg/l BAP Trên môi trường này, hệ số nhân chồi cao nhất, chồi tạo có sinh trưởng chiều cao số tốt 3.4 Môi trƣờng rễ Kích thích tạo rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu phòng thí nghiệm Các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đóng vai trò quan trọng phân chia tế bào hình thành rễ Chồi tạo từ bước nhân, sau tiến hành chọn chồi đạt từ - có chiều cao - 3cm đem cấy sang mơi trường có bổ sung auxin để tìm mơi trường rễ thích hợp Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng hai loại auxin NAA , IAA để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Mỗi loại Auxin thử nghiệm mức hàm lượng 0,1; 0,2 0,3 mg/l Sau tuần nuôi cấy thu kết sau: Bảng 3.4 Ra rễ môi trường sau tuần nuôi cấy Công thức R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 Tỷ lệ rễ (%) 5,56 51,11 95,56 86,67 44,44 84,44 76,67 Số rễ/chồi (rễ) 1,33 2,04 4,04 3,00 1,88 3,01 2,02 Chiều dài rễ (cm) 0,83 1,12 2,09 2,38 0,99 1,39 2,05 Hình 3.6 Kết rễ số môi trường - Số liệu thu từ bảng 3.4 cho thấy: Hiệu rễ NAA hẳn so với IAA thể tỷ lệ rễ cao hơn, số rễ/ chồi chiều dài rễ/chồi vượt trội 20 Trong cơng thức thí nghiệm trên, cơng thức mơi trường R2 có bổ sung NAA hàm lượng 0,2 mg/l cho kết tốt Trên môi trường này: Phi điệp tím cho tỷ lệ rễ đạt 95,56%, số rễ/ chồi 4,04 rễ, chiều dài rễ đạt 2,09 cm Như vậy, cơng thức thích hợp sử dụng cho rễ, mọc môi trường sinh trưởng tốt hơn, thuận lợi cho giai đoạn vườn ươm 3.4 Ra Ra bước đưa từ ống nghiệm ngồi mơi trường Khi phòng thí nghiệm, yếu tố ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ đảm bảo cho sinh trưởng tối ưu, đặc biệt khơng có bệnh tật gây hại cho Nhưng đưa ngồi mơi trường tự nhiên nhân tố khơng thể ổn định mà ln có thay đổi, ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khả sinh trưởng, phát triển Vì huấn luyện thích ứng với mơi trường sống ngồi tự nhiên, trước mắt thích nghi với mơi trường nhà lưới cần thiết 3.4.1 Ảnh hưởng chế độ huấn luyện đến tỷ lệ sống lan Bảng 3.5 Ảnh hưởng chế độ huấn luyện đến tỷ lệ sống Công thức H1 H2 H3 H4 Tỷ lệ sống(%) 75,56 88,89 54,44 38,89 Chế độ huấn luyện H2 phù hợp cho lan Phi điệp tím Cơng thức huấn luyện cho tỷ lệ sống 88,89% Do công thức huấn luyện khuyến cáo với lan Phi điệp tím mơ trước đem trồng ngồi vườn Cây sau huấn luyện, đạt tiêu chuẩn rửa thạch, xử lí thuốc diệt nấm trồng lên giá thể Tiêu chuẩn lan Phi điệp tím mơ để đưa từ ống nghiệm trồng sau: Chiều cao cây: cm; số lá: -4 lá; số rễ: - rễ; chiều dài rễ: 2,0 - 2,5 cm, rễ mập khỏe 3.4.2 Ảnh hưởng loại giá thể trồng lên tỷ lệ sống lan Giá thể đóng vai trò điểm tựa, đồng thời nơi cung cấp nước phần chất dinh dưỡng cho Hiện có nhiều loại giá thể sử dụng để trồng lan rễ dương xỉ, xơ dừa, dớn cọng, dớn trắng, rễ bèo tây, than củi, gạch ngói, thân Một số loại phong lan không cần đến giá thể, treo lơ lửng để chậu không mà sinh trưởng phát triển tốt cung cấp đầy đủ nước chất dinh dưỡng Tuy nhiên dùng giá thể trồng lan tối ưu tiết kiệm thời gian chăm sóc giữ cho ln sinh trưởng phát triển ổn định, với lan nhỏ 21 Giá thể khác khả giữ ẩm tạo độ thơng thống khác nhau, mà tỷ lệ sống tốc độ sinh trưởng lan không giống Bảng 3.6 Ảnh hưởng giá thể trồng đến tỷ lệ sống lan Công thức Tỷ lệ sống (%) G1 50,00 G2 61,11 G3 76,67 Cả loại giá thể cho tỷ lệ sống cao thể giá trị từ 50% trở lên Trong cơng thức giá thể G3 (50% rêu + 50% dớn cọng) phù hợp cả, tỷ lệ sống thu môi trường cao - 76,67% tỷ lệ công thức 100% rêu hay 100% dớn 50,00% 61,11% Sở dĩ Phi điệp tím trồng cơng thức G vừa cung cấp độ ẩm phù hợp lại vừa thơng thống; tránh tượng thối nhũn thường gặp giai đoạn đầu hậu cấy mơ Còn cơng thức G2, giá thể sử dụng 100% dớn nên không đáp ứng đủ nước, độ ẩm cho Phi điệp tím thân bị khơ, héo chí dẫn đến chết Nhưng sử dụng 100% rêu cho Phi điệp tím bị chết thừa nước bệnh liên quan đến thối, nhũn Như vậy, khoảng tháng đầu sau đưa nhà lưới cơng thức giá thể phù hợp để trồng lan Phi điệp tím 50% rêu + 50% dớn cọng 3.4 Ảnh hưởng chế độ che sáng đến sinh trưởng lan Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế độ che sáng tới sinh trưởng lan Chỉ tiêu theo Che 50% ánh sáng tự nhiên Che 25% ánh sáng tự nhiên Sau Sau Sau Sau Sau Sau dõi tháng tháng tháng tháng tháng tháng Số hình 0,07 0,20 0,09 0,62 thành TB/cây Chiều dài TB 3,43 4,40 4,50 0,35 4,20 4,43 (cm) Xanh Lá vươn dài, mỏng, Xanh Lá dầy, chiều Hình thái đậm chiều ngang hẹp nhạt ngang rộng Số rễ hình 0,08 0,33 0,09 0,66 thành TB/cây Chiều dài rễ TB 2,20 2,50 3,02 0,15 2,57 3,53 Rễ Hình thái rễ Rễ mập Rễ mảnh Rễ mập mảnh Thời gian TB rễ -7 ngày - 10 ngày bám vào giá thể Ánh sáng yếu tố vô quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển trồng đặc biệt non Nếu thiếu ánh sáng trồng quang hợp trồng bị chết sống trồng còi cọc khơng có khả kháng bệnh Nếu thừa ánh sáng, non chưa phát triển nên 22 tiếp xúc nhiều với ánh sáng làm cho bị héo nước, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Trong tháng đầu đưa từ ống nghiệm trồng: Kết thử nghiệm cho thấy công thức che sáng 50 % ánh sáng tự nhiên cho hiệu tốt so với công thức che sáng 25% Với công thức che sáng 50% số mới, chiều dài tăng cao công thức che sáng 25% Chiều dài rễ công thức che sáng 50% cao hẳn công thức che sáng 25%; thời gian rễ bám vào giá thể -7 ngày ngắn công thức che sáng 25% - 10 ngày Tháng thứ hai tháng thứ 3: Số hình thành cơng thức chiếu sáng 25 % cao hẳn, chiều dài lại thấp công thức chiếu sáng 50% Nguyên nhân cơng thức chiếu sáng 50% làm cho lượng ánh sáng không đủ, vươn dài mỏng chiều ngang hẹp; cơng thức che sáng 25% đủ ánh sáng cho quang hợp nên sinh trưởng tốt, cân đối Ngược lại công thức che sáng 25% chiều dài rễ trung bình lại cao 3.5 Quy trình nhân giống phong lan Phi điệp tím cơng nghệ in vitro Tạo mẫu (1) Tạo protocorm (2) Nhân nhanh chồi (4) Tạo chồi (3) Tạo rễ (5) Ra (6) 23 Bước 1: Tạo mẫu (1) Mẫu nguyên vẹn chín sinh lí trước tiên rửa qua vòi nước chảy, sau khử trùng thơ (ở ngồi box) dung dịch xà phòng lỗng Rửa lại nước cuối mẫu tráng lại nước cất - lần Tiếp đó, mẫu đưa vào box cấy khử trùng với Natri hypoclorit NaOCl 2,5% thời gian 20 phút Bước 2: Tạo protocorm (2) Mẫu tái sinh thu từ bước cấy chuyển sang môi trường Knudson* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP + 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar đề tạo protocorm Bước 3: Tạo chồi (3) Protocorm có màu xanh đậm thu bước cấy chuyển sang môi trường Knudson* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP + 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar để tạo chồi Bước 4: Nhân nhanh chồi (4) Cụm chồi từ - chồi đẹp, xanh đậm, cân đối cấy chuyển sang môi trường Knudson* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP + 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose+7g/l agar để nhân nhanh chồi Bước 5: Ra rễ (5) Chồi có từ - lá, có chiều cao - cm đem cấy chuyển sang môi trường Knudson* + 0,2 mg/l NAA + 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar để tạo rễ Bước 6: Ra ngơi (6) Bình in vitro có -5 đẹp, có chiều cao - cm, có từ trở lên, có ≥ rễ huấn luyện nhà kính: tuần bình để ngun khơng mở nắp, tuần mở nắp bình Cây sau huấn luyện lấy khỏi bình, rửa agar, xử lý với thuốc diệt nấm KMnO4 0,1% 05 phút trồng vào giá thể G3: 50% rêu + 50% dớn cọng Chế độ che sáng: Che sáng 50% ánh sáng tự nhiên cho tháng đưa trồng, tháng che sáng 25% ánh sáng tự nhiên 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Xây dựng thành cơng quy trình nhân giống in vitro lan Phi điệp tím: - Giai đoạn tạo mẫu sạch: Khử trùng với NaOCl 2,5% 20 phút - Giai đoạn tạo protocorm: Knudson* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP +100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose+7g/l agar - Giai đoạn tạo chồi: K* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP +100ml/l ND + 100g/l KT+30g/l sucrose + 7g/l agar - Giai đoạn nhân chồi: K* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP +100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar - Giai đoạn rễ: K* + 0,2 mg/l NAA +100ml/l ND+100g/l KT +30g/l sucrose+7g/l agar - Giai đoạn nhà lưới: tuần bình để ngun khơng mở nắp, tuần mở nắp bình - Giá thể ngôi: 50% rêu + 50% dớn cọng - Chế độ che sáng tháng đưa trồng nhà lưới che sáng 50%, hai tháng che sáng 25% Kiến nghị - Chuyển giao quy trình nhân giống phong lan Phi điệp tím công nghệ in vitro cho sở sản xuất giống hoa - Tiếp tục nghiên cứu quy trình nhân giống loại trồng khác công nghệ in vitro, phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), Nhân giống lan endrobium anosmum, endrobium mini phương pháp nuôi cấy mô Nghiên cứu loại giá thể trồng lan endrobium mini thích hợp cho hiệu cao, Đề tài nghiên cứu khoa học trường Đại học An Giang [2] Trần Quang Hoàng (2005), Ảnh hưởng chất điều hồ sinh trưởng đến q trình ni cấy in vitro hai giống lan Dendrobium Cymbidium, Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Nông – Lâm TP HCM [3] Trần Hợp, 1998, Phong lan Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr 210-214 [4] Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), Nhân giống in vitro loài lan địa Dendrobium nobile Lindl., Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(7), tr 917-925 [5] Nguyễn Công Nghiệp (2000), Nuôi trồng hoa lan, Nhà xuất Trẻ, Hà Nội [6] Vũ Thanh Sắc, Nguyễn Thị Thu Huyền, Lê Thị Lý (2012), Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo trầm trắng (Dendrobium anosmum var.alba), Tạp chí khoa học & cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên 93(05): 131-135 [7] Nguyễn Quang Thạch cs (2005), Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) Kỹ thuật chọn tạo, nhân giống nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [8] Nguyễn Thiện Tịch, Nguyễn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Dung (1996), Kĩ thuật nuôi trồng hoa lan Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [9] Vũ Văn Vụ , Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp(2007), Công nghệ sinh học tập 2, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo Tiếng Anh [10] Kaewduangta W., Reamkatog P., (2011), Effect of modification medium on growth development of Dendrobium parishii in vitro, American-Eurasian J.Agric.&Environ.Sci., 11(1): 117-12 [11] Nayak, N.R Rath, S.P and Patnaik, S (1997) In vitro propagation of three Dendrobium aphyllum through Diazuron inducced high frequency shoot proliferation ephitylic Cymbidium, Aloifolium (L.) SW, Dendrobium aphyllum (Roxb) Fisch and Dendrobium moschatum (Buch-ham) SW through thidiazuron induced high frequency shoot proliferation, Sci.Hort 71, 416-426 [12] Tuhuteru,S., M.L Hehanussa, S.H.T.Raharjo (2012), Growth and development of Dendrobium anosmum orchid on in vitro culture media with several coconut water concentrations, Agrologia Vol 1(1): 1-12 26 ... Phương pháp nhân giống lan Phi điệp tím nhân giống hạt nhân giống cách tách chồi non mọc từ mắt ngủ [5,8] Cả hai phương pháp nhân giống có nhiều hạn chế Nhân giống hạt có tỉ lệ nhân giống thấp... nhân giống lan Phi điệp tím gồm thành phần nào? Quy trình nhân giống lan Phi điệp tím cơng nghệ ni cấy mô tế bào nào? Để trả lời câu hỏi trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống phong. .. nhiều nhân giống trồng, có nhân giống nhiều loài lan Việt Nam giới [9] Từ đó, câu hỏi đặt sử dụng cơng nghệ ni cấy mơ tế bào để nhân giống lồi lan Phi điệp tím khơng? Mơi trường thích hợp cho nhân