ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE Họ tên sinh viên: NGUYỄN THỊ MINH NHUNG Lớp: DH05DY Ngành: DƯỢC THÚ Y Niên khóa: 2005 - 2010 Tháng 8/2010    BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y **************** NGUYỄN THỊ MINH NHUNG ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN AMPICILLIN VÀ TETRACYCLINE Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y chuyên ngành Dược Giáo viên hướng dẫn ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG BSTY ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP Tháng năm 2010 i    PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Minh Nhung Tên luận văn: Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao phân tích proline xây dựng đường chuẩn ampicillin tetracycline Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến đóng góp Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày … tháng … năm 2010 TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2010 Giáo viên hướng dẫn ThS Phùng Võ Cẩm Hồng BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp ii    CẢM TẠ Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em quãng thời gian theo học trường Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y thầy ngồi trường ln tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho chúng em ThS Phùng Võ Cẩm Hồng BSTY Đặng Thị Xuân Thiệp tận tình trực tiếp hướng dẫn, theo sát giúp đỡ em suốt trình thực TS Võ Thị Trà An hết lòng bảo, hướng dẫn để em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Các thầy cô anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Hóa Lý thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học Môi trường trường Đại học Nông Lâm hỗ trợ, giúp đỡ em thời gian thực tập Toàn thể bạn sinh viên lớp Dược Thú Y 31 gắn bó động viên ngày tháng học tập Thương gửi ba mẹ gia đình - nguồn động viên, an ủi nâng đỡ đời con, lòng thành kính yêu thương tri ân mãi Tháng năm 2010 Nguyễn Thị Minh Nhung iii    TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao phân tích proline xây dựng đường chuẩn ampicillin tetracycline” tiến hành từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2010 Viện Công nghệ Sinh học Môi trường trường Đại học Nông Lâm TP HCM, với mục đích đánh giá hiệu kỹ thuật HPLC phân tích hàm lượng acid amin proline mẫu xây dựng phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh ampicillin tetracycline Bằng phương pháp HPLC với điều kiện Viện, chúng tơi phân tích hàm lượng proline mẫu Đồng thời, xây dựng phương trình đường chuẩn hai loại kháng sinh ampicillin tetracycline Kết phân tích 10 mẫu cây, nhận thấy hàm lượng proline biến thiên từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g với giới hạn phát phương pháp LOD = 0,02 μg/g, cho thấy khả phát cao Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích proline 81,92% nằm khoảng cho phép theo quy định Cục Bảo vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp phát triển Nơng thơn Các phương trình đường chuẩn xây dựng tốt, áp dụng thực tế phân tích: Phương trình đường chuẩn proline: y = 63,70x + 15,24 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,964; Phương trình đường chuẩn ampicillin: y = 1,996x + 0,119 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 1; Phương trình đường chuẩn tetracycline: y = 68,32x – 103,1 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,999 iv    ABSTRACT "Application of high performance liquid chromatography in proline analysis and the building standard curve of ampicillin and tetracycline", a scientific research study title, was carried out from March to July 2010 at Research Institute for Biotechnology and Environment (RIBE), Nong Lam University, Ho Chi Minh City The aim of the study was to appriciate the effect of high performance liquid chromatography (HPLC) in proline analysis in leaves and the building of ampicillin and tetracycline standard curve By HPLC method under current conditions at RIBE, we have built the standard way of proline, determined recovery efficiency and quantify proline content in leaves Simultaneously, we have also built ampicillin and tetracycline standard curve The analyzed results have been recorded: proline content in leaves samples varies from 1,22 μg/g to 2,62 μg/g with the limit of detection LOD = 0,02 μg/g Recovery efficiency of proline is 81,92 % , which can be permitted under the provisions of the Plant Protection Department, Ministry of Agriculture and Rural Development The equation has built a standard way: Proline: y = 63,70 x + 15,24; Correlation Cofficient R2 = 0,964 Ampicillin: y = 1,996 x + 0,119; R2 = Tetracycline: y = 68,32 x – 103,1; R2 = 0,999 The results showed that the quantitative ability of HPLC was very positive In fact, HPLC can be practically applied in the analysis of compounds v    MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Phiếu xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Cảm tạ iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xii Danh sách sơ đồ, công thức xiii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu phương pháp HPLC 2.1.1 Lịch sử 2.1.2 Phân loại HPLC 2.1.3 Nguyên tắc vi    2.1.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 2.1.5 Ứng dụng HPLC 2.2 Sử dụng HPLC phân tích số hoạt chất 11 2.2.1 Proline 11 2.2.2 Ampicillin 12 2.2.3 Tetracycline 16 2.3 Một số nghiên cứu trước việc phân tích HPLC Việt Nam 20 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.1.1 Địa điểm 22 3.1.2 Thời gian 22 3.2 Nội dung 22 3.3 Phương pháp 22 3.3.1 Phân tích proline mẫu 22 3.3.1.1 Thiết bị dụng cụ 22 3.3.1.2 Hóa chất 23 3.3.1.3 Quy trình thực 23 3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin 27 3.3.2.1 Thiết bị dụng cụ 27 3.3.2.2 Hóa chất 27 3.3.2.3 Quy trình thực 27 3.3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline 28 3.3.3.1 Thiết bị dụng cụ 28 vii    3.3.3.2 Hóa chất 28 3.3.3.3 Quy trình thực 28 3.4 Các tiêu theo dõi 29 3.4.1 Phương trình đường chuẩn proline 29 3.4.2 Hàm lượng proline mẫu 29 3.4.3 Hiệu suất thu hồi R quy trình định lượng proline 30 3.4.4 Giới hạn phát quy trình phân tích proline 30 3.4.5 Phương trình đường chuẩn ampicillin 30 3.4.6 Phương trình đường chuẩn tetracycline 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Phương trình đường chuẩn proline 31 4.2 Hàm lượng proline mẫu 33 4.3 Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích proline mẫu 36 4.4 Giới hạn phát phương pháp (LOD) 37 4.5 Phương trình đường chuẩn ampicillin 38 4.6 Phương trình đường chuẩn tetracycline 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 DANH SÁCH PHỤ LỤC 48 viii    DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ tiếng Anh ACN Acetonitrile GC Gas Chromatography Sắc ký khí HPTLC High Performance Thin Layer Sắc ký mỏng hiệu Chromatography cao Inductively Coupled Plasma Atomic Phổ hấp thụ, phát xạ Absorption Spectroscopy nguyên tử Liqid Chromatography/ Mass Sắc ký lỏng ghép phổ khối ICP - AAS LC/MS Tạm dịch Spectrometry MS Mass Spectrometry phổ khối ppb part per billion phần tỷ ppm part per million phần triệu ppt part per trillion phần nghìn tỷ ix    - 130 % theo quy định Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thơn (2008) Điều cho thấy quy trình phân tích proline đảm bảo độ tin cậy, mức độ mẫu q trình phân tích chấp nhận Hàm lượng mẫu phần đuổi khí khơng kĩ trước lúc thủy phân, oxy lọ thủy phân gây oxy hóa proline Phần khác mẫu bị dính lại giấy lọc lọc dịch thủy phân, bị q trình tạo dẫn xuất Ngồi ra, chênh lệch thay đổi dung môi pha động pH nhiệt độ xung quanh Do vậy, thực việc phân tích điều kiện định làm giảm bớt sai lệch thời gian lưu 4.4 Giới hạn phát phương pháp (LOD) Dùng nồng độ chuẩn proline thể tích μl, xác định diện tích peak proline S = 67,8; diện tích peak nhiễu đường N = 0,284  tỷ lệ S/N = 238,5 Để đạt S/N = cần 0,025 μl proline hay nồng độ proline 0,02 μg/g (ppm) Vậy giới hạn phát hay LOD phương pháp 0,02 μg/g (xem chi tiết phần phụ lục) So với hàm lượng proline mẫu phân tích, giới hạn phát có ý nghĩa, cho thấy khả phát proline quy trình cao 4.3 Phương trình đường chuẩn ampicillin Các chuẩn ampicillin chuẩn bị phần 3.3.2 dùng để chạy máy HPLC cho sắc ký đồ tương ứng Kết thời gian lưu (TR) diện tích peak ampicillin nồng độ chuẩn (Sm) thu từ sắc ký đồ HPLC trình bày bảng 4.5 37    Bảng 4.5 Thời gian lưu diện tích nồng độ chuẩn ampicillin C 2,5 10 50 100 TR 5,796 5,800 5,833 5,828 5,821 5,816 Sm 1,5738 4,8472 10,5000 20,3292 100,3590 199,5650 (ppm) Hình 4.5 Sắc ký đồ chuẩn ampicillin 50 ppm Lập phương trình đường chuẩn ampicillin dựa vào giá trị Sm thu 38    Hình 4.6 Đường chuẩn ampicillin Ở sắc ký đồ, peak ampicillin xuất khoảng phút thú 5, từ phút thứ 5,796 tới phút thứ 5,833 Các peak đẹp rõ, đường ổn định Diện tích peak ampicillin (Sm) tăng dần theo nồng độ ampicillin Phương trình đường chuẩn ampicillin: y = 1,996x + 0,119 Hệ số tương quan phương trình R2 = Hệ số tương quan R2 1, đồng nghĩa với mối quan hệ nồng độ diện tích chuẩn chặt chẽ, tương quan tuyến tính tốt Phương trình áp dụng trực tiếp cho việc xác định hàm lượng ampicillin đối tượng mẫu cụ thể 4.4 Phương trình đường chuẩn tetracycline Xây dựng phương trình đường chuẩn tetracycline dựa vào điểm chuẩn với nồng độ ppm; 10 ppm; 20 ppm; 40 ppm; 50 ppm; 100 ppm Kết thời gian lưu (TR1, TR2) diện tích peak tetracycline (Sm1, Sm2, Sm) nồng độ trình bày bảng 4.6 39    Bảng 4.6 Thời gian lưu diện tích nồng độ chuẩn tetracycline C 10 20 40 50 100 TR1 8,183 8,181 8,188 8,141 8,103 8,037 Sm1 153,755 294,568 645,234 1309,701 1655,624 3060,938 TR2 8,640 8,632 8,675 8,604 8,581 8,510 Sm2 123,555 238,975 603,607 1304,969 1709,338 3654,508 Sm 277.3105 533,5443 1248,842 2614,670 3364,9635 6715,4473 (ppm) Hình 4.7 Sắc ký đồ chuẩn tetracycline 40 ppm 40    Tín hiệu tetracycline xuất dạng peak đôi vào khoảng phút thứ 8, từ 8,103 đến 8,188 peak thứ nhất, từ 8,510 đến 8,675 peak thứ hai Do từ diện tích nồng độ chuẩn có bảng 4.5, lấy giá trị theo Sm ta dựng phương trình đường chuẩn tetracycline Phương trình đường chuẩn tetracycline: y = 68,32x – 103,1 Hệ số tương quan R2 = 0,999 Hình 4.8 Đường chuẩn tetracycline Trong mẫu chuẩn đem chạy HPLC, chúng tơi nhận thấy tín hiệu tetracycline xuất dạng peak đôi liền tuyến tính gần Ngun nhân tính chất tetracycline Tetracycline dạng bazơ tinh thể lưỡng tính, hòa tan nước (1 : 2500) Dạng HCl tinh thể hút ẩm, dễ tan nước (1 : 10), pha thành dung dịch dễ biến màu vàng sậm, bị thủy phân ngưng kết thành dạng bazơ Cả hai dạng không tan dung mơi hữu cơ, dễ hòa tan acid hay chất kiềm (Võ Văn Ninh, 2001) Một nguyên nhân tách khơng tốt cột sắc ký Do vậy, xử lý số liệu để lập 41    phương trình đường chuẩn tetracycline, lấy giá trị Sm, tức giá trị tổng peak đôi (Sm1 Sm2) Chúng không nhận tín hiệu tetracycline sắc ký đồ nồng độ ppm (khơng xuất peak tetracycline) Thí nghiệm lặp lại lần, sở pha lại chuẩn thay thử cột khác khơng có kết Kết luận giới hạn phát (LOD – Limit of Detection) quy trình chưa cao Hệ số tương quan cao (R2 = 0,999), cho thấy nồng độ diện tích chuẩn tetracycline có liên quan chặt chẽ với nhau, tương quan tuyến tính tốt Phương trình dùng việc tính toán hàm lượng tetracycline đối tượng mẫu cụ thể 42    CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình thực đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích proline xây dựng đường chuẩn ampicillin tetracycline”, rút số kết luận sau: Quy trình phân tích proline có hiệu cao với hiệu suất thu hồi trung bình quy trình 81,92 % nằm khoảng cho phép Cục Bảo vệ thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn, giới hạn phát phương pháp 0,02 μg/g (ppm) áp dụng định lượng proline mẫu Hàm lượng proline mẫu phân tích từ 1,22 μg/g đến 2,62 μg/g cho thấy sống điều kiện khơng q khơ hạn Phương trình đường chuẩn proline y = 63,70x + 15,24 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,964, áp dụng tính toán hàm lượng proline mẫu Đã xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin y = 1,996x + 0,119 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 1, phương trình đường chuẩn tetracyclline y = 68,32x – 103,1 với hệ số tương quan tuyến tính tốt R2 = 0,999 làm sở bước đầu cho phân tích định lượng ampicillin tetracycline loại mẫu cụ thể Hạn chế đề tài: hạn chế thời gian kinh tế, chúng tơi thực phân tích proline mẫu cây, với xây dựng phương trình đường chuẩn ampicillin tetracycline, chưa thực việc phân tích hàm lượng loại kháng sinh đối tượng mẫu cụ thể (thịt, gan…) Đồng thời chưa áp dụng 43    phương pháp HPLC phân tích acid amin khác, acid bazơ hữu cơ, lipid, hợp chất cao phân tử… 5.2 Đề nghị Nên lặp lại thí nghiệm nhiều lần khảo sát thêm mức khác điều kiện khác Có thể điều chỉnh hệ dung mơi, pha động, cách thức tiến hành… xem xét thay đổi, từ lựa chọn quy trình hồn thiện có hiệu Tiến hành việc phân tích hàm lượng ampicillin tetracycline đối tượng mẫu cụ thể (gan, thịt, dược phẩm, thức ăn gia súc…) Dùng phương pháp HPLC phân tích acid amin khác, acid bazơ hữu cơ… 44    TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh dùng cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng 2.Võ Thị Trà An, 2001 Tình hình sử dụng kháng sinh dư lượng kháng sinh thịt gà sở chăn nuôi gà công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Luận văn thạc sĩ Khoa học nông nghiệp, ĐH Nông Lâm TP HCM 3.Nguyễn Như Pho Võ Thị Trà An, 2001 Bài giảng Dược lý thú y Đại học Nông Lâm TP.HCM 3.Trần Tử An, 2005 Kiểm nghiệm dược phẩm Nhà xuất Y học Hà Nội 5.Bộ Y tế, 2006 Dược thư Quốc gia Việt Nam Nhà xuất Y học 6.Bùi Thị Tho, Nghiêm Thị Anh Đào, 2005 Giáo trình Dược lý thú y Nhà xuất Hà Nội 7.Võ Thị Bạch Huệ Vĩnh Định, 2008 Hóa phân tích, tập 2, sách đào tạo dược sĩ đại học Nhà xuất Y học Hà Nội 8.Lê Thị Thiên Hương Phan Thị Thùy Chi, 2008 Định lượng đồng thời acid folic pyridoxine hydrochloride viên nang Feroglobin B12 phương pháp HPLC Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc số – 2008, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương 9.Dương Thanh Liêm, 2009 Giáo trình Độc chất học Đại học Nơng Lâm TP.HCM 10.Phạm Luân, 2006 Bài giảng Cơ sở lý thuyết HPLC Đại học Quốc gia Hà Nội 11.Võ Văn Ninh, 2001 Kháng sinh thú y Nhà xuất Trẻ 12.Đào Văn Phan, 2009 Dược lý học, tập Nhà xuất Giáo Dục 13.Nguyễn Phi Kim Phụng, 2007 Phương pháp cô lập chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 45    14.Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009 Giáo trình hóa dược Đại học Y dược TP.HCM 15.Hồ Viết Quý, 2007 Các phương pháp phân tích cơng cụ hóa học đại Nhà xuất Đại học Sư phạm Hà Nội 16.Hồ Viết Quý, 2006 Cơ sở Hóa học phân tích đại, tập Nhà xuất Đại học Sư phạm Hà Nội 17.Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trung tâm đào tạo phát triển sắc ký TP Hồ Chí Minh 18.Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008 HPLC/MS Trung tâm đào tạo phát triển sắc ký TP Hồ Chí Minh 19.Hà Diệu Thúy, 2009 Tình hình sử dụng tồn dư kháng sinh họ cycline thức ăn chăn nuôi heo heo thịt giết mổ địa bàn TP Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược Thú y, ĐH Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 20.Nguyễn Ngọc Tn, 2002 Vệ sinh thịt Nhà xuất Nông nghiệp TP.HCM 21.Hà Dun Tư, 2009 Phân tích hóa học thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội 22.Lê Thúy Tươi, 2007 Chế độ ăn cân dưỡng chất Báo Sức khỏe Đời sống Tài liệu tiếng nước 23.Levin S., 2002 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for Clinical and Biomedical (HPLC handouts) Truy cập ngày tháng năm 2010 24.Christine Miller, John Jaskowiak, 2001 HPLC for food analysis, a Primer Truy cập ngày tháng năm 2010 25.Edman, 1950 Acta Chemica Scandinavica, pp 283 26.Gzik A., 1996 Accumulation of proline and pattern of acid in sugar beet plants in response to osmotic, water and salt stress Enviromental and Experimental Botany, 39 (1): 29 - 38 46    Tài liệu Internet 27.Alia A., Mohanty P Matysik J., 2001 Effect of proline on the production of singlet oxygen Truy cập ngày 18 tháng năm 2009 28.Dương Văn Nhiệm, 2005 Phân tích bước đầu tồn dư tetracycline thịt lợn thị trường Hà Nội Truy cập ngày tháng năm 2010 29.Cục bảo vệ thực vật, 2008 Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc BVTV rau máy sắc ký khí, phục vụ kiểm sốt nơng sản an tồn Tập san Bảo vệ thực vật số - 2008 Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn Truy cập ngày tháng năm 2010 30.Doyle, F.P., J.H.C Nayler, G.N Rolinson, 1960 Recovery of solid aminopenicillanic acid Truy cập ngày 15 tháng năm 2010 31.Klajn, Rafal, 2007 Chemistry and chemical biology of tetracyclines Truy cập ngày 24 tháng 12 năm 2009 32.Nguyễn Thế Thức, 2005 Protein Truy cập ngày 10 tháng năm 2010 3 33.Sigma-Aldrich Co Ampicillin Truy cập ngày 20 tháng năm 2010 34.Sigma-Aldrich Co Proline Truy cập ngày 20 tháng năm 2010 47    PHỤ LỤC Phụ lục PHA CÁC DUNG DỊCH CHUẨN VÀ CÁC DUNG MÔI 1.1 Trong qui trình định lượng proline  Pha dung dịch chuẩn, dẫn xuất, pha động * Dung dịch HCl N: từ dung dịch HCl đậm đặc 37 % pha thành 100 ml dung dịch HCl N: nHCl = (N) 0,1 (l) = 0,6 (mol) VHCl = (nHCl MHCl 100)/(C % D) = (0,6 36,5 100)/(37 1,18) = 50,16 (ml) VH2O = 100 – VHCl = 100 – 50,16 = 49, 84 (ml)  Hút 50,16 ml dung dịch HCl 37 % pha với 49,84 ml H2O 100 ml dung dịch HCl N * Dung dịch HCl 0,1 N: Hút ml dung dịch HCl N pha với 59 ml H2O 60 ml dung dịch HCl 0,1 N * Dung dịch pha mẫu: 710 mg Na2HPO4 +1 l nước cất Điều chỉnh pH = 7,4 H3PO4 10 % * Dung dịch tạo dẫn xuất 1: EtOH: H2O: TEA = : : (v:v:v) * Dung dịch tạo dẫn xuất 2: EtOH: H2O: TEA: PITC = : : : (v:v:v:v) * Dung dịch chuẩn gốc: 10 mg chuẩn proline dạng bột, hòa tan 10ml dd HCl 0,1 N dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 mM Hút 100 µl dung dịch chuẩn gốc 100 mM + 900 µl dd HCl 0,1 N  dung dịch chuẩn 10 mM * Pha động: đánh sóng siêu âm, lọc chân khơng qua màng lọc 0,45 µm - Pha động A: 600 ml ACN + 400 ml H2O (lọc, khử) 48    - Pha động B: 19 g aceton de sodium trihydrate + l H2O lọc khử + 0,5 ml TEA Chỉnh pH 6,4 acid acetic Lấy 940 ml dung dịch + 60 ml ACN  dd B 1.2 Trong xây dựng đường chuẩn ampicillin  Chuẩn bị đường chuẩn: Cân xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hoà tan nước cất lọc khử (lọc chân không qua màng 0,45 μm), đánh siêu âm phút, chuẩn 1000 ppm Từ chuẩn 1000 ppm, ta pha thành chuẩn 200 ppm; 100 ppm; 50 ppm; 10 ppm; ppm; 2,5 ppm; ppm - Chuẩn 200 ppm: hút xác ml chuẩn 1000 ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn 100 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 200 ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn 50 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn 10 ppm: hút xác ml chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn 2,5 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc - Chuẩn ppm: hút xác ml chuẩn ppm cho vào bình định mức ml, thêm nước cất tới vạch, lắc  Pha động - Pha động A: dd đệm phosphate (KH2PO4 0,1M): 13,6 g KH2PO4 hòa tan với nước cất bđm 1000 ml (chỉnh tới vạch), đánh siêu âm 10 phút, chỉnh pH 2.5 với H3PO4 đđ, lọc chân không qua màng 0,45 μm, đánh siêu âm 15 phút - Pha động B: ACN 100% 49    1.3 Trong xây dựng đường chuẩn tetracycline  Chuẩn bị đường chuẩn: Cân xác 10 mg chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hồ tan dung mơi Methanol (MeOH) Từ chuẩn 1000 ppm, ta pha thành chuẩn 100 ppm; 50 ppm; 40 ppm; 20 ppm; 10 ppm; ppm; ppm: - Chuẩn 100 ppm: hút xác ml chuẩn 1000 ppm cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn 50 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 100 ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn 40 ppm: hút xác ml chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn 20 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 40 ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn 10 ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 20 ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn ppm: hút xác 2,5 ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc - Chuẩn ppm: hút xác ml chuẩn ppm cho vào bình định mức ml, thêm MeOH tới vạch, lắc  Pha động: - Pha động A: nước cất lần, chỉnh pH 2,1 H2SO4 với pH kế, đánh siêu âm 15 phút Sau đem lọc qua màng lọc 0,45 μm với bình lọc chân khơng - Pha động B: ACN 100 % 50    Phụ lục Tính LOD quy trình phân tích proline Từ bảng 4.2, xét mẫu M1: Ở nồng độ Cm = 2,12 μg/g  Sm = 25,11 Chuẩn proline thể tích μl, Sm = 67,8  Nồng độ Cm = 5,72 μg/g  Chuẩn proline thể tích 0,025 μl có nồng độ:    0,02  μg/g   Cm    51    ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y **************** NGUYỄN THỊ MINH NHUNG ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG PHÂN TÍCH PROLINE VÀ... ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG BSTY ĐẶNG THỊ XUÂN THI P Tháng năm 2010 i    PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Minh Nhung Tên luận văn: Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu... đóng góp Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày … tháng … năm 2010 TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2010 Giáo viên hướng dẫn ThS Phùng Võ Cẩm Hồng BSTY Đặng Thị Xuân Thi p ii    CẢM TẠ Em xin