Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm tiến hành điều chế asiaticosid có độ tinh khiết cao từ bột trích tinh Rau má bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Và sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích để thăm dò điều kiện thích hợp, từ đó áp dụng qua máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế để thu được asiaticosid.
ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN ASIATICOSID Nguyễn Thụy Hai*, Nguyễn Minh Đức* TĨM TẮT Mục tiêu: Tiến hành điều chế asiaticosid có độ tinh khiết cao từ bột trích tinh Rau má phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp: Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao phân tích để thăm dò điều kiện thích hợp, từ áp dụng qua máy sắc ký lỏng hiệu cao điều chế để thu asiaticosid.(2) Kết quả: Thu asiaticosid có độ tinh khiết cao sử dụng làm chất chuẩn với điều kiện sắc ký điều chế sau: Cột Discovery HS C18 (250 x 21,2mm; 10µm), với pha động hỗn hợp gồm methanol – nước (60:40), tốc độ dòng 20ml/phút, đầu dò SPD đặt 203 nm Cấu trúc hóa học độ tinh khiết xác định lại phương pháp NMR.(1) Kết luận: Bằng sắc ký lỏng hiệu cao, điều chế chất chuẩn có độ tinh khiết cao cách nhanh chóng hiệu Từ khóa: điều chế, sắc ký lỏng hiệu cao phân tích, asiaticosid ABSTRACT PREPARATION OF ASIATICOSIDE REFERENCE STANDARD BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Nguyen Thuy Hai, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No - 2010: 59-63 Objective: Preparation of asiaticoside with high purity from a powder extract of Centella asiatica by preparative high performance liquid chromatography (HPLC) method Method: Using analytical HPLC to determine the appropriate separating conditions, we carried out the found conditions to the preparative HPLC to obtain asiaticoside Results: We obtained asiaticoside of high purity which can be used as standard with the preparative HPLC conditions as follows: Discovery HS C18 column (l:250 x i.d :21.2 mm; particle size: 10µm), mobile phase: MeOH – H2O (60: 40), flow rate 20ml/min, SPD- 20A detector set at 203 nm Chemical structure and purity of asiaticoside were determined by conventional methods (analytical HPLC and NMR) Conclusions: By preparative HPLC, we can produce asiaticoside with standard grade, the process was proven more quickly and efficient than classical methods Key words: preparation, analytical HPLC, asiaticoside khai thác sử dụng nguồn tài nguyên thuốc ĐẶT VẤN ĐỀ dồi đất nước ta Hiện nhiều Một điểm yếu lớn phương pháp kiểm nghiệm đại việc khai thác sử dụng thuốc phương pháp phổ, sắc ký lỏng hiệu cao chế phẩm từ thuốc vấn đề kiểm soát hữu hiệu việc tiêu chuẩn hoá chất lượng Điều làm hạn chế khả * Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp.HCM Địa liên hệ: DS Nguuyễn Thụy Hai ĐT: 01696831286 Email: ngthuyhai1986@gmail.com kiểm định thuốc thuốc từ dược liệu Tuy nhiên, để áp dụng phương pháp này, yêu cầu phải có chất chuẩn Hơn nữa, chất chuẩn cần thiết cho cơng tác nghiên cứu phát triển dược liệu chế phẩm từ dược liệu Tuy nhiên, khó khăn cho việc phân tích, kiểm nghiệm nước ta thiếu chất chuẩn cần thiết, chất chuẩn mua từ nước ngồi đắt tiền, nhiều khơng có sẵn Xuất phát từ lý trên, đề tài thực nhằm mục tiêu chiết xuất, điều chế asiaticosid để làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm định thuốc, tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm nguyên liệu chứa asiaticosid ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Bột trích tinh rau ml/ lần Kết Tín hiệu proton nhóm metin nối trực tiếp với oxigen cộng hưởng trường thấp 6,15ppm (1H, d, J = 8Hz); 5,39ppm (1H, d, J = 3,5Hz); 4,95ppm (1H, d, J = 7,5Hz) gán cho proton vị trí 1’, 1’’, 1’’’ Hình Sắc ký đồ bột trích tinh rau má máy HPLC điều chế bơm overload tín hiệu proton vị trí 4,38ppm (1H, t, J = 9Hz) gán cho proton vị trí 12 Sau thu nhận phân đoạn chính, ta tiến hành cô giảm áp thu lấy tinh thể asiaticosid Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu gán cho proton nhóm –CHOH aglycon chuỗi đường Các tín hiệu bị chồng phủ nên khó xác định xác Tiến hành tinh chế lần với điều kiện sắc ký thăm dò Hình Sắc ký đồ asaticosid tinh chế lần máy HPLC điều chế Phổ 13C NMR, DEPT90 DEPT135 cho thấy mũi cộng hưởng ứng với 48 carbon bao gồm carbon carbonyl nhóm ceton bất bão hòa cộng hưởng trường thấp [δC = 176,2; C-28]; carbon bảy nhóm metyl nằm vùng từ 13,0 – 25,0 ppm; mười nhóm metylen carbon ba nhóm metylen nối trực tiếp với oxigen cộng hưởng vị trí [δC = 66,7; C-23], [δC = 69,0; C-6’], [δC = 61,1; C-6’’], carbon tám nhóm metylen lại nằm vùng từ 18,0 – 50,0 ppm; ba nhóm metin có carbon nối trực tiếp với oxigen cộng hưởng vị trí [δC = 95,7; C-1’], [δC = 105,0; C-1’’], [δC = 102,6; C-1’’’]; hai carbon nối đôi cộng hưởng vị trí [δC = 125,9; C-12], [δC = 138, 8; C-13] Dựa sắc ký đồ từ máy HPLC điều chế ta dễ dàng thu nhận asaticosid tinh khiết (phân đoạn 9,518 phút) Bảng Bảng liệu phổ 13C-NMR SAS (pyridineD5) so với liệu phổ 13C-NMR asiaticosid Mẫu bơm vào lượng asiaticosid thu từ lần tinh chế (đã có độ tinh khiết cao) pha với nồng độ 200 – 300mg/ 10ml pha động Kết Tiến hành cô giảm áp để thu lấy tinh thể asiaticosid tinh khiết Tiến hành kiểm tra lại phương pháp NMR.(1) Kết Phổ 1H-NMR (pyridinD5) cho tín hiệu đặc trưng sau: tín hiệu proton 0,85ppm (3H, s); 0,87ppm (3H, s); 0,89ppm (3H, s); 1,04ppm (3H, s); 1,06ppm (3H, s); 1,11ppm (3H, s); 1,15ppm (3H, s) gán cho nhóm – CH3 vị trí 24, 25, 26, 27, 29, 30, 6’’’ C SAS Asiaticosid C SAS Asiaticosid 10 11 12 13 14 48,1 68,9 78,3 43,6 48,1 18,6 31,1 40,5 48,0 38,3 23,4 125,9 138,8 42,9 47,8 68,9 78,1 43,6 48,1 18,4 33,1 40,2 48,0 38,3 23,8 126 138,5 42,5 25 26 27 28 29 30 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ 18,0 18,1 23,8 176,2 17,8 21,2 95,8 73,9 77,9 71,0 77,1 69,4 104,9 75,3 17,6 17,8 23,7 176,3 17,3 21,3 95,6 73,9 77,9 70,9 77,1 69,3 104,8 75,3 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 28,9 24,9 48,4 53,3 39,2 39,1 31,1 37,0 66,8 14,5 28,7 24,5 48,4 53,2 39,3 39 30,8 36,8 66,4 14,3 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 1’’’ 2’’’ 3’’’ 4’’’ 5’’’ 6’’’ 76,5 78,7 78,3 61,3 102,6 72,5 72,7 73,8 70,3 18,7 76,4 78,6 78,2 61,3 102,6 72,5 72,7 73,7 70,2 18,4 Điều chế asiaticosid với lượng lớn Sau điều chế tiến hành kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc hóa học NMR Tiết kiệm nhiều công đoạn, dung môi, hóa chất, đặc biệt thời gian Khơng tách asiaticosid mà đồng thời thu thêm chất khác madecassosid… Qua trình tiến hành đề tài, khơng thu chất chuẩn mà đề phương pháp điều chế, phân lập ổn định, sở để điều chế chất chuẩn có qui mơ lớn tương lai TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Asiaticosid KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành đề tài “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao điều chế chất chuẩn asiaticosid” thu số kết sau: Nguyễn Kim Phi Phụng (2005) Phổ NMR sử dụng phân tích hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Minh Đức (2006) Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên Nhà xuất Y học ...KHẢO Hình Asiaticosid KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành đề tài Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao điều chế chất chuẩn asiaticosid thu số kết sau: Nguyễn Kim Phi Phụng (2005) Phổ NMR sử dụng phân .. .asiaticosid mà đồng thời thu thêm chất khác madecassosid… Qua q trình tiến hành đề tài, khơng thu chất chuẩn mà đề phương pháp điều chế, phân lập ổn định, sở để điều chế chất chuẩn có qui mô lớn tương ... ta thiếu chất chuẩn cần thiết, chất chuẩn mua từ nước ngồi đắt tiền, nhiều khơng có sẵn Xuất phát từ lý trên, đề tài thực nhằm mục tiêu chiết xuất, điều chế asiaticosid để làm chất chuẩn phục