Khảo sát và đánh giá phương pháp chiết cặp ion đo quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng chế chlorpheniramin maleate trong chế phẩm thuốc đa thành phần

phương pháp này thường tỏ ra không hữu hiệu.Trong trường hợp này phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC thường được áp dụng để định lượng các chế phẩm trên.Dược điển Mỹ 24 đưa ra các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

===== m =====

Nguyễn Việt H o à

KHẢO SÁT, ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP CHIế T

CẶP ION - ĐO QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỊNH LƯỢNG CHLORPHENIRAMIN MALEATE TRONG CHế PHẩM t h u ố c đ a t h à n h p h ầ n

Luận văn Thạc sĩ dược học

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Dược phâm r- Độc chất học

1.3 Các phương pháp định lưọng Chlorpheniramin maleate 05

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

2.1.1 Các mẫu sử dụng trong khảo sá t phương pháp 212.1.2 Các mẫu sử dụng trong thử áp dụng phương pháp 22

2.3.1.Phương pháp chiết cặp ion - đo quang định lượng

Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần 242.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để định lượng đổng thời

Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid,

định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần 262.3.3 So sánh phương pháp chiết cặp ion - đo quang

và phương pháp HPLC định lượng Chlorpheniramin maỉeate 29

3.1 Định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần

3.1.2 Nồng độ và thể tích dung dịch thử

3.1.3 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch chiết

3.1.4 Khảo sát độ ổn định của dịch chiết

3.1.5 Khảo sát số lần chiết và lượng dung môi chiết

3.1.6 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa độ hấp thụ

và nồng độ Chlorpheniramin maleate

3.1.7 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp chiết cặp ion - đo quang

3.1.8 Khảo sát độ đúng của phương pháp chiết cặp ion - đo quang

3.2 Xây dựng phương pháp HPLC định lượng đồng thời

Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid, định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần

3.2.1 Tóm tắt, đánh giá một số quy trình định lượng

Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần

bằng phương pháp HPLC

3.2.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời

Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid,

định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần

3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích píc

và nồng độ các chất: Chlorpheniramin maleate,

Phenylpropanolamin hydroclorid, Paracetamol

3.2.4 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC

định lượng Chlorpheniramin maleate

3.2.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC

định lượng Chlorpheniramin maleate

3.3 So sánh hiệu quả của hai phương pháp

trong việc định lượng Chlorpheniramin maleate

3.3.1 So sánh kết quả hai phương pháp

3.3.2 Đánh giá ưu, nhược điểm của hai phương pháp

3.4 Kết quả khảo sát thử áp dụng phương pháp

Chương 4: BÀN LUẬN VE KẾT QUẢ

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

333435

353738

39

39

40

454951

54545556576062

HPLC: High performance Liquid chromatography

u v - VIS: Tử ngoại - Khả kiến

TCCS: Tiêu chuẩn cơ sở

kl/tt: Khối lượng trên thể tích,

vđ: Vừa đủ

dd: Dung dịch

ĐẬT VÂN ĐỂ

Với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các thành tựu khoa học của ngành dược, các dạng bào chế đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng dược lý giữa các hoạt chất ngày càng được sản xuất, lưu hành, sử dụng rộng rãi và có mặt rộng khắp trên thị trường thuốc Nhiều biệt dược đã trở nên quen thuộc với người tiêu dùng Trong số đó nhóm thuốc hạ nhiệt, giảm đau là phổ biến nhất Các biệt dược này thường phối hợp 2 hoặc 3 thành phần trong số các chất: Paracetamol, Chlorpheniramin maleate, Phenylpropanolamin hydroclorid Chlorpheniramin maleate là một dược chất có tác dụng kháng Histamin có mặt trong hầu hết các chế phẩm đã nói ở trên Ngoài ra Chlorpheniramin maleate còn được phối hợp trong các thuốc chống dị ứng, thuốc h o

Vì có tác dụng mạnh nên hàm lượng Chlorpheniramin maleate trong các chế phẩm đều nhỏ ( 2 - 4 mg ), rất chênh lệch so với các hoạt chất khác Chính vì vậy phương pháp phân tích gặp nhiều khó khăn, phức tạp Theo qui định của các Dược điển hiện hành:Dược điển Anh-98 [5], Dược điển Châu âu -97 [17], Dược điển Việt nam i n [20] thì Chlorpheniramin maleate không những phải định lượng

mà còn phải thử độ đồng đều hàm lượng Có nghĩa là đòi hỏi phải có một phương pháp định lượng có độ nhạy và độ chính xác cao Trong khi đó hầu hết các Dược điển chỉ có phương pháp định lượng đối với chế phẩm đơn thành phần, còn với các chế phẩm đa thành phần thì tiêu chuẩn của các nhà sản xuất đưa ra rất khác nhau: Phương pháp quang phổ tử ngoại, phương pháp chuẩn độ môi trường khan, phương pháp so m àu C ác phương pháp này thường phải chiết tách phức tạp, tốn nhiều thời gian Đặc biệt phương pháp chiết cặp ion- đo quang được đa số tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) áp dụng thì kỹ thuật tiến hành lại khác nhau, không đảm bảo độ chính xác Hơn nữa nếu trong chế phẩm có chứa 4 hoạt chất trở lên thì các

phương pháp này thường tỏ ra không hữu hiệu.Trong trường hợp này phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được áp dụng để định lượng các chế phẩm trên.

Dược điển Mỹ 24 đưa ra các hệ dung môi để định lượng từng dược chất trong thuốc đa thành phần ( trong đó có Chlorpheniramin maleate ) không qua quá trình chiết tách [33] Ở trong nước cũng đã có khá nhiều công trình nghiên cứu cũng như một số tiêu chuẩn cơ sở đưa ra phương pháp HPLC định lượng đồng thời Chlorpheniramin maleate và các thành phần khác trong thuốc đa thành phần Tuy nhiên các nghiên cứu trên mới chỉ được thực hiện trên từng chế phẩm thuốc nhất định với những điều kiện phân tích khác nhau, mà chưa đưa ra được một qui trình chung trong việc phân tích các thuốc đa thành phần đã nói ở trên Thực tế phân tích tại Viện kiểm nghiệm cho thấy cả phương pháp sắc ký pha thuận và phương pháp sắc ký pha đảo đều được sử dụng, nhưng kết quả cho thấy phương pháp sắc ký pha thuận có độ lặp lại không ổn định, nhiều trường hợp chỉ đạt 60 - 80% so với hàm lượng thực [15]

Như vậy trong thực tế kiểm nghiệm, việc định lượng Chlorpheniramin maleate trong các chế phẩm thuốc đa thành phần vẫn còn là một vấn đề cần nghiên cứu tiếp để lựa chọn được phương pháp và kỹ thuật tiến hành cho độ đúng

vậy trong luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm đạt được những mục tiêu sau:

- So sánh, đánh giá một số phương pháp định lượng Chlorpheniramin maleate trong các thuốc đa thành phần

- Đưa ra hai qui trình kỹ thuật thông dụng nhất để áp dụng định lượng

Chlorpheniramin maleate trong một số chế phẩm thuốc đa thành phần

1.3 Các phương pháp định lượng C hlorpheniram in maleate

1.3.1 Phương pháp môi trường khan[17],[26]

Chuẩn độ môi trường khan là phương pháp chuẩn độ acid và base yếu hoặc muối của chúng trong môi trường không phải là nước, Chlorpheniramin maleate

là muối của base hữu cơ nên có thể áp dụng phương pháp này

Trong hỗn hợp có Chlorpheniramin maleate với Dextromethorphan hydrobromid, Paracetamol, Phenylpropanolamin hydroclorid Chiết Dextromethorphan hydrobromid và Chlorpheniramin maleate với Cloroform, bốc hơi hết Cloroform, hoà tan cắn trong acid acetic băng Định lượng bằng dung dịch acid Pecloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể hoặc đo thế (Dextromethorphan hydrobromid có nhóm HBr nên không tham gia phản ứng)

1.3.2 Phương pháp quang p h ổ tử ngoại[2], [5], [8], [13]

Phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên sự hấp thụ năng lượng các bức xạ tử ngoại làm thay đổi mức năng lượng của điện tử, do đó còn được gọi là phổ điện tử

- Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ c , bề dày lớp dung dịch là 1 Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) đi qua dung dịch Sự liên quan giữa các đại lượng được biểu thị theo phương trình:

D = l* Ậ = l g ^ (1 )

Trong đó: D là độ hấp thụ ánh sáng

T là độ truyền quang

- Định luật Lambert - Beer: Nếu không kể đến các yếu tố hoá lý thì độ hấp thụ của dung dịch một chất ở bước sóng xác định tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch và bề dày lớp dung dịch đem đo.

D = k l.c (2)Trong đó: k là hệ số hấp thụ

c là nồng độ dung dịch

1 là bề dày của lớp dung dịch đem đo Trong trường hợp c = 1% (kl/tt), 1 = lcm , t°: 19 - 21°c thì hộ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là EỊ hay E (1%, lcm ), khi đó ta có:

D = EỊ.l.C (3)

Nếu nồng độ c biểu thị là mol/lit thì có hệ số hấp thụ phân tử

Theo Dược điển Anh-98, Dược điển Ấn độ -96, Dược điển Nhật 13: Chlorpheniramin maleate được chiết ra khỏi chế phẩm bằng ether, sau đó chiết lớp ether bằng dung dịch acid sulfuric 0,25M Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng

265 nm/7 7], [23], [32].

Theo một số Tiêu chuẩn cơ sở trong nước, Chlorpheniramin maleate được chiết ra khỏi hỗn hợp thuốc bằng Clorform, kiềm hoá và gạn lấy lớp cloroform Sau đó chiết bằng dung dịch acid acid sulfuric 0,5M , đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 265 nm, từ đó xác định được hàm lượng Chlorpheniramin

1.3.3 Phương pháp chiết cặp ion - đo quang

• Các đại lượng đặc trưng cho sự chiết[1], [2], [3],[13]

+ Hằng số phân bố: Nếu một dung dịch nước có chất A hoà tan được lắc với một dung môi không hoà tan trong nước, thì khi quá trình phân bố A vào hai pha cân bằng ta có:

Da = ^ L (4)

Trong đó: DA là hằng số phân bố

aA(S), aA(N) hoạt độ của A trong hai pha

Hằng số phân bố D đặc trưng cho chất chiết A, dung môi hữu cơ và nhiệt độ +Hẽ số phân bố: Trong nhiều trường hợp chất A tổn tại trong nước dưới nhiều dạng khác nhau, khi lắc với dung môi một số dạng nằm cân bằng giữa hai pha Đặc trưng cho chiết xuất trong trường hợp này, người ta dùng hệ số phân bố

Đó là tỉ số nồng độ của A trong hai pha

4- w t (5)

+Hiẽu suất chiết R:

Hiệu suất chiết là tỷ số giữa lượng chất A chiết bằng dung môi (£QS) so với lượng chất A ban đầu ( XlQo)-

R=f o 7 (6)

• Nguyên tắc của của phương pháp chiết tạo cặp ion [1], [13]

Khi cho một ion tác dụng với một ion trái dấu có thể hình thành một cặp ion giống như phân tử trung hoà điện và có thể chiết bằng một dung môi hữu cơ ít gây phân ly

A' + B+ <-> A' B+

Cặp ion này có hằng số phân ly là:

(7 )Điều kiện để có thể chiết cặp ion:

- ít nhất một trong hai ion tạo cặp phải có khối lượng lớn và kỵ nước

- pH của pha nước:

Nếu acid HA có hằng số điện ly Ka, để ion hoá 1% tạo ra A' thì:

pH > pKa- 2

Base B có hằng số điện ly Kb, để ion hoá 1% tạo ra BH+ thì:

pH < 16- pKbKết hợp hai điều kiện đó thì để tạo ra cặp ion [BH+A'] , pH pha nước phải nằm trong giới hạn:

pKa- 2 < pH < 16- pKb Quá trình chiết cặp ion tạo ra từ muối amoni bậc 4 R4N+ và anion A' của acid

HA có thể hình dung như sau:

- Nếu cả anion và cation là gốc của acid và base mạnh trong nước tức là các ion không có tính acid, base thì pH không ảnh hưởng.

- Nếu một trong hai ion hoặc cả hai ion tạo cặp có tính acid hay base trong nước thì pH có ảnh hưởng

Ngoài ra còn có một số các yếu tố khác như nhiệt độ, sự tác động của chất hoà tan khác

• K ỹ thuật chiết cặp ion - đo quang

Cho ion cần định lượng tạo cặp ion với một ion đối thu được sản phẩm ( có màu hoặc không màu có đặc tính quang học) Sau đó chiết bằng dung môi hữu

cơ thích hợp rồi đem so màu hoặc đo quang

Theo các tiêu chuẩn cơ sở, Chlorpheniramin maleate được tạo cặp ion với Metyl da cam trong môi trường pH 4,4 - 4,6 Cặp ion này được chiết bằng dung môi hữu cơ là Cloroform tạo dung dịch có màu vàng Dung dịch này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 420 nm - 424 nm So sánh độ hấp thụ của dịch chiết mẫu thử và mẫu chuẩn ( tiến hành song song trong cùng điều kiện), sẽ xác định được hàm lượng Chlorpheniramin maleate trong chế phẩm

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

• Khái quát phương pháp HPLC [2], [7], [20], [32], [27]

Phương pháp HPLC là một phương pháp hoá lý dùng để phân tích, định tính, định lượng các thành phần trong một hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà tan vào nhau: Pha tĩnh ( được bao bên ngoài chất mang và được nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải)

Trong quá trình sắc ký luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn chảy qua cột với tốc độ nhất định Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi đưa vào cột sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và kiểu sắc ký áp dụng Pha động và mẫu thử được bơm qua cột sắc ký dưới áp suất cao

Các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào cấu trúc và tính chất của từng chất Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ còn được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi pha tĩnh Nói cách khác tốc

độ di chuyển của các chất qua cột tuỳ thuộc vào ái lực của chúng với hai pha Kết quả là các chất được phân tách khỏi nhau Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thụ hoặc trao đổi io n

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả Tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector thích hợp [30] Kết quả sau khi xử lý sẽ được đưa

ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình Đường cong rửa giải sau một quá trình sắc ký gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1:

Hình 1: Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.

t0(thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.

tR (thời gian lưu): là thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột chođến khi đươc phát hiện ở nồng độ cực đại của nó

tR’ (thời gian lưu thực) = tR - 10

ôt (độ lệch chuẩn): độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng

co05(độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôt

cob (độ rộng đáy píc)

Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian lưu của chất đó trên cột hay vị trí của píc tương ứng trên sắc ký đồ Tín hiệu phân tích định lượng là diện tích píc hay chiều cao píc thu được phụ thuộc vào nồng độ chất đó trong dung dịch đem phân tích

• Các đại lượng đặc trưng trong HPLC[7], [13], [20], [34], [27]

+Hê số dung lương K ’:

Là đại lượng đặc trưng cho một chất, phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và đặc tính của pha tĩnh và pha động, không phụ thuộc vào tốc độ dòng cũng như chiều dài cột

K = — (8)

cm

- Cs: lượng chất trong pha tĩnh

- Cm: lượng chất trong pha động

- Giá trị K ’ lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng píc, độ nhạy thấp và thời gian lunkéo dài.

+Đố chon loc a:

Là một đại lượng về hiệu quả tách của một hệ thống sắc ký Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị K ’ khác nhau và được đánh giá thông qua thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc a

^ _ ^ R , ~ l R | ) _ 1 >1 7 7 ( t R 2 - t R ,) Q 2 )

^ b l “* " ^ 0 2 ^ 0 ,5 1 + ^ 0 , 5 2

Trong thực tế khi:

R = 0,75 ; hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều.

R = 1,0; hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 ; hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

Độ phân giải phụ thuộc vào các hệ số k2’( hộ số dung lượng của cấu tử rasau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

H = A.u0,33 + — + c.u (14)

Ư

Trong đó: H là chiều cao đĩa lý thuyết

u là tốc độ dòng pha độngA,B,C là các hệ số động học thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc

ký và do các yếu tố sau quyết định :

-Sự khuy ếch tán xoáy

-Sự khuyếch tán phân tử.

-Tốc độ trao đổi chất khác nhau của các chất

• Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng [7], [13], [19], [28]

Theo cơ chế chia tách của sắc ký, nguời ta phân loại như sau:

- Sắc ký hấp phụ: Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau

của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Trong loại này có hai kiểu hấp phụ:

+ Sắc ký hấp phụ pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.+ Sắc ký hấp phụ pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

- Sắc ký phân bố: Bản chất sự tách ở đây là sự phân bố động trong dòng chảy

của chất phân tích giữa hai pha: Pha động và pha tĩnh Pha tĩnh là chất lỏng được phủ lên bề mặt chất mang trơ nhồi trong cột tách Sự tách một hỗn hợp dựa vào qui luật phân bố

- Sắc ký trao đổi ion: Sự tách ở đây là nhờ sự trao đổi ion giữa mẫu phân tích

và pha tĩnh Các tính chất của cân bằng ion quyết định khả năng tách hỗn hợp

- Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel: Sự tách ở đây dựa theo kích thước phân tử

của chất cần phân tích được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào sâu trong lỗ xốp nên được rửa giải ra sau và ngược lại

Trong nhiều trường hợp, ở 3 loại sắc ký đầu, để tăng hiệu quả tách người ta còn sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion Mẫu thử được kết hợp với ion trái dấu đã thêm vào trong pha động tạo ra một cặp ion chiết được bằng pha động hoặc một cặp ion được pha tĩnh hấp phụ chống lại sự đi quá nhanh trong dung môi phân cực để tạo sự chia tách hoặc một cặp ion được pha động rửa giải chống lại sự hấp phụ quá mạnh của pha tĩnh phân cực

• Một s ố qui trình định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần bằng phương pháp HPLC

Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc nói riêng Phương pháp HPLC là phương pháp phân tích hiện đại, tinh tế và hiệu quả, được dùng phổ biến để nghiên cứu các thành phần tong hỗn hợp

Trong hầu hết các dược điển thông dụng hiện hành, chỉ có các chuyên luận định lượng thuốc đơn thành phần, mà không có chuyên luận nào áp dụng cho các thuốc đa thành phần chứa Chlorpheniramin maleate trừ Dược điển Mỹ 24 qui định Chlorpheniramin maleate có thể được định lượng bằng phương pháp HPLC [5], [17], [21], [26], [32], Phương pháp này được áp dụng cho thuốc có chứa ít nhất 3 trong 4 thành phần [33]:

Hỗn hợp: r Paracetamol

Chlorpheniramin maleate Phenylpropanolamin hydroclorid Dextromethorphan hydrobromid Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: 4,6 mm X 15 cm chứa chất nhồi L n

- Pha động : Hỗn hợp Methanol và nước( 60: 40)có chứa 0,34 g Kali dihydrophosphat; 0,15 g Triethylamin hydroclorid; 0,25 g Natri lauryl sulfat; 0,1 ml acid Phosphoric trong 100 ml hỗn hợp

- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút

- Detector ƯV ở bước sóng 214 nm.

Việc định lượng Chlorpheniramin maleate cũng như các thành phần khác được tiến hành riêng rẽ, với cách xử lý mẫu và điều kiện sắc ký khác nhau Quá trình này không phải chiết tách từng thành phần hoạt chất trước khi định lượng Tuy nhiên trong tất cả các Dược điển nói ở trên cũng chưa đưa ra được một hệ dung

môi nhằm định lượng đổng thời Chlorpheniramin maleate và các hoạt chất kể trên bằng phương pháp HPLC.

Hiện nay ở nước ta có nhiều công trình nghiên cứu định lượng đổng thời Chlorpheniramin maleate và một số hoạt chất trong các thuốc hỗn hợp bằng phương pháp HPLC [6], [9], [10], [11], [12], [16]:

+Hỗn hợp:

Chlorpheniramin maleate

< Phenylpropanolamin hydroclorid Dextromethophan hydrobromid Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: ZORBAX SB- C18 (150x4,5 mm; 5|-im)

Pha động: Acetonitril: đệm phosphat (Natridihydrophosphat 1,79 g;nước cất 500 ml; Triethylamin 2ml; acid phosphoric) pH = 2,5

Theo chương trình dung môi: Từ 0 - 12 phút ( 88:12), từ

Pha động: Methanol : đệm pH = 6,5 (3:7)

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Detetor u v 215 nm

tR = 9,55 phút, £% = 1,4

+Hỗn hợp:

' Paracetamol Chlorpheniramin maleate _ Phenylpropanolamin HC1Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký : Lichrosorb Si 60 (250x4 mm; 5 |im)

Pha động: M eth an o l: Đệm Amoni nitrat pH = 9,5 Theo chương trình dung môi: Từ 0 - 7 phút (100:0),

từ 7 - 16 phút (80:20)Tốc độ dòng : 1,2 ml/phút

Detector u v 257 nm

tR = 21,7 phút, 8% = 1,27

Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký : ODS ( 1 5 0 mm;5(j.m)

Pha động : 640 ml Methanol, 360 ml nước, 10 ml acid acetic khan, 1,5 mg Natri heptan sulfonat

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Detector UV: 257 nm

rocloridĐiều kiện sắc ký : Cột sắc ký Lichrosorb Si 60 (250x4 mm; 5 |0,m)

Pha động: M ethanol: Đệm Amoni nitrat pH 9,5 (9:1) Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Hỗn hợp: Paracetamol

Chlorpheniramin maleate Phenylpropanolamin hydroclorid

Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký : L- 300

Pha động: Đệm Phosphat (KH2P 04 2,72 mg; nước cất

1000 ml; Triethylamin 2 ml; H3PO4) pH = 2,7 :Acetonitril (60:40)

N hận xét: Hầu hết các qui trình đều sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ pha

đảo Pha tĩnh sử dụng là các hạt silica(Si02) có kích thước nhỏ ( 3 - 1 0 |im), đã được trung tính hoặc alkyl hoá Pha động là các dung môi phân cực như: Methanol, Acetonitril, Triethylamin, Đệm phosphat pH 2,5; 2,7; Đệm Amoni nitrat pH 6,5; 9,5 Tốc độ dòng 1,0- 1,5 ml/phút Tín hiệu được nhận biết bởiDetector u v ở các bước sóng 214, 215, 262, 265, 270 nm ( là các bước sóng tại

đó Chlorpheniramin maleate có độ hấp thụ cực đại hoặc khá lớn) Thời gian lưu

là 9,20; 12,38; 9,55; 10,77 phút Sai số tương đối là 1,14; 1,26; 1,4; 1,453; 1,49

B ảng 1: Tóm tắt một s ố qui trình định lượng Chlorpheniramin maleate

Detector

u v

(nm)

Thời gian lưu (phút), sai sô

Tài liệu tham khảo 1

Optux Acetonitril :

Đệm NaH2P 0 4 pH=2,5 (88:12)

S B -C 18 (4,5x150;

Các phương pháp trên đều có ưu điểm tiến hành nhanh, chính xác, xử lý mẫu không phức tạp Tuy nhiên hầu hết các phương pháp mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho một số biệt dược nhất định mà chưa đưa ra được một qui trình xử lý mẫu chung và chương trình sắc ký chung nhằm phân tích một dạng thuốc nhất định.

Như vậy, để định lượng Chlorpheniramin maleate cũng như các thành phần khác trong các thuốc đa thành phần kể trên có rất nhiều phương pháp khác nhau Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có sự khảo sát, so sánh, đánh giá các ưu điểm, nhược điểm, độ chính xác và khả năng áp dụng của các phương pháp đó trong điều kiện thí nghiệm ở nước ta Chính vì vậy trong luận văn tốt nghiệp này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát, đánh giá, so sánh các phương pháp định lượng kể trên nhằm tìm ra hướng chung nhất, hiệu quả nhất để định lượng Chlorpheniramin maleate trong các thuốc đa thành phần

CHƯƠNG 2: Đ ố i TƯỢNG, THIẾT BỊ,

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đôi tượng nghiên cứu

2.1.1 Các mẫu sử dụng trong khảo sát phương pháp

• Mẫu Mj là viên nén Pamin

- Công thức:

Chlorpheniramin maleate 2 mg

Số kiểm soát: 061201Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm Hậu giang

• Mãu M2 là viên nang Flue-Cold cap

- Công thức:

Phenylpropanolamin hydroclorid 25 mg

Số kiểm soát: 020202

Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 26

• Mẫu M3 là viên nén Decolgen forte:

• Mẫu M4 là viên nén Win ColdF:

Nơi sản xuất: Công ty Dược liệu trung ương I

2.1.2 Các mẫu sử dụng trong thử áp dụng phương pháp

Bao gồm các biệt dược sau: Dotux, Trianacin, Dehanogel, Tiffy, Neocold, Mexcold Đó là các chế phẩm mà trong thành phần có chứa ít nhất 2 thành phần trong số các chất sau: Paracetamol, Phenylpropanolamin hydroclorid,Chlorpheniramin maleate

1 ml dung dịch Acid Pecloric 0,1M tương đương với 19,54 mg Chlorpheniramin maleate ( C16H19C1N2.C4H40 4)[3]

• Phenylpropanolamin hydroclorid (99,1%):

Cân chính xác khoảng 0,15 g nguyên liệu, hoà tan trong hỗn hợp 50 ml Ethanol 96° và 5 ml Acid hydrocloric Chuẩn độ bằng dung dịch Natrihydroxyd 0,1M Xác định điểm tương tương bằng phương pháp đo thế Thể tích tiêu thụ là thể tích giữa hai bước nhảy

1 ml Natrihydroxyd 0,1M tương đương với 18,77 mg Phenylpropanolamin

hydroclorid ( GjH^NO.HCOP].

• Paracetamol( 99,5%):

Cân chính xác khoảng 0,3 g nguyên liệu, hoà tan trong hỗn hợp gồm 10 ml nước và 30 ml Acid sulfuric IM Đun sôi dưới ống sinh hàn ngược lh, để nguội

và thêm nước vừa đủ 100 ml Hút chính xác 20 ml dung dịch trên thêm 40 g nước

đá, 15 ml Acid hydrocloric 2M và 0,1 ml chỉ thị O- Phenantronin Chuẩn độ bằng dung dịch Amonium cerium sulfat 0,1M đến khi có màu vàng Song song làm một mẫu trắng

1 ml dung dịch Amonium cerium sulfat 0,1M tương đương với 7,56 mg Paracetamol (Q H9N 02)[3]

- Detector quang phổ tử ngoại 655A-22

- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với màng lọc 0,45 |j.m.

- Máy lắc siêu âm Branson sản xuất tại Mỹ

- Cân phàn tích M ettler có độ chính xác ±0,1 mg

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến: -Cintra 40

- Perkin elmer sản xuất tại Mỹ

-Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: Bình định mức, pipet, bình g ạ n

Tất cả các máy móc, dụng cụ đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

2.2.2 Hoá chất

- Dung dịch đệm Acetat pH = 4,6

- Dung dịch Methyl dacam 0,1%

- Dung dịch đệm Phosphat pH= 2,7: Cân 2,58 g Kali dihydro phorphat, thêm 2ml Triethylamin, thêm vừa đủ 1000 ml nước cất Chỉnh pH tới 2,7 bằng dung dịch Acid phosphoric 85%.

Tất cả các hoá chất, dung môi được sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) hoặc sử dụng cho HPLC

2.3 N ội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết cặp ion - đo quang định lượng Chlorpheniramin maỉeate trong thuốc đa thành phần

Chúng tôi tiến hành so sánh, đánh giá một số tiêu chuẩn cơ sở sau đó khảo sát bằng thực nghiệm trên các mẫu Mj, M2, M 3

• Đánh giá phương pháp chiết cặp ion - đo quang trong một số tiêu chuẩn cơsở

- Phương pháp dựa trên nguyên tắc: Chlorpheniramin maleate tạo cặp ion với Methyl da cam ở môi trường pH: 4,4- 4,6 Cặp ion này được chiết vào pha hữu cơ

là Cloroform tạo dung dịch có màu vàng Đo độ hấp thụ của dung dịch màu, so sánh giữa mẫu thử và mẫu chuẩn được tiến hành trong cùng một điều kiện sẽ xác định được hàm lượng Chlorpheniramin maleate

- Các tiêu chuẩn cơ sở đều dựa vào nguyên tắc trên, nhưng kỹ thuật tiến hành

khác nhau dẫn đến tình trạng kết quả kém ổn định Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá về mặt lý thuyết và khảo sát bằng thực nghiệm một số phương pháp định lượng, từ đó tối ưu hoá kỹ thuật định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần

• Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch chiết

Chlorpheniramin maleate được tạo cặp ion với Methyl da cam theo nguyên tắc nói trên Khảo sát phổ hấp thụ tử ngoại của dịch chiết dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

• Khảo sát độ ổn định của dung dịch chiết

Chúng tôi tiến hành khảo sát sự ổn định của độ hấp thụ của dịch chiết theo thờigian và cách ổn định dịch chiết

• Khảo sát số lần chiết và lượng dung môi chiết

• Kỹ thuật tiến hành tối ưu

Từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi tiến hành xây dựng kỹ thuật tối ưu đểđịnh lượng Chlorpheniramin maleate trong các điều kiện như sau:

- Dung dịch thử: Lấy 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên sau đó nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên có chứa khoảng 5 mg Chlorpheniramin maleate, cho vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 80 ml nước cất, lấc kỹ trong, 10 phút, thêm nước vừa đủ lắc đều, lọc

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg Chlorpheniramin maleate, hoà tan trong vừa đủ 100 ml nước cất Lấy chính xác 5 ml pha loãng tiếp vừa đủ

100 ml

- Phương pháp tạo màu được trình bày trong bảng 2

B ảng 2: Định lượng Chlorpheniramin maleate với thuốc thử Metyl da cam.

- Chiết: Chiết lần lượt từng bình với 10 ml, 8ml Cloroform (lắc tròn để tránh nhũ hoá), mỗi lần chiết lắc trong 5 phút, sau đó để yên tách lớp trong 5 phút Gạn lấy lớp Cloroform( dịch c h iế t), lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 ml Thêm Cloroform đến vạch, lắc đều.

- Đo quang: Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng 422±2 nm, dùng mẫu trắng để chỉnh máy về 0

- Cách đánh giá kết quả: Hàm lượng Chlorpheniramin maleate trong một viên được tính theo công thức:

/ v ) = D 1 x M £ x C x P

D c x M , x 2 0

Trong đó: Dt , Dc là độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Mp M c là khối lượng chất thử và chất chuẩn (g)

p là khối lượng trung bình viên (g)

c là hàm lượng chất chuẩn(%)

• Khảo sát khoảng tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ Chlorpheniramin maleate

• Khảo sát độ lặp lại: Khảo sát trên các mãuM ,, M2, M 3

• Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm

2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC đ ể định lượng đồng thời Chlorpheniramỉn maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid, định lượng Paracetamol trong thuốc đa thành phần

• Khảo sát điều kiện sắc ký

Qua tham khảo một số tài liệu và trong điều kiện trang thiết bị của cơ sởnghiên cứu (phòng Hoá lý I - Viện kiểm nghiệm), cũng như điều kiện thực

nghiệm ở nước ta hiện nay, chúng tôi tiến hành khảo sát những điều kiện sau để chọn chương trình sắc ký thích hợp:

- Lựa chọn cột sắc ký: Chúng tôi sử dụng cột sắc ký pha đảo Lichrospher RP18 (250 X 4 mm; lOịim) Đây là cột sắc ký thông dụng được sử dụng khá nhiều trong công tác kiểm nghiệm

- Khảo sát, lựa chọn dung môi pha động và tốc độ dòng cho phép tách đồng thòi 2 hoặc 3 thành phần Chlorpherũramin maleate, Paracetamol, Phenylpropanolamin hydroclorid ra khỏi hỗn hợp phân tích Đồng thời đảm bảo trên sắc ký đồ thu được píc Chlorpheniramin maleate có thời gian lưu (tR) nhỏ nhất: Chúng tôi tiến hành khảo sát các hệ dung môi có trong tài liệu tham khảo, lựa chọn và điều chỉnh tỷ lệ các thành phần sao cho các thành phần được tách tốt nhất

- Khảo sát chọn bước sóng xác định 3 thành phần: Tiến hành đo phổ hấp thụ

tử ngoại của cả 3 chất, dựa trên nguyên tắc chọn bước sóng phát hiện ưu tiên cực đại hấp thụ của chất có hàm lượng nhỏ hoặc có độ hấp thụ riêng nhỏ Đồng thời kết hợp với quá trình thực nghiệm để lựa chọn bước sóng thích hợp

- Xây dựng chương trình sắc ký: Sau khi tham khảo, đánh giá các tài liệu đã

có và tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách Chlorpheniramin maleate, Paracetamol, Phenylpropanolamin HC1 ra khỏi hỗn hợp các thành phần trên như: Cột sắc ký, pha động, bước sóng phát hiện và tốc độ dòng, chúng tôi đã lựa chọn một chương trình sắc ký cho phép tách được 3 thành phần trên:

+ Cột Lichrospher RP18 (250 X 4 mm; lOịim ).

+ Detector ƯV: 216 nm đo Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid , 244 nm đo Paracetamol.

+ Pha động: Đệm phosphat pH 2,7 : Acetonitril ( 97 : 3 ).

+ Tốc độ dòng: 1,2 mi/phút đo Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydrođorid , 2,0 ml/ phút đo Paracetamol.

+ Thể tích tiêm 20 ịil.

+ Nhiệt độ phòng.

• Xây dựng phương pháp định lượng Chlorpheniramin maleate và Phenylpropanolamin hydroclorid, định lượng Paracetamol trong một số thuốc đa thành phần

- Để định lượng 3 thành phần nói trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu,

khảo sát trên các mẫu M 3 , M 4.

- Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ Chlorpheniramin maleate, Paracetamol, Phenylpropanolamin hydroclorid với diện tích píc trên sắc ký đồ

- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

- Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm

Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn nồng độ định lượng của mẫu thử và mẫu chuẩntrong khoảng tuyến tính đã khảo sát Sau đó tiến hành định lượng bằng phươngpháp ngoại chuẩn, có nghĩa là so sánh diện tích píc mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện sắc ký Từ đó tính ra hàm lượng các chất Chlorpheniramin maleate, Paracetamol, Phenylpropanolamin hydroclorid trong chế phẩm cần phân tích theo công thức:

x (g /v )= ^ V ^ S ^ (16)

sc xm t xn c

Trong đó:

- St và Sc là diện tích hoặc chiều cao píc mẫu thử và mẫu chuẩn

- mt, mc là khối lượng mẫu thử và mẫu chuẩn ( g )

- Cc là hàm lượng chất chuẩn(%)

- M là khối lượng trung bình viên ( g )

- nt, nc là hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

2.3.3 So sánh phương pháp chiết cặp ion - đo quang và phương pháp HPLC định lượng Chlorpheniramin maleate

• So sánh độ chính xác của 2 phương pháp

• So sánh hai giá trị trung bình

• Đánh giá ưu, nhược điểm của 2 phương pháp

2.3.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê với các đại lượng đặc trưng sau:

* Giá trị trung bình: X = — y X j (17)

n i=1

* Độ lệch chuẩn: s = W - (18)

* Sai số chuẩn: S(x) = - ^ r (19)

* Sai số tương đối: £ = aJ x)-100 (20)

* So sánh kết quả bằng test t và test F:

s

CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

3.1 Định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần bằng phương pháp chiết cặp ion - đo quang

3.1.1 Đánh giá phương pháp chiết cặp ion - đo quang trong một s ố tiêu chuẩn cơ sở

Sau khi tham khảo một số tiêu chuẩn cơ sở, chúng tôi tóm tắt những kỹ thuật tiến hành định lượng trong bảng 3

Nhìn chung để định lượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần, các tiêu chuẩn cơ sở đều sử dụng phương pháp chiết cặp ion - đo quang Phương pháp này dựa trên nguyên tắc:

- Đối ion là Metyl da cam ( dung dịch 1 %)

- pH của pha nước là 4,4 - 4,6

- Dung môi chiết: Cloroform

- Nồng độ dung dịch thử: 20 Ịig/ml - 160 |_ig/ml

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 410 - 425 nm

Như vậy kỹ thuật tiến hành định lượng trong các tiêu chuẩn cơ sở có nhiều điểm khác nhau Sự khác nhau chủ yếu là về nồng độ và thể tích dung dịch thử, lượng dung môi chiết và số lần chiết, cách ổn định dịch chiết và bước sóng đo độhấp thụ Tất cả những điều đó dẫn tới tình trạng kết quả định lượng kém ổn định.Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu, khảo sát để tối ưu hoá kỹ thuật địnhlượng Chlorpheniramin maleate trong thuốc đa thành phần bằng phương pháp

chiết cặp ion - đo quang.

B ảng 3: Tóm tắt các kỹ thuật định lượng Chlorpheniramin maleate bằng phương pháp chiết cặp ion - đo quang.

ị jug/ml) (a)

T h ể tích dd thử (ml) (b)

T h ể tích Cloroform (ml) (c)

Phương pháp ổn định dịch chiết

410

Ghi chú: Các điều kiện tiến hành được kỷ hiệu: Dòng 1, cột a ký hiệu la ; dòng 2

cộí b kỷ hiệu 2b .