THỬ NGHIỆM VACCINE ĐƠN GIÁ Aeromonas hydrophila VÀ VACCINE ĐA GIÁ Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Khi dịch bệnh xảy ra, để điều trị đa số người nuôi đều sử dụng các loại thuốc kháng sinh ở dạng nguyên liệu và sử dụng theo kinh nghiệm hoặc theo hướng dẫn của người bán, do đó đã dẫn đế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

***********************

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

THỬ NGHIỆM VACCINE ĐƠN GIÁ Aeromonas hydrophila

VÀ VACCINE ĐA GIÁ Aeromonas hydrophila /Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh , Tháng 02 năm 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

**********************

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

THỬ NGHIỆM VACCINE ĐƠN GIÁ Aeromonas hydrophila

VÀ VACCINE ĐA GIÁ Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

THỬ NGHIỆM VACCINE ĐƠN GIÁ Aeromonas hydrophila VÀ VACCINE

ĐA GIÁ Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA

3 Phản biện 1: TS Nguyễn Tất Toàn

Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: TS Lê Hồng Phước

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

5 Ủy viên: TS Phạm Hùng Vân

Đại học Y Dược TP HCM

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Đỗ Viết Phương sinh ngày 22 tháng 12 năm 1985 tại thị xã Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp Tốt nghiệp PTTH tại Trường Trung học phổ thông Hồng Ngự 1, tỉnh Đồng Tháp năm 2003 Tốt nghiệp đại học ngành Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 10 năm 2010 theo học cao học ngành Thủy Sản tại trường đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: 44 Nguyễn Thị Minh Khai, thị xã Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp

Điện thoại: 0919667823

Email: dovietphuongdt@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

CẢM TẠ

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình đã luôn luôn ở bên, động viên và

hỗ trợ về cả vật chất và tinh thần đề tôi có thể hoàn thành tốt mọi công việc

Sau 2 năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành chương trình cao học với luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, chuyên ngành Nuôi Trồng Thủy Sản

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

+ Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Phòng sau Đại học Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Quý thầy cô của Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh đã tận tình tham gia hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, quy báu cho tôi trong quá trình học cũng như quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn và cho em những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng gửi lời cảm ơn đến các em: Huy, Huệ, Mai, Nam, Trọng lớp NY32 và

em Ngân lớp SH32 đã giúp đỡ cho tôi trong thời gian qua Cảm ơn các các anh chị

và các bạn lớp CH09TS đã tận tình hỗ trợ trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2012

TÓM TẮT

Đề tài “Thử nghiệm vaccine đơn giá Aeromonas hydrophila và vaccine đa giá Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus)” được tiến hành tại trại Thực Nghiệm và phòng thí nghiệm Bệnh

Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2010 Cá khỏe mạnh có trọng lượng 4 – 5 g/con được sử dụng trong thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi loại vaccine đơn và đa giá đều có dạng ngâm và dạng cho ăn Vaccine ngâm được cấp vào ngày thứ 1 của thí nghiệm (bằng cách ngâm cá trong vaccine ngâm pha loãng 10 lần trong nước sạch trong 1 phút) Vaccine cho ăn được cấp nhắc lại lần thứ nhất liên tục trong 11 ngày từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 18 và cấp nhắc lại lần thứ hai liên tục trong 7 ngày từ ngày 101 đến ngày 107 Vaccine cho ăn được phủ bên ngoài thức ăn viên với tỷ lệ 2% (thể tích/trọng lượng) (2 ml vaccine với 100 g thức ăn) Cá đối chứng không được cấp vaccine Sau đó cá được

công cường độc với A hydrophila và E ictaluri vào ngày 46 và ngày 130

Kết quả cho thấy rằng:

+ Cá được cấp vaccine đơn giá A hydrophila ngâm và cho ăn nhắc lại lần thứ nhất có tỷ lệ bảo hộ đối với A hydrophila vào ngày 46 là 54,21% (nghiệm thức

A1), sang ngày 130 chỉ còn 40,91% (nghiệm thức A2) Cá được cấp vaccine cho ăn nhắc lại lần thứ hai có tỷ lệ bảo hộ là 53,41% (nghiệm thức A3)

+ Cá được cấp vaccine đa giá A hydrophila/E ictaluri ngâm và cho ăn nhắc lại lần thứ nhất có tỷ lệ bảo hộ vào ngày thứ 46 với A hydrophila là 51,4% (nghiệm thức B1), với E ictaluri là 52,34% (nghiệm thức B2) Cá được cấp vaccine cho ăn nhắc lại lần thứ hai có tỷ lệ bảo hộ vào ngày 130 với A hydrophila là 51,14% (nghiệm thức B3), với E ictaluri là 52,69% (nghiệm thức B4)

The thesis “Protective efficacy of monovalent Aeromonas hydrophila and bivalent Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri vaccine on tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)” was carried out at the Experimental Farm and

Pathology Laboratory of Fisheries Faculty, Nong Lam University from April to October in 2010 Healthy fish weighed at 4 – 5 g/fish were used in the study The study were randomly designed with three replicates Both of monovalent and bivalent vaccine have immersion and oral preparation Vaccinated fish were immersed in 10 times diluted immersion vaccines in clean water for 1 minute on day 1 Oral vaccine was used as first booster for 11 consecutive days (day 8 – 18) and second oral booster for 8 consecutive days (day 101 – 107) The oral vaccine were coated outside onto pellet feed at rate of 2% (volume/weight) (2 ml vaccine with 100 g feed) Control fish were not received any vaccine administrations

Vaccinated and control fish were challenged with A hydrophila and E ictaluri at

day 46 and 130

Results showed that:

+ Fish vaccinated with monovalent Aeromonas hydrophila vaccine by immersion and the first oral booster were protected against A hydrophila with

54,21% relative percent survival (RPS) on day 46 (A1) However, the RPS decreased to 40,91% on day 130 (A2) Fish received the second oral booster were protected with 53,41% RPS on day 130 (A3)

+ Fish vaccinated with bivalent Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri

vaccine by immersion and the first oral booster were protected with 51,4% RPS

(B1) (challenged with bacteria A hydrophila) and 52,34% RPS (B2) (challenged with bacteria E ictaluri) on day 46 Fish received the second oral booster were protected with 53,14% RPS (B3) (challenged with bacteria A hydrophila) and 52,69% RPS (B4) (challenged with bacteria E ictaluri) on day 130

CẢM TẠ

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình đã luôn luôn ở bên, động viên và

hỗ trợ về cả vật chất và tinh thần đề tôi có thể hoàn thành tốt mọi công việc

Sau 2 năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành chương trình cao học với luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, chuyên ngành Nuôi Trồng Thủy Sản

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

+ Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Phòng sau Đại học Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh

+ Quý thầy cô của Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh đã tận tình tham gia hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, quy báu cho tôi trong quá trình học cũng như quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn và cho em những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng gửi lời cảm ơn đến các em: Huy, Huệ, Mai, Nam, Trọng lớp NY32 và

em Ngân lớp SH32 đã giúp đỡ cho tôi trong thời gian qua Cảm ơn các các anh chị

và các bạn lớp CH09TS đã tận tình hỗ trợ trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2012

TÓM TẮT

Đề tài “Thử nghiệm vaccine đơn giá Aeromonas hydrophila và vaccine đa giá Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus)” được tiến hành tại trại Thực Nghiệm và phòng thí nghiệm Bệnh

Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2010 Cá khỏe mạnh có trọng lượng 4 – 5 g/con được sử dụng trong thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi loại vaccine đơn và đa giá đều có dạng ngâm và dạng cho ăn Vaccine ngâm được cấp vào ngày thứ 1 của thí nghiệm (bằng cách ngâm cá trong vaccine ngâm pha loãng 10 lần trong nước sạch trong 1 phút) Vaccine cho ăn được cấp nhắc lại lần thứ nhất liên tục trong 11 ngày từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 18 và cấp nhắc lại lần thứ hai liên tục trong 7 ngày từ ngày 101 đến ngày 107 Vaccine cho ăn được phủ bên ngoài thức ăn viên với tỷ lệ 2% (thể tích/trọng lượng) (2 ml vaccine với 100 g thức ăn) Cá đối chứng không được cấp vaccine Sau đó cá được

công cường độc với A hydrophila và E ictaluri vào ngày 46 và ngày 130

Kết quả cho thấy rằng:

+ Cá được cấp vaccine đơn giá A hydrophila ngâm và cho ăn nhắc lại lần thứ nhất có tỷ lệ bảo hộ đối với A hydrophila vào ngày 46 là 54,21% (nghiệm thức

A1), sang ngày 130 chỉ còn 40,91% (nghiệm thức A2) Cá được cấp vaccine cho ăn nhắc lại lần thứ hai có tỷ lệ bảo hộ là 53,41% (nghiệm thức A3)

+ Cá được cấp vaccine đa giá A hydrophila/E ictaluri ngâm và cho ăn nhắc lại lần thứ nhất có tỷ lệ bảo hộ vào ngày thứ 46 với A hydrophila là 51,4% (nghiệm thức B1), với E ictaluri là 52,34% (nghiệm thức B2) Cá được cấp vaccine cho ăn nhắc lại lần thứ hai có tỷ lệ bảo hộ vào ngày 130 với A hydrophila là 51,14% (nghiệm thức B3), với E ictaluri là 52,69% (nghiệm thức B4)

The thesis “Protective efficacy of monovalent Aeromonas hydrophila and bivalent Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri vaccine on tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)” was carried out at the Experimental Farm and

Pathology Laboratory of Fisheries Faculty, Nong Lam University from April to October in 2010 Healthy fish weighed at 4 – 5 g/fish were used in the study The study were randomly designed with three replicates Both of monovalent and bivalent vaccine have immersion and oral preparation Vaccinated fish were immersed in 10 times diluted immersion vaccines in clean water for 1 minute on day 1 Oral vaccine was used as first booster for 11 consecutive days (day 8 – 18) and second oral booster for 8 consecutive days (day 101 – 107) The oral vaccine were coated outside onto pellet feed at rate of 2% (volume/weight) (2 ml vaccine with 100 g feed) Control fish were not received any vaccine administrations

Vaccinated and control fish were challenged with A hydrophila and E ictaluri at

day 46 and 130

Results showed that:

+ Fish vaccinated with monovalent Aeromonas hydrophila vaccine by immersion and the first oral booster were protected against A hydrophila with

54,21% relative percent survival (RPS) on day 46 (A1) However, the RPS decreased to 40,91% on day 130 (A2) Fish received the second oral booster were protected with 53,41% RPS on day 130 (A3)

+ Fish vaccinated with bivalent Aeromonas hydrophila/Edwardsiella ictaluri

vaccine by immersion and the first oral booster were protected with 51,4% RPS

(B1) (challenged with bacteria A hydrophila) and 52,34% RPS (B2) (challenged with bacteria E ictaluri) on day 46 Fish received the second oral booster were protected with 53,14% RPS (B3) (challenged with bacteria A hydrophila) and 52,69% RPS (B4) (challenged with bacteria E ictaluri) on day 130

1.1 Sơ lược về miễn dịch học cá xương 4

1.1.1 Miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) 4

1.1.1.1 Các hàng rào bề mặt 4

1.1.1.2 Các yếu tố thể dịch không đặc hiệu 5

1.1.1.3 Các yếu tố miễn dịch tế bào không đặc hiệu 6

1.1.2 Miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được) 6

1.1.2.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 7

1.1.2.3 Kí ức miễn dịch 8

1.2.1 Định nghĩa về vaccine 10

1.2.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản 10

1.2.4 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản 15

1.2.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản 17

1.2.6 Tình hình sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới 18

1.2.7 Tình hình sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam 18

1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản 19

1.2.9 Đánh giá hiệu quả của sử dụng vaccine 20

1.3 Vaccine phòng bệnh do E ictaluri gây ra 20

1.3.2 Những nghiên cứu về vaccine phòng bệnh do E ictaluri 21

1.4.2 Những nghiên cứu về vaccine phòng bệnh do A hydrophyla 26

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 30

2.4.2.2 Tỷ lệ sống của cá sau thí nghiệm (X%) - SR (Survival rate) 35

2.4.2.3 Tỷ lệ chết của cá sau 21 ngày công cường độc 36

2.4.2.5 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch RPS (Relative Percent Survival) 36

2.4.3 Phương pháp lấy máu cá thu huyết thanh 36

2.4.4 Phương pháp tạo FKC (Formaline Killed Cell) 37

2.4.5 Phương pháp thực hiện phản ứng vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng

2.4.6 Phương pháp định danh bằng bộ định danh API-20E 38

3.1.2 Các kết quả kiểm tra trước khi công cường độc 40

3.1.3 Kết quả công cường độc vào ngày thứ 46 45

3.1.3.1 Đối với cá công cường độc với E ictaluri 45 3.1.3.2 Đối với cá công cường độc với A hydrophila 52

3.1.4 Kết quả công cường độc vào ngày thứ 130 58

3.1.4.1 Đối với cá công cường độc với E ictaluri 58 3.1.4.2 Đối với cá công cường độc với A hydrophila 62

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADH: Argininedehydrolase

BHIA: Brain Heart Infusion Agar

BHIB: Brain Heart Infusion Broth

CIT: Citrate

Ctv Cộng tác viên

ESC: Enteric septicaemia of catfish

FAO: Food and Agriculture Organization

GEL: Gelatinase

Ig: Immunoglobulin IND: Indole

ONPG: o-nitrophenyl--galactosidase

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm 30

Hình 2.3 Sử dụng bình xịt phun sương để trộn vaccine vào thức ăn 32

Hình 2.5 Thao tác rạch vây ngực tạo vết thương cho cá 33

Hình 2.6 Thao tác rạch vây đuôi tạo vết thương cho cá 33

Hình 3.1 Biểu hiện bên ngoài cá chết khi công cường độc với E ictaluri vào ngày

thứ 46, xuất huyết các gốc vây, xuất huyết điểm quanh gốc miệng 48

Hình 3.2 Biểu hiện bên trong cá chết khi công cường độc với E ictaluri vào ngày

thứ 46, có các đốm hoại tử trên gan, thận và lách 48

Hình 3.3 Mô gan cá tra khỏe (H&E, x100), các tế bào gan xếp sát nhau (a), cấu

trúc các đảo tụy nguyên vẹn (b) 49

Hình 3.4 Mô gan cá tra nhiễm E ictaluri (H&E, x100), các tế bào gan bị thoái hóa

(c), đảo tụy bị hư hại (d), có hiện tượng xuất huyết (e) 49

Hình 3.5 Mô thận cá tra khỏe (H&E, x1000), cấu trúc các ống thận nguyên vẹn 49

Hình 3.6 Mô thận cá tra nhiễm E ictaluri (H&E, x400), cấu trúc các ống thận bị

Hình 3.7 Mô lách cá tra khỏe (H&E, x100) Cấu trúc các phần tủy trắng (f), tủy đỏ

Hình 3.8 Mô lách cá tra nhiễm E ictaluri (H&E, x100) Có những vùng hoại tử

(h), những vùng xuất huyết (k), và sự xuất hiện của các đại thực bào sắc

Hình 3.9 Kết quả cấy phân lập E ictaluri từ cá bệnh, luôn có sự xuất hiện của A

hydrophila tại nơi xuất phát đường cấy ( ) 51

tượng lồi mắt và xuất huyết dưới phần sọ đầu, xuất huyết nặng ở các

Hình 3.11 Cá chết vào ngày thứ 2 khi công cường độc với A hydrophila có biểu

hiện xuất huyết ở thận, lách sưng và sẫm màu, gan, dạ dày có hiện

tượng xung huyết 55

Hình 3.12 Mẫu mô gan cá bị nhiễm A hydrophila các tế bào gan bị thoái hóa, các

đảo tụy bị hư hại và có hiện tượng xung huyết 56

Hình 3.13 Mẫu mô thận cá bị nhiễm A hydrophila cấu trúc các ống thận bị hư hại

có kèm hiện tượng xung huyết 56

Hình 3.14 Mẫu mô lách cá bị nhiễm A hydrophila xuất hiện nhiều vùng hoại tử

không còn nhận ra cấu trúc, có hiện tượng xung huyết 56

Hình 3.15 Kết quả cấy phân lập A hydrophila từ cá bệnh chết, thuần và đồng

Hình 3.16 Vi khuẩn A hydrophila phát triển trên môi trường Rimler Shotts cho

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.1 Sản lượng cá hồi và cá hồi vân cùng với lượng kháng sinh sử dụng

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ sống trung bình của các nghiệm thức 41

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi công

cường độc với E ictaluri vào ngày 46 46

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức khi công cường

độc với E ictaluri vào ngày 46 46

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm khi công cường độc

với A hydrophila vào ngày 46 52

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi

công cường độc với A hydrophila vào ngày 46 53

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ bảo hộ trung bình của các nghiệm thức cấp vaccine khi công

cường độc với A hydrophila vào ngày thứ 46 58

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi công

cường độc với E ictaluri vào ngày 130 59

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức khi công cường

độc với E ictaluri vào ngày 130 59

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi công

cường độc với A hydrophila vào ngày 130 62

Biểu đồ 3.10 Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức khi công cường

độc với A hydrophila vào ngày 130 63

Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ bảo hộ trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với

A hydrophila vào ngày 130 65

Biểu đồ 3.12 Tỷ lệ bảo hộ trung bình của các nghiệm thức cấp vaccine đơn giá A

hydrophila 71

A hydrophila vào ngày 46 và 130 73

Bảng 3.5 Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với E

ictaluri vào ngày thứ 46 47

Bảng 3.6 Tỷ lệ trung bình phát hiện vi khuẩn E ictaluri đối với cá còn sống sau 21

ngày công cường độc E ictaluri vào ngày 46 51

Bảng 3.7 Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với A

hydrophila vào ngày thứ 46 54

Bảng 3.8 Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với E

ictaluri vào ngày 130 60

Bảng 3.9 Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với A

hydrophila vào ngày thứ 130 63

MỞ ĐẦU

Cá tra là đối tượng chính đượ c nuôi ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long Theo số liệu thống kê trong năm 2007 cho thấy nghề sản xuất cá tra đã đạt tổng sản lượng trên 1 triệu tấn, giá trị xuất khẩu đạt gần 1 tỉ đô la Mỹ (Nguyễn Vũ Dũng, 2008) Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, người nuôi đã không ngừng

mở rộng diện tích nuôi, gia tăng mật độ nuôi lên gấp nhiều lần, trung bình 80 - 120 con/m3 (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006) Từ đó đã dẫn đến sự phát sinh của nhiều loại

bệnh, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn gây ra Bệnh gan thận mủ do Edwardsiella

ictaluri và bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas hydrophila là 2 loại bệnh thường

xuyên xảy ra và gây thiệt hại kinh tế nặng nề nhất cho người nuôi cá Theo Crumlish và Dung (2002), thống kê cho thấy vào năm 2002 đã có khoảng 17% trại nuôi cá tra không thể tiếp tục hoạt động do tác động của bệnh gan thận mủ gây ra Khi dịch bệnh xảy ra, để điều trị đa số người nuôi đều sử dụng các loại thuốc kháng sinh ở dạng nguyên liệu và sử dụng theo kinh nghiệm hoặc theo hướng dẫn của người bán, do đó đã dẫn đến sự đề kháng kháng sinh và tình trạng đa kháng kháng sinh ngày càng gia tăng (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006) Theo Crumlish và ctv

(2008), khi nghiên cứu tình trạng đa kháng của 14 chủng A hydrophila phân lập

được từ cá tra bệnh nhiễm trùng huyết cho thấy có trên 60% số chủng kiểm tra đa kháng với 5 loại kháng sinh trở lên Một nghiên cứu khác của Từ Thanh Dung và

ctv (2009), về tính đa kháng của 50 chủng E ictaluri thu được từ cá tra bệnh gan

thận mủ cho thấy có trên 65% số chủng đa kháng từ 6 – 9 lọai thuốc kháng sinh Điều này cho thấy, việc hóa trị để điều trị hai bệnh này ngày càng khó khăn Hơn nữa, sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh tạo ra một hệ lụy nghiêm trọng là sự tồn

dư của kháng sinh trong cơ thịt cá ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và có thể làm tác động đến môi trường, hệ sinh thái của khu vực (Sarter và ctv, 2007) Quan trọng hơn là các gene kháng thuốc từ vi khuẩn có liên quan đến vật nuôi sẽ

được chuyển sang vi khuẩn có liên quan đến người qua chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp và tác động đến khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn ở người (Nawaz và ctv, 2001)

Để giải quyết vấn đề trên, nhiệm vụ đặt ra là phải tìm một giải pháp thích hợp vừa thân thiện với môi trường vừa ngăn ngừa được sự bùng phát của dịch bệnh Trước yêu cầu đặt ra, liệu pháp phòng bệnh cho cá bằng vaccine là phương pháp được coi là hữu hiệu nhất Trên thế giới đã có 36 loại vaccine phòng bệnh cho vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh cho virus được sử dụng rộng rãi trên 12 đối tượng thủy sản nuôi khác nhau thuộc 41 quốc gia trên thế giới (Hastein, 2005) Tại Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có một loại vaccine nào phòng bệnh cho cá được đưa vào sử dụng

Đã có một số công trình nghiên cứu về vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho

cá tra tại Việt Nam và bước đầu đã đạt được một số thành công nhất định Năm

2006, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với Công ty Thuốc Thú

y Trung Ương II (NAVETCO) nghiên cứu vaccine tiêm phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra (Nguyễn Thị Hiền, 2009) Bên cạnh hướng nghiên cứu vaccine tiêm còn

có những nghiên cứu về vaccine ngâm và cho ăn để phòng bệnh do E ictaluri gây

ra trên cá tra (Thinh và ctv, 2009) Như vậy, mặc dù chưa có vaccine được đưa vào

sử dụng rộng rãi nhưng bước đầu đã có những nghiên cứu trong việc sử dụng vaccine để phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra Tuy nhiên đối với bệnh xuất huyết

do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá tra thì vẫn chưa có một công trình

nghiên cứu nào được tiến hành Mặt khác, việc cấp vaccine cho các đối tượng thủy sản nuôi gặp nhiều khó khăn do dễ gây stress cho cá nuôi Do đó cấp vaccine đa giá

để phòng ngừa cùng một lúc nhiều loại mầm bệnh được xem là phương pháp chủng ngừa tối ưu nhằm hạn chế stress cho cá nuôi do phải chủng ngừa nhiều lần với nhiều mầm bệnh khác nhau Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Thử

nghiệm vaccine đơn giá Aeromonas hydrophila và vaccine đa giá Aeromonas

hydrophila/Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”

● Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát tỷ lệ bảo hộ của việc cấp kết hợp hình thức

ngâm và cho ăn của vaccine đơn và đa giá trong việc phòng bệnh do Aeromonas

hydrophila/Edwardsiella ictaluri trên cá tra trong điều kiện phòng thí nghiệm

● Mục đích nghiên cứu: Phát triển vaccine phòng bệnh do A hydrophila và

E ictaluri trên cá tra nuôi

Chương 1 TỔNG QUAN

Cũng như các loài động vật có xương sống khác, hệ thống miễn dịch ở cá cũng được chia làm 2 nhóm: miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) và miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được) Cả hai cơ chế này hoạt động hài hòa với nhau, phụ thuộc lẫn nhau theo nhiều phương thức Chẳng hạn, các đại thực bào có thể bắt và nuốt các tế bào vi khuẩn, nhưng khả năng này có thể được gia tăng lên gấp nhiều lần nếu các tế bào vi khuẩn bị bao phủ bởi kháng thể Mặt khác các kháng nguyên phải được xử lí bởi các đại thực bào thì hệ thống lympho mới có thể đáp ứng theo phương thức đặc hiệu Tuy nhiên nhìn chung hệ thống miễn dịch của cá ít

đa dạng và ít hiệu quả hơn so với động vật có vú (Warr, 1997)

1.1.1 Miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên)

1.1.1.1 Các hàng rào bề mặt

Dịch nhờn: Toàn bộ vỏ bọc cơ thể cá (da, mang và thành ruột) đều được bao phủ bởi một lớp dịch nhờn giúp ngăn ngừa sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh bằng cách bao bọc các tác nhân này lại và liên tục rửa trôi chúng đi Mặt khác dịch nhờn ở cá cũng có tính độc đối với một số vi sinh vật Dịch nhờn không những giúp

cá giảm được ma sát trong quá trình vận chuyển mà còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể cá chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật hay các vật lạ

từ môi trường vào cơ thể cá (Lamas và Ellis, 1994)

Da: Da cá tương đối khác với các động vật trên cạn là không hoá sừng, nhưng khả năng phục hồi của da rất nhanh do sự hình thành lớp tế bào malpighi huy động từ vùng lân cận (Bullock và ctv, 1978) Phản ứng phì đại các tế bào malpighi

và lớp biểu bì cũng rất nhanh, giúp cho da trở thành một hàng rào vật lý tương đối vững chắc để bảo vệ cơ thể Ngoài ra, ở các loài cá có vẩy thì chính hệ thống này sẽ

bảo vệ da và cơ thể cá được vững chắc hơn

Mang: Là cơ quan đặc biệt và khác hẳn với các động vật trên cạn Mang là nơi thực hiện quá trình hô hấp cơ bản của cá, cũng là nơi tiếp xúc thường xuyên với các sinh vật của môi trường bên ngoài Cho nên, mang là con đường xâm nhiễm quan trọng của mầm bệnh Tuy nhiên, ở mang thì có sự tập trung của đại thực bào rất cao Đồng thời mang cũng được bao phủ bởi dịch nhờn và sự xuất hiện của các

tế bào malpighi giúp cho mang có khả năng thực hiệc được chức năng chống lại các sinh vật từ bên ngoài môi trường

Ống tiêu hóa: Trong ống tiêu hóa của ruột cũng được bao phủ bởi một lớp dịch nhày tương tự ở da Tuy nhiên chức năng tiêu hóa của ruột cũng tạo nên một môi trường bất lợi cho các tác nhân gây bệnh bởi pH thấp (có ở các loại cá có dạ dày) và việc tiết ra men tiêu hóa và mật

1.1.1.2 Các yếu tố thể dịch không đặc hiệu

● Các nhân tố ức chế sinh trưởng

+ Transferrin: Có trong huyết thanh của mọi động vật có xương sống kể cả

cá, có khả năng kết hợp rất chặt chẽ với ion sắt, là nhân tố sinh trưởng thiết yếu đối với mọi sinh vật do đó tạo nên hiệu quả ức chế vi khuẩn và nấm Transferrin rất đa dạng về mặt di truyền, phản ánh tính chất thích nghi miễn dịch đối với sự cạnh tranh của vi sinh vật (Eliss, 1999)

+ Interferon: Xuất hiện nhiều trong cơ thể cá sau khi cá bị cảm nhiễm với virus Tuy nhiên, những hiểu biết về bản chất của interferon của cá vẫn còn hạn chế, ngoài khối lượng phân tử khoảng 26000 và điểm đẳng điện 5,3 (Dorson và ctv, 1992)

● Các nhân tố ức chế enzyme: Có vai trò quan trọng trong việc trung hòa các enzyme do các tác nhân gây bệnh sinh ra nhằm ngăn ngừa không cho chúng xâm nhập cũng như sử dụng chất dinh dưỡng từ cơ thể vật chủ

● Các chất dung giải: Chúng có thể dung giải tế bào tác nhân gây bệnh hoặc tương tác với nhau để dung giải tế bào tác nhân gây bệnh

● Các chất kết tủa (precipitin) và ngưng kết (agglutinin): Làm kết tủa hoặc ngưng kết tế bào vi khuẩn

1.1.1.3 Các yếu tố miễn dịch tế bào không đặc hiệu

Hàng rào tế bào như đại thực bào, bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan và ái kiềm cũng đóng một vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

ở cá Tuy nhiên, hiểu biết về chức năng và cơ chế hoạt hoá các tế bào này ở cá còn hạn chế so với ở người và động vật bậc cao Ở cá xương, đại thực bào phân bố rộng rãi ở các mô, bao gồm cả mang (Lin và ctv, 1998), và xoang cơ thể (Afonso và ctv, 1998), nhưng chủ yếu được tìm thấy dưới dạng các tế bào thuộc mạng lưới nội bì của thận, lách (Press và Evense, 1999) Ở cá có các tế bào độc tự nhiên (natural cytotoxic cell) tương tự như các tế bào diệt tự nhiên (natural killer) ở động vật có

vú Chúng có thể diệt một số dạng dị bào kể cả các tế bào nuôi cấy nhân tạo, đặc biệt khi các dị bào này bị nhiễm virus hoặc bị các động vật đơn bào kí sinh Tuy nhiên vai trò của các tế bào độc tự nhiên ở cá trong đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể chúng vẫn chưa được chứng minh Nhiều tác giả cho rằng chúng có vai trò quan trọng việc bảo vệ cơ thể đề kháng virus, kí sinh trùng,…(Evan và Jaso, 1992; Hogan và ctv, 1996)

1.1.2 Miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được)

Loại miễn dịch này được hình thành và đáp ứng với cấu trúc phân tử của nhân tố kích thích tạo nên nó và có liên quan đến sự biến đổi thích ứng của hệ thống lympho bào dẫn đến sự hình thành kí ức miễn dịch Các phân tử có khả năng tạo nên đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tức là sự sản sinh kháng thể (antibody) được gọi là các kháng nguyên (antigen) Một khía cạnh quan trọng của miễn dịch đặc hiệu là tính nhớ, hình thành bởi những biến đổi thích ứng của các quần thể tế bào lympho, nhờ đó mà khi tiếp xúc lại với cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên đáp ứng miễn dịch thứ cấp đặc trưng bởi thời gian phản ứng nhanh với cường độ mãnh liệt hơn Người ta vận dụng tính chất này trong việc điều chế vaccine phòng bệnh cho người và vật nuôi Miễn dịch đặc hiệu gồm 3 khía cạnh: Miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào và kí ức miễn dịch

Chức năng Ig ở cá:

+ Trung hòa: Vai trò quan trọng của kháng thể của cá trong việc trung hòa tính gây nhiễm của virus đã được chứng minh rõ ràng, kháng thể cá còn có vai trò trong việc vô hiệu hóa các nhân tố gây bệnh của vi khuẩn như: các độc tố, nhân tố kết dính, (Ellis, 1988)

+ Hoạt hóa bổ thể: Đã xác lập được tác dụng hoạt hóa bổ thể theo con đường

cổ điển, đòi hỏi sự có mặt của ion Ca2+ tương tự như ở động vật có vú

+ Opsonin hóa tiểu thể: Chức năng này vẫn đang còn nhiều tranh cãi Ở cá các kháng thể đặc hiệubao quanh có thể làm gia tăng khả năng thực bào, nhưng để đạt đến hoạt tính thực bào cao luôn đòi hỏi sự có mặt của bổ thể Vì thế IgM ở một

số loài cá có thể có vai trò opsonin hóa một cách trực tiếp, có thể thông qua thụ thể đối với IgM (Secombes, 1996)

+ Phản ứng quá mẫn: Phản ứng quá mẫn ở cá được biết đến từ lâu, nhưng cơ

chế của quá trình này vẫn chưa được sáng tỏ Ở động vật có vú, IgE có vai trò xúc tác việc giải phóng histamin từ các dưỡng bào (mast cell) được mẫn cảm, đây là hoạt động quan trọng trong phản ứng viêm và dị ứng Tuy nhiên, cá không có kháng thể tương tự như IgE và các tế bào hạt ưa eosin và dưỡng bào không chứa histamin

1.1.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Các đặc điểm miễn dịch qua trung gian tế bào ở động vật có vú đều có ở cá, tuy nhiên hệ thống này chưa được nghiên cứu kỹ ở cá Khi có kháng nguyên đi vào

cơ thể sẽ kích thích dòng tế bào lympho T biệt hóa thành các loại tế bào như: Tế bào độc đặc hiệu (T killer cell) tác động trực tiếp lên mầm bệnh, hoặc có thể tác động gián tiếp thông qua việc giải phóng các lymphokin Các lymphokin này có tác dụng ứng động hoặc hoạt hóa các tế bào khác, đặc biệt là đại thực bào tham gia thực hiện đáp ứng miễn dịch (Secombes và ctv, 1996)

1.1.2.3 Kí ức miễn dịch

Thể hiện thông qua qua hiện tượng đáp ứng miễn dịch thứ phát mà điển hình

là thời gian hình thành kháng thể sớm hơn, và cường độ phản ứng mãnh liệt hơn so với đáp ứng miễn dịch nguyên phát Kí ức miễn dịch mang tính đặc hiệu đối với kháng nguyên Tuy nhiên hàm lượng kháng thể cực đại hình thành trong đáp ứng miễn dịch thứ phát so với hàm lượng này trong đáp ứng miễn dịch nguyên phát ở cá nhìn chung vẫn còn thấp hơn nhiều so với động vật có vú và phụ thuộc vào nhiệt độ (Kaattari, 1994)

1.1.3 Đáp ứng miễn dịch cục bộ

Các đáp ứng miễn dịch trên bề mặt da và niêm mạc ở cá vẫn còn ít được chú

ý nghiên cứu dù tầm quan trọng của các đáp ứng này rất rõ rệt

● Đáp ứng miễn dịch dịch nhầy: Khi gây miễn dịch bằng cách ngâm hoặc cho ăn có thể kích thích việc hình thành kháng thể trong lớp dịch nhầy mà không

làm gia tăng kháng thể trong huyết thanh (Joosten và ctv, 1997; Palm và ctv, 1998) Nhiều bằng chứng cho thấy kháng thể ở dịch nhầy khác với kháng thể ở huyết

thanh Ví dụ ở cá chép, đại bộ phận kháng thể dịch nhầy ở da là tetramer IgM ở dịch nhầy và huyết thanh có các chuỗi nặng và nhẹ giống nhau và đều phản ứng với

các kháng thể kháng IgM huyết thanh Tuy nhiên, một số kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – MAb) kháng IgM dịch nhầy lại không phản ứng với IgM huyết thanh (Rombout và ctv, 1993) Việc sử dụng kháng thể đơn dòng kháng IgM

dịch nhầy giúp phát hiện được tế bào sản xuất kháng thể trong mang và ruột ở cá

chép được gây miễn dịch bằng cách cho ăn viên nang chứa vi khuẩn Vibrio

anguillarum đã bị bất hoạt, nhưng lại không phát hiện được các tế bào này ở cá

chép được gây miễn dịch bằng cách tiêm vào cơ Mặc khác, cách tiêm cơ lại gây

nên đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ ở thận khi kiểm tra số lượng tế bào sản xuất kháng thể bằng Mab kháng IgM huyết thanh và MAb này cũng không phát hiện được tế bào sản xuất kháng thể ở ruột và mang (Joosten và ctv, 1997) Như vậy ở cá chép,

có một dạng IgM chuyên biệt được sản xuất bởi một tiểu quần thể các tương bào

trong các mô tiết dịch nhầy

● Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da: Globulin miễn dịch với nồng độ thấp đã

được phát hiện trong dịch nhớt ở da cá Có bằng chứng cho thấy chúng không có nguồn gốc từ huyết thanh và được giả định rằng đây là các sản phẩm được sản xuất tại chỗ (Joosten và ctv, 1997) Đồng thời cũng có sự hiện diện của tế bào lympho, tương bào và đại thực bào ở lớp biểu bì da cá Sự có mặt của các tế bào này ở da cá cho thấy việc hình thành phản ứng miễn dịch cục bộ có thể xảy ra ở đây (Davidson

và ctv, 1993) Moore và ctv (1998) đã chứng minh được sự tiếp thu kháng nguyên bởi các tế bào biểu bì và các đại thực bào và cũng là bằng chứng về việc xử lí, trình diện kháng nguyên và hoạt hóa tế bào lympho tại chỗ

● Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang: Mang được xem là cơ quan đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp thụ kháng nguyên, đặc biệt là các kháng nguyên

không hoà tan (Castillo và ctv, 1998) Ở mang có rất nhiều tế bào lympho, đại thực

bào và tương bào cư trú (Davidson và ctv, 1997) Mang có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ đóng vai trò đề kháng quan trọng đối với các bệnh ở mang do vi khuẩn

(Lumsden và ctv, 1995)

● Ruột: Tuy cá không có globulin miễn dịch tương tự như IgA, là lớp Ig có khả năng chịu được tác dụng phân giải protein của các loại men tiêu hóa ở động vật

có vú Tuy nhiên niêm dịch ruột của cá là nơi cư trú của rất nhiều tế bào bạch cầu, bao gồm các đại thực bào, lympho bào, tương bào (Davidson và ctv, 1991; 1993) và các tế bào độc tự nhiên (McMillan và Secombes, 1997) Ở động vật có vú lớp tế bào tiết niêm dịch nằm trên mảng Peyer có các tế bào màng chuyên hóa gọi là tế bào M Các tế bào này có khả năng thực bào và tiếp thu kháng nguyên rồi chuyển cho các

tế bào lympho trong mảng Peyer để kích hoạt đáp ứng miễn dịch Cá không có tế bào M và các mảng Peyer Tuy nhiên bản thân các tế bào tiết niêm dịch của chúng, đặc biệt ở phần sau của ruột lại có khả năng thực bào kháng nguyên và chuyển kháng nguyên này cho các đại thực bào và lympho bào có mặt trong niêm dịch (Joosten và ctv, 1997)

1.2 Tổng quan về việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Định nghĩa về vaccine

“Vaccine là những chế phẩm kháng nguyên có nguồn gốc từ mầm bệnh, đã được chuyển thành vô hại bằng nhiều cách khác nhau, có tác dụng kích hoạt hệ miễn dịch sao cho tính kháng bệnh tốt hơn khi tiếp xúc với mầm bệnh lần sau” (Ellis, 1988)

1.2.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Những công trình nghiên cứu đầu tiên về đáp ứng miễn dịch của cá đối với các mầm bệnh vi khuẩn được tiến hành vào những năm 30 của thế kỷ trước Vào năm 1936, Nybelin đã công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá

đối với vi khuẩn Vibrio anguillarum Đến năm 1939, Pliszka nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá đối với Pseudomonas punctata Năm 1940, Smith công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối với Bacterium salmonicida (Aeromonas salmonicida) Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu này chưa thật

sự làm sáng tỏ rằng cá có khả năng tạo ra kháng thể chống lại các mầm bệnh (Hugh, 2007) Đến năm 1942, Duff chứng minh một cách rõ ràng rằng cá có thể tạo ra

kháng thể chống lại vi khuẩn Bacterium salmonicida Tuy nhiên kết quả nghiên cứu

của Duff không được quan tâm trong những nghiên cứu tiếp theo để nghiên cứu về vaccine phòng bệnh cho cá Nguyên nhân chính cho việc từ bỏ mối quan tâm đến

vaccine cho cá là do sự thành công đầy thuyết phục của các chất kháng sinh thế hệ mới từ sau Thế Chiến Thứ 2 Giai đoạn này được gọi là "thời đại của hóa trị" bởi vì

số lượng lớn thuốc kháng sinh có chất sulpha, các loại nitrofuran và thậm chí cả các tác nhân kháng khuẩn có chứa thủy ngân cũng được sử dụng thường xuyên trong nuôi trồng thủy sản Sau đó, khi mà hiệu quả của các hóa chất này đến lúc hết thời thì các sản phẩm sulpha tăng cường và quinolone được đưa vào sử dụng thay thế Bên cạnh đó nhiều loại hóa chất như: Formalin, permanganate kali, xanh malachite, amoninium, chất diệt cỏ “Diquat”, pyridylmercuric acetate, cloramine T được dùng

để điều trị ngoài thân Tuy nhiên, việc hóa trị rất tốn kém nhưng thời gian bảo hộ lại ngắn Bên cạnh đó việc hóa trị còn gặp một số vướng mắc như: Việc ngăn cấm sử dụng một số kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, yêu cầu sản phẩm thủy sản phải sạch hóa chất trước khi xuất bán, hiệu quả của các kháng sinh giảm do sự đề kháng của các mầm bệnh và sự vô hiệu quả của các kháng sinh đối với các mầm bệnh là virus Ngoài ra hóa trị trong nuôi trồng thủy sản còn ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và môi trường Khi việc sử dụng hoá trị không còn phổ biến thì mối quan tâm đến vaccine quay trở lại Dấu hiệu rõ ràng nhất là từ thập niên 70, khi nghề nuôi cá biển phát triển mạnh, đặc biệt là nền công nghiệp nuôi cá hồi Cá nuôi

thường bị bệnh đỏ miệng do vi khuẩn Vibrio anguillarum và Vibri ordalii gây ra,

nên đã kích thích sự phát triển vaccine phòng bệnh Năm 1976, Wildlife Vaccines,

Inc, Colorado là công ty đầu tiên sản xuất vaccine thương mại từ Yersinia ruckeri,

V anguillarum và V ordalii bằng phương pháp bất hoạt và được cấp phép lưu hành

bởi Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ (United States Department of Agriculture), dùng cho

cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) nuôi ở Idaho, Bắc Mỹ Các loại vaccine này trở

nên rất phổ biến với những người nuôi thủy sản thông qua hiệu quả của chúng và được sử dụng bằng cách cho ăn, tiêm, phun và tắm (mặc dù giấy phép lưu hành cho phép sử dụng bằng phương pháp tắm) (Breton, 2009) Đến năm 1981, công ty này

sản xuất thêm ba loại vaccine: A salmonicida, A salmonicida kết hợp với Y

ruckeri hoặc A salmonicida kết hợp với V anguillarum và V ordalii để bảo đảm

việc kháng khuẩn A salmonicida hiệu quả (loại vaccine chỉ có A salmonicida cho

thấy kém hiệu quả hơn loại vaccine kết hợp) và đường sử dụng là tiêm (Evelyn, 1996) Đến giữa thập niên 80, khi nghề nuôi cá hồi phát triển mạnh tại NaUy và Scotland đã mở ra một thị trường tiềm năng cho việc tiêu thụ vaccine cũng như thúc đẩy việc nghiên cứu vaccine Trong giai đoạn này người ta vẫn dùng vaccine dạng ngâm và vaccine tiêm dạng nước Đầu thập niên 90, vaccine thương mại đầu tiên dạng dầu có chứa chất bổ trợ là nhũ dầu phòng bệnh nhọt (furunculosis) trên cá hồi

Đại Tây Dương (Salmo salar) thông qua hình thức tiêm, của công ty Biomed và

Pharmaq được phép lưu hành (Midtlyng và ctv, 1996) Đến năm 1998, xuất hiện vaccine dạng dầu phòng nhiều bệnh khác nhau với liều thấp được sử dụng trên cá

hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) dạng tiêm của công ty Aqua Health và Novartis

(Smith và Hiney, 2000) Tuy nhiên, hiệu quả thương mại của các loại vaccine này không cao do những người nuôi không thích loại vaccine dùng để tiêm vì gây stress cho cá, tốn nhiều lao động cho việc tiêm từng con và mối quan tâm đến sức khoẻ cộng đồng do các chất bổ trợ có thể dẫn đến Đến năm 1998 và 1999, vaccine nhược độc dạng ngâm phòng bệnh nhiễm trùng máu và đường ruột cho cá da trơn của Mỹ (Enteric septicaemia of catfish) của công ty Intervet được thử nghiệm rộng rãi ở Mỹ, và đến mùa xuân năm 2000 thì được bán rộng rãi (Craig và ctv, 2009) Mặc dù trong giai đoạn này đã có nhiều loại vaccine được thương mại hóa và có rất nhiều nghiên cứu sâu rộng trong lĩnh vực vaccine nhưng hầu hết chỉ tập trung vào các vaccine phòng bệnh do vi khuẩn gây ra, có rất ít những nghiên cứu về vaccine phòng bệnh cho virus và kí sinh trùng Trong giai đoạn này nghề nuôi cá hồi cũng chịu ảnh hưởng nặng nề từ các dịch bệnh do virus gây ra chẳng hạn như: Bệnh hoại

tử tuyến tụy (Infectious Pancreatic Necrosis), bệnh nhiễm trùng máu và xuất huyết (Viral Hemorrhagic Septicemia), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (Infectious Haematopoietic Necrosis), bệnh thiếu máu truyền nhiễm trên cá hồi (Infectious Salmon Anaemia), Từ đó thúc đẩy cho nhiều nghiên cứu nhằm phát triển vaccine chống lại các bệnh do virus gây ra và chỉ mới dựa trên các virus bất hoạt hoặc giảm độc lực, các loại vaccine này cũng cho thấy một mức độ bảo vệ tương đối trong việc phòng các bệnh do virus gây ra (Lorenzen và Olesen, 1997) Virus được tăng sinh

bằng cách nuôi cấy trong các tế bào cá, do đó chi phí sản xuất vaccine dựa trên các virus bất hoạt thường quá cao khó có hiệu quả kinh tế Trong khi đó vaccine giảm độc lực có nhiều lợi thế hơn, do chúng được cấp thông qua đường ngâm nên giảm đáng kể chi phí, hơn nữa khi vào cơ thể cá chúng sẽ tăng sinh làm tăng hàm lượng kháng nguyên trong cơ thể cá được chủng ngừa nên liều lượng cần thiết để cấp cho

cá là nhỏ hơn so với dạng bất hoạt Tuy nhiên, đôi khi virus giảm độc lực lại gây bệnh cho cá và việc phát tán các virus sống giảm độc lực vào môi trường nước thường không được chấp nhận bởi các chiến lược kiểm soát của thú y và môi trường, khi đó việc nghiên cứu DNA vaccine được chú trọng Năm 1997, Christie

sử dụng một protein tái tổ hợp VP2 (aa 200-350) của virus gây bệnh hoại tử tuyến

tụy trên cá hồi được sản xuất thông qua chủng Escherichia coli đột biến, chủng

ngừa cho cá hồi Đại Tây Dương và vaccine này đã cho thấy một tác dụng bảo vệ chống lại virus gây bệnh hoại tử tuyến tụy Đến năm 2005, vaccine DNA đầu tiên của công ty Novartis phòng bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do virus gây ra trên cá

hồi (Oncorhynchus sp., Oncorhynchus mykiss, Salmo salar) được cấp phép sử dụng

cho cá nuôi thương phẩm (Ronald, 2009)

1.2.3 Phân loại vaccine

1.2.3.1 Theo công nghệ sản xuất

● Vaccine bất hoạt (Inactivated): Tác nhân gây bệnh được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường thích hợp khi đạt được đến một mật độ nhất định sẽ bất hoạt chúng bằng nhiều cách khác nhau như: Nhiệt độ, formol, hóa chất, áp lực cao hoặc dùng năng lượng phóng xạ, Hầu hết các vaccine sử dụng để phòng bệnh do vi khuẩn được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản đều là vaccine bất hoạt (Newman, 1993; Toranzo và ctv, 1997) Trong những năm gần đây, vaccine bất hoạt chống virus truyền nhiễm hoại tử tuyến tụy trên cá hồi Đại Tây Dương và bệnh xuất huyết

cá trắm cỏ đã được sử dụng với một số thành công (Dixon, 1997)

● Vaccine nhược độc (Live, Attenuated): Dùng tác nhân gây bệnh còn sống nhưng giảm độc lực như là một vaccine để kích thích hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ Có nhiều cách khác nhau để làm giảm độc lực của mầm bệnh: Tạo nên chủng

đột biến của vi khuẩn thông qua cấy chuyền (qua nhiều lần cấy chuyền độc lực của

vi khuẩn sẽ giảm dần) Bên cạnh đó có những chủng vi khuẩn khi kéo dài thời gian nuôi cấy độc lực cũng giảm dần Mặt khác cũng có những chủng đột biến tự nhiên, hoặc dùng công nghệ gen (tác nhân gây bệnh sẽ được loại bỏ đi một số gen quy định độc lực của mầm bệnh hoặc có thể cấy những gen nhược độc vào cơ thể

chúng) Một số vaccine sống đã được thử nghiệm cho các mầm bệnh trên cá như: A

salmonicida, E tarda, E ictaluri,… Hiện nay, chỉ có một loại vaccine E ictaluri

nhược độc đã được cấp phép tại Mỹ được sử dụng để tắm cho cá nheo 9 ngày tuổi phòng bệnh ESC (Shoemaker và ctv, 2002)

Các quan ngại khi sử dụng loại vaccine nhược độc là mầm bệnh nhược độc vẫn còn sống và có thể biến thành chủng có độc lực cao Do vậy, cần phải hết sức thận trọng trong quá trình bảo quản và sử dụng vaccine sống (Lê Văn Hùng, 2002)

● Vaccine tiểu đơn vị (Sub – unit vaccine): Là loại vaccine được sản xuất từ tiểu phần kháng nguyên của các tác nhân gây bệnh như: Thành tế bào ở vi khuẩn hoặc một phần vỏ, protein nội hoặc ngoại bào của vi khuẩn cũng như của virus Vaccine tiểu phần có thể được sản xuất theo 1 trong 3 phương pháp dưới đây: + Sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách tách chiết trực tiếp tiểu phần kháng nguyên từ vi khuẩn sau khi nuôi cấy tăng sinh như làm vỡ vách tế bào, tách lọc protein nội hoặc ngoại bào tùy thuộc vào thành phần của kháng nguyên

+ Sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách xác định gene độc lực của vi khuẩn

sau đó đưa gene độc lực vào plasmid, trước khi biến nạp vào vi khuẩn E.coli và

nuôi cấy vi khuẩn này trong điều kiện đặc biệt nhằm sản xuất ra tiểu phần kháng nguyên cần thiết Sau đó tách lọc kháng nguyên và sử dụng như vaccine tiểu phần + Sau khi xác định được gene độc lực chúng ta có thể tổng hợp protein nhân tạo bằng phương pháp phòng thí nghiệm

Việc nghiên cứu và sản xuất loại vaccine này rất tốn kém, giá thành cao nên

ít được phát triển và sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

● DNA vaccine: Vaccine DNA là loại vaccine có thành phần chính là gene độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh được đưa trực tiếp vào cơ thể cá nhằm giúp

bản thân cơ thể cá sản xuất protein kháng nguyên Ðây là công nghệ sản xuất vaccine mới nhất và thường áp dụng trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh do virus gây ra (Gudding và ctv, 1999) Một nhược điểm lớn nhất của loại vaccine này

đó là chi phí sản xuất cao

1.2.3.2 Theo thành phần kháng nguyên

● Vaccine đơn giá: Là loại vaccine chỉ phòng một mầm bệnh duy nhất

● Vaccine đa giá: Là loại vaccine nhằm phòng nhiều loại bệnh khác nhau

Vaccine với các kháng nguyên từ V anguillarum, V salmonicida, và A

salmonicida đã được nhận thấy rằng có tác dụng phòng bệnh nhọt (furunculosis)

trên cá hồi tốt hơn vaccine đơn giá phòng bệnh này (Midtlyng và ctv, 1996) Việc

này được giải thích bởi có đáp ứng miễn dịch chéo của cơ thể cá đối với A

salmonicida và V salmonicida (Hoel và ctv, 1998)

1.2.4 Các hình thức cấp vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Trong thủy sản để cấp vaccine cho cá người ta thường áp dụng các hình thức sau:

● Tiêm (Injection): Vaccine được tiêm trực tiếp vào cơ thể cá, có thể tiêm ở dưới gốc vây lưng hoặc có thể tiêm vào xoang bụng của cá Ở các nước phát triển người ta đã chế tạo ra những máy tiêm tự động để bơm thuốc theo một hệ thống dây truyền, với công suất khoảng 1.000 cá/giờ, dùng để tiêm vaccine cho cá giống trước khi thả nuôi Đây là phương pháp có hiệu quả nhất, phương pháp này có thể kích thích sản xuất kháng thể toàn thân cũng như cho hiệu quả bảo hộ tối ưu, đồng thời

nó cho phép kết hợp được nhiều kháng nguyên trong một loại vaccine đơn lẻ (Evelyn, 2002) Hiện nay đã có vaccine bảo vệ chống lại 6 loại mầm bệnh cùng lúc (5 bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh do virus) (Grisez và Tan, 2005) Tuy nhiên, phương pháp tiêm khó thực hiện khi cá còn nhỏ và phải cần nhiều nhân công lao động vì số lượng cá thả nuôi thường nhiều, mặt khác đối với phương pháp tiêm việc gây mê và bắt giữ đối tượng thủy sản khi tiêm vaccine dễ dàng gây sốc cho đối tượng thủy sản

● Ngâm (Immersion): Dùng vaccine hòa tan trong nước có thể tích nhỏ, ngâm trực tiếp cá trong một khoảng thời gian ngắn từ 30 – 60 giây Đối với phương

pháp này vaccine sẽ được hấp thụ qua da, mang, đường bên, và một ít qua miệng

Cơ chế hấp thụ kháng nguyên chưa biết được chắn chắn, nhưng người ta thấy rằng mang là con đường chính để các hấp thụ các kháng nguyên Bên cạnh đó thì da và các cơ quan đường bên cũng có tham gia vào quá trình thấp thụ các kháng nguyên

● Tắm (Bath): Nhằm hạn chế làm sốc cho cá theo phương pháp ngâm, người

ta sử dụng phương pháp tắm vaccine cho cá bằng cách cho vaccine vào bể cá Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn vaccine và thời gian tắm là khoảng 1

giờ

● Phun (Spray): Đây là phương pháp được phát triển đồng thời với phương

pháp ngâm Vaccine được phun hoặc được dẫn bằng hệ thống bán tự động thông qua băng truyền chạy qua dưới những vòi phun vaccine Phun vaccine có khả năng gây sốc cá và kết quả có thể rất thay đổi

+ Ưu điểm của nhóm phương pháp dẫn truyền qua da (ngâm, tắm, phun) : Dễ

áp dụng đối với cá nhỏ, thời gian ngắn, có thể áp dụng cho số lượng cá nhiều + Nhược điểm của nhóm phương pháp dẫn truyền qua da (ngâm, tắm, phun): gây stress cho cá, mặt khác hiệu quả đáp ứng miễn dịch và bảo hộ miễn dịch thường không cao

● Cho ăn (Oral): Đây là phương pháp dễ làm nhất, vaccine được trộn vào thức ăn và cho cá ăn Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém do không cần phải sử dụng nhiều nhân công lao động, không gây stress cho cá tuy nhiên hiệu quả đáp ứng miễn dịch thường kém và thường không đồng đều vì có cá thể ăn ít có

cá thể ăn nhiều Mặt khác do thức ăn qua đường miệng vào đường tiêu hóa nên kháng nguyên dễ bị pH thấp của dạ dày hoặc bị các enzyme tiêu hóa làm hư hại Hiện nay đối với các kháng nguyên nhạy cảm, các phương pháp đóng gói sinh học đang được nghiên cứu và thử nghiệm, trong trường hợp này các loại thức ăn sống như ấu trùng artemia, giáp xác chân chèo hoặc luân trùng sẽ được nuôi trong một môi trường chứa huyền dịch vaccine sau đó chúng được sử dụng để làm thức ăn cho

ấu trùng tôm cá, vì đây là các loài sinh vật không ăn chọn lọc nên chúng sẽ tích lũy

các kháng nguyên trong đường tiêu hóa của chúng và chúng trở thành các viên nang siêu nhỏ để đưa vaccine vào cơ thể tôm cá (Campbell và ctv, 1993)

1.2.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản một khi bệnh đã xảy ra thường gây hậu quả rất nghiêm trọng nên phòng bệnh bao giờ cũng tốt hơn chữa bệnh

Một trong những lợi thế lớn khác của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản đó là làm giảm thiểu việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất, vừa tiết kiệm được tiền của vừa không làm ảnh hưởng xấu đến môi trường ao nuôi, vừa tăng năng suất cá nuôi nhưng vẫn đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Ngành công nghiệp nuôi cá hồi trên thế giới là một ví dụ điển hình cho sự thành công của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản Ngành công nghiệp nuôi cá hồi phát triển đầu những năm 1980 đến năm 2003 sản lượng trên thế giới đạt khoảng 700.000 tấn Tuy nhiên bệnh do vi khuẩn là một trong những trở ngại cho ngành công nghiệp này Lượng kháng sinh sử dụng trong nghề nuôi cá hồi tăng dần từ 0,3 - 0,9 kg/tấn sản phẩm vào năm 1987 (FAO, 2006) Sau đó lượng kháng sinh sử dụng giảm dần từ khi xuất hiện các loại vaccine có hiệu quả trong việc phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên đối tượng này từ những năm 90 của thế kỷ trước và cho đến nay hầu như không còn sử dụng kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi thương phẩm Việc sử dụng vaccine không chỉ thay thế thuốc kháng sinh trong nghề nuôi cá hồi mà còn làm giảm chi phí sản xuất cá hồi trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAO vào năm 2006 thì chi phí để sản xuất ra 1 kg cá hồi năm 1987 là

7 Euro, đến năm 2003 đã giảm xuống còn dưới 2 Euro/kg Có nhiều nguyên nhân giúp cho chi phí sản xuất cá hồi giảm như: cải tiến công nghệ nuôi, hoàn thiện thức

ăn công nghiệp và đặc biệt là tăng tỷ lệ sống của cá nhờ vào việc sử dụng các loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn trên đối tượng này Cũng theo FAO cho đến năm

2005 có đến 95% tổng số cá được tiêm vaccine trước khi đưa vào nuôi thương phẩm và tỷ lệ sống của cá nuôi thương phẩm đạt trên 90%

Biểu đồ 1.1 Sản lượng cá hồi và cá hồi vân cùng với lượng kháng sinh sử dụng

(Nguồn: FAO, 2006)

Một ưu điểm khác của việc sử dụng vaccine là giúp tránh được tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn

1.2.6 Tình hình sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Cho đến tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh virus được đăng ký bản quyền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới Bao gồm cá hồi, cá chẽm châu âu, cá chẽm châu á, cá rô phi, cá bơn, và cá ngừ (Hastein và ctv, 2005)

1.2.7 Tình hình sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Đối với nước ta, vaccine cho cá vẫn chưa được sử dụng, đây là một vấn đề khá mới Cho đến thời điểm hiện nay vẫn chưa có một loại vaccine nào được cấp phép lưu hành và sử dụng cho cá nuôi ở Việt Nam

Tuy nhiên, trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine tại Việt Nam: Trong năm 2000, tập đoàn Intervet Nobio – Hà Lan phối hợp với Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đánh giá khảo nghiệm bốn sản phẩm vaccine phòng bệnh phát sáng do vibrio trên tôm sú nhưng kết quả cho thấy vaccine này không hiệu quả (Minh Thành, 2008) Năm 2006, Viện Nghiên

Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với Công ty Thuốc Thú y Trung Ương II (NAVETCO) nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra (Nguyễn Thị Hiền, 2009) Sự hợp tác nghiên cứu giữa công ty Pharmaq – Na Uy và Bayer Việt

Nam trong việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ do E ictaluri trên cá tra (Từ Thanh Dung, 2011) Gần đây nhất là công trình nghiên cứu tạo chủng E

ictaluri đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen nhằm sử dụng làm vaccine cho cá

tra của trung tâm công nghệ sinh học thuộc Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thành Phố Hồ Chí Minh thực hiện (Nguyễn Quốc Bình và ctv, 2010) Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có thông tin cụ thể nào về kết quả nghiên cứu được công bố rộng rãi

1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản

● Yếu tố di truyền: Đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine vì mỗi loài cá khác nhau sẽ có khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau Do đó trước khi tiến hành sản xuất một loại vaccine nào đó cần nghiên cứu thật kỹ khả năng đáp ứng miễn dịch của đối tượng đó

● Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine: Cỡ cá (cá lớn sẽ có sức đề kháng tốt hơn cá nhỏ) Cá khỏe mạnh sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốt hơn cá yếu Cá

có điều kiện dinh dưỡng tốt sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốt hơn những cá được nuôi trong điều kiện dinh dưỡng kém

● Các yếu tố môi trường: Cá được nuôi trong điều kiện môi trường nước tốt,

có các chỉ tiêu môi trường như pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, NH3 trong khoảng thích hợp sẽ cho đáp ứng tốt so với cá sống trong môi trường bất lợi

● Trình độ kỹ thuật của người sử dụng: Các thao tác trong quá trình cấp vaccine cần phải được chuẩn bị tốt, thao tác phải chính xác và đúng tránh gây shock cho cá nuôi Phải có kiến thức trong việc bảo quản vaccine

● Việc sử dụng các loại thuốc và hóa chất khác: Các loại thuốc và kháng sinh sẽ ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của cá từ đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine Khi tiêm hồng cầu thỏ vào cơ của cá chép, đáp ứng miễn dịch dịch thể thứ phát có thể được phát hiện vào ngày thứ 9 Tuy nhiên nếu xử lí cá thí