Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1.3. Kết quả công cường độc vào ngày thứ 46
● Tỷ lệ chết
+ Trong quá trình công cường độc với E. ictaluri, số lượng cá chết được ghi nhận mỗi ngày. Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày và tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức trong suốt 21 ngày công cường độc được thể hiện qua biểu đồ 3.2 và 3.3.
46
0 0 0 0
2 13,33
24
18
12
6,67
2
0,67 0 0 0 0 0 0 0 0
6,67
8,67 9,33
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0
0 0,67
1,33 4,67 8
6,0
1,33 0,67 0
5 10 15 20 25 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Ngày
Tỷ lệ chết (%)
C1.2 B2 C4
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi công cường độc với E. ictaluri vào ngày 46
46
85,33 85,33 85,33 85,33 85,33
8 24,67
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0,67
8,67 22
40,67 40,67 76
64 82,67
84,67
2
40,00 40,67 40,67 40,67
16 34
38,67
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy trung bình (%)
C1.2 B2 C4
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với E. ictaluri vào ngày 46
+ Qua biểu đồ 3.2 và 3.3 cho thấy rằng cá bắt đầu chết vào ngày thứ 5 của quá trình công cường độc, sau đó lượng cá chết của mỗi nghiệm thức tăng dần và đạt cực đại, sau đó giảm dần và cuối cùng không còn cá chết từ ngày thứ 14 trở đi.
Đối với nghiệm thức đối chứng dương C1.2 tỷ lệ phần trăm cá chết trung bình đạt
47
cực đại vào ngày thứ 8 chiếm 24% sang ngày thứ 9 chỉ chết 18% và giảm dần còn 12%, 6,67%, 2%, 0,67% vào các ngày thứ 10, 11, 12, 13 và không còn cá chết từ ngày thứ 14 trở đi. Trong khi đó đối với nghiệm thức cấp vaccine đa giá B2 tỷ lệ phần trăm cá chết trung bình vào ngày thứ 8 và 9 lần lượt là 8%, 8,67%, chỉ đạt cực đại vào ngày thứ 10 là 9,33% sau đó giảm dần và không còn cá chết từ ngày thứ 14 trở đi. Có thể thấy rằng việc cấp vaccine đã có hiệu quả chống lại mầm bệnh nên thời gian phát bệnh lâu hơn và thời gian để tỷ lệ chết trung bình đạt cực đại dài hơn và tỷ lệ chết trung bình cực đại cũng thấp hơn. Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với E. ictaluri vào ngày thứ 46 được thể hiện thông qua bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với E.
ictaluri vào ngày thứ 46
Nghiệm thức Tỷ lệ chết trung bình (%)
C1.2 85,33a ± 4,62
B2 40,67b ± 7,02
C4 0c ± 0,00
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P > 0,05)
+ Qua bảng 3.5 cho thấy rằng tỷ lệ chết trung bình ở nghiệm thức đối chứng dương C1.2 là cao nhất đạt 85,33%, trong khi đó nghiệm thức cấp vaccine đa giá B2 có tỷ lệ chết trung bình là 40,67% thấp hơn 2,10 lần với nghiệm thức đối chứng dương không cấp vaccine C1.2. Riêng nghiệm thức C4 là nghiệm thức đối chứng âm không công cường độc nên không có cá chết. Các sự sai khác này đều có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05).
● Triệu chứng và bệnh tích
+ Vào 3 ngày đầu sau khi công cường độc cá vẫn bơi lội bình thường, không có cá chết. Sang ngày thứ 4 cá trong các bể có dấu hiệu lờ đờ, nổi đầu trên mặt nước, ở một số cá có biểu hiện xuất huyết nhẹ ở các gốc vây, tuy nhiên, trong ngày
48
này vẫn không có cá chết. Từ ngày thứ 5 bắt đầu có cá chết, cá chết có biểu hiện xuất huyết ở các gốc vây, xuất huyết điểm quanh gốc miệng, tích dịch xoang bụng, gan, thận, lách có các đốm hoại tử trắng. Vào ngày thứ 10 một số cá trong các bể bơi lội linh hoạt. Vào ngày thứ 14 ở các bể không còn cá chết, cá bơi lội linh hoạt.
+ Về mặt vi thể: Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mẫu mô bình thường mà tách rời ra thành từng tế bào riêng lẽ hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc. Tùy theo mức độ của bệnh mà cấu trúc tế bào bị phá vỡ nhiều hay ít. Bên cạnh đó, hiện tượng xuất huyết cũng được nhận thấy khi quan sát mô bệnh. Tùy mức độ nhiễm bệnh nặng nhẹ mà các đảo tụy bị phá vỡ nhiều hay ít. Đối với mẫu mô thận, cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, nhiều vùng bị xuất huyết, hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại nặng. Cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng. Những đốm trắng trên lách là những vùng mô hoại tử, với nhiều mức độ khác nhau.
Hình 3.1. Biểu hiện bên ngoài của cá chết khi công cường độc với E. ictaluri vào ngày thứ 46, xuất huyết các gốc vây, xuất huyết điểm quanh gốc miệng
Hình 3.2. Biểu hiện bên trong của cá chết khi công cường độc với E. ictaluri vào ngày thứ 46, có các đốm hoại tử trên gan, thận và lách
49 Hình 3.3. Mô gan cá tra khỏe (H&E, x 100), các tế bào gan xếp sát nhau (a) , cấu trúc các đảo tụy nguyên vẹn (b)
Hình 3.4. Mô gan cá tra nhiễm E.
ictaluri (H&E, x 100), các tế bào gan bị thoái hóa (c), đảo tụy bị hư hại (d), có hiện tượng xuất huyết (e)
Hình 3.5. Mô thận cá tra khỏe (H&E, x1000), cấu trúc các ống thận nguyên vẹn
Hình 3.6. Mô thận cá tra nhiễm E.
ictaluri (H&E, x400), cấu trúc các ống thận bị hư hại nghiêm trọng ( )
a
b
d
e c
50 Hình 3.7. Mô lách cá tra khỏe (H&E, x 100). Cấu trúc các phần tủy trắng (f), tủy đỏ (g) bình thường
Hình 3.8. Mô lách cá tra nhiễm E.
ictaluri (H&E, x 100). Có những vùng hoại tử (h), những vùng xuất huyết (k), và sự xuất hiện của các đại thực bào sắc tố (l)
● Kết quả định danh vi khuẩn
Tiến hành cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách cá bệnh chết trên các đĩa môi trường BHIA sau đó đem ủ ở nhiệt độ 300C, kết quả cho thấy đều tạo thành các khuẩn lạc có màu trắng trong, nhỏ li ti sau 24 giờ ủ. Sau 48 giờ ủ khuẩn lạc tròn lồi, có rìa răng cưa, kích thước 0,5 – 2 mm. Khi tiến hành nhuộm gram vi khuẩn bắt màu hồng, gram âm, trực khuẩn, cho phản ứng catalase dương tính và âm tính với phản ứng oxidase. Tái định danh 15 gốc vi khuẩn trong số các gốc vi khuẩn thu được bằng test định danh vi khuẩn API-20E của công ty BioMérieus cho kết quả 100% đều là E. ictaluri. Kết quả của các phản ứng sinh hóa được thể hiện thông qua phụ lục 2. Điều đáng lưu ý là trên các đĩa cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh chết đều có sự hiện diện của các khuẩn lạc của vi khuẩn A. hydrophila tại nơi xuất phát đường cấy. A. hydrophila được biết đến như là một loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội, trong trường hợp này khi công cường độc với E. ictaluri cơ thể cá trở nên yếu đi chúng dễ dàng gia tăng số lượng nên khả năng gây bệnh cơ hội là rất cao. Điều này cho thấy mối quan hệ mật thiết giữa bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết do A.
hydrophila gây ra và tầm quan trọng của việc sử dụng vaccine kết hợp để phòng cùng lúc 2 loại mầm bệnh này.
g f
l h
k
51
Hình 3.9. Kết quả cấy phân lập E. ictaluri từ cá bệnh trên môi trường BHIA, luôn có sự xuất hiện của A. hydrophila tại nơi xuất phát đường cấy ( )
● Kết quả cấy kiểm tra vi khuẩn đối với cá còn sống sau 21 ngày công cường độc
Đối với số cá còn sống sau khi công cường độc, mỗi bể tiến hành mổ khám 5 cá để xem biểu hiện của các cơ quan như: Gan, thận, lách và cấy phân lập từ các cơ quan này để kiểm tra khả năng còn phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn tại các cơ quan này, để đưa ra dự đoán tình trạng sức khỏe của cá sau 21 ngày công cường độc.
Bảng 3.6. Tỷ lệ trung bình phát hiện vi khuẩn E. ictaluri khi cấy cá còn sống sau 21 ngày công cường độc E. ictaluri vào ngày 46
Nghiệm thức Số lượng cá kiểm tra Tỷ lệ trung bình phát hiện vi khuẩn E. Ictaluri
C1.2 15 13,33a ± 11,55
B2 15 0,00a ± 0,00
C4 15 0,00a ± 0,00
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P > 0,05).
52
Đối với nghiệm thức C1.2 khi tiến hành mổ khám cho thấy vẫn còn 2 cá ở bể C1.2.1 và C1.2.2 có các đốm hoại tử trên gan nhưng thận và lách hoàn toàn bình thường. Khi tiến hành cấy phân lập thì thấy vẫn còn sự hiện diện của vi khuẩn E.
ictaluri nhưng từ ngày thứ 14 đến ngày thứ 21 của quá trình công cường độc hoàn toàn không còn cá chết có thể thấy rằng cá đang trong giai đoạn phục hồi.
● Tỷ lệ bảo hộ
Từ các kết quả trên đưa đến kết luận: Tất cả số cá chết trong quá trình công cường độc với E. ictaluri đều do E. ictaluri gây ra. Trên cơ sở đó chúng tôi tính toán tỷ lệ bảo hộ trung bình của nghiệm thức cấp vaccine đa giá B2 là 52,34. Kết quả này cho thấy rằng mặc dù tỷ lệ bảo hộ trung bình của nghiệm thức B2 là 52,34%, tuy chưa thật sự cao nhưng đã lớn hơn 50%.
3.1.3.2. Đối với cá công cường độc với A. hydrophila
● Tỷ lệ chết
+ Số lượng cá chết cũng được chúng tôi ghi nhận mỗi ngày. Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày và tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức trong suốt 21 ngày công cường độc với A. hydrophila được thể hiện qua biểu đồ 3.4 và 3.5.
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 18,67 27,33
8
4
0,67 0,66 13,33
7,34 3,34 6,66
2 14
10
4,67 4 2 0
5 10 15 20 25 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ngày
Tỷ lệ chết (%)
C1.1 A1 B1 C3
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ cá chết trung bình từng ngày của các nghiệm thức khi công cường độc với A. hydrophila vào ngày 46
53
71,33 71,33 71,33 71,33
32,67 32,67 32,67 32,67
34,67 34,67 34,67 34,67
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
27,33 46
58
66 70 70 70,6771,33 71,33 71,33
13,33 20,67
27,3330,6732,67 32,67 32,67 32,67 32,67 24
14 28,67
32,6734,67 34,67 34,67 34,67 34,67
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ngày
Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình (%)
C1.1 A1 B1 C3
Biểu đồ 3.5. Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc với A. hydrophila vào ngày 46
+ Qua biểu đồ 3.4 và 3.5 cho thấy rằng chỉ sau một ngày công cường độc với A. hydrophila bắt đầu có cá chết và tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức đều đạt cực đại vào ngày thứ 2 khi công cường độc, sau đó có xu hướng giảm dần, điều này cho thấy sự khác biệt trong diễn tiến bệnh do A. hydrophila và E. ictaluri gây ra. Trong ngày thứ 2 nghiệm thức đối chứng dương C1.1 có tỷ lệ chết trung bình cao nhất đạt 27,33% kế đến là nhiệm thức cấp vaccine đa giá B1 đạt 14% và kế đến là nghiệm thức cấp vaccine đơn giá A1 đạt 13,33%, nghiệm thức đối chứng âm C4 không có cá chết. Đối với hai nghiệm thức có cấp vaccine là A1 và B1 tỷ lệ chết trung bình giảm dần từ ngày thứ 3, từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 21 không còn cá chết. Đối với nghiệm thức đối chứng dương C1.1 tỷ lệ chết trung bình cũng giảm dần từ ngày thứ 3 và không còn cá chết vào ngày thứ 7. Tuy nhiên sang ngày thứ 8 và 9 ở nghiệm thức này vẫn xuất hiện cá chết với tỷ lệ trung bình lần lượt là: 0,67%, 0,66%, sau đó từ ngày thứ 10 đến ngày 21 không còn cá chết. Tỷ lệ chết cao của các nghiệm thức vào ngày thứ 2 sau khi công cường độc sau đó giảm dần cho thấy tính chất gây bệnh của A. hydrophila là một loại khuẩn cơ hội vì trước khi công cường độc cá ở các nghiệm thức đều được tạo vết thương bằng cách rạch vây. Càng về
54
những ngày sau vết thương dần phục hồi và cơ thể cá càng tạo được sức đề kháng chống lại mầm bệnh. Cùng với tỷ lệ chết thấp và việc nghiệm thức A1 và B1 từ ngày thứ 7 trở đi không còn cá chết đã cho thấy được tính hiệu quả của vaccine vì ở nghiệm thức đối chứng dương C1.1 sang ngày thứ 8 và 9 vẫn còn cá chết. Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức sau 21 ngày công cường độc được thể hiện thông qua bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi công cường độc A.
hydrophila vào ngày thứ 46
Nghiệm thức Tỷ lệ chết trung bình (%)
C1.1 71,33a ± 6,43
A1 32,67b ± 2,31
B1 34,67b ± 3,06
C3 0c ± 0,00
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P > 0,05)
+ Qua bảng 3.7 cho thấy rằng sau 21 ngày công cường độc, nghiệm thức đối chứng dương C1.1 có tỷ lệ chết trung bình cao nhất là 71,33% kế đến là nghiệm thức cấp vaccine đa giá B1: 34,67%, tiếp theo là nghiệm thức cấp vaccine đơn giá A1: 32,67%, riêng nghiệm thức đối chứng âm C3 không có cá chết. Sự khác biệt về tỷ lệ chết trung bình của nghiệm thức A1 và B1 đều không có ý nghĩa về mặt thống kê so với nhau (P>0,05) nhưng lại có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức C1.1 và C3 (P<0,05). Tỷ lệ chết của các nghiệm thức A1, B1 thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng dương C1.1 lần lượt là: 2,18 lần và 2,06 lần.
● Triệu chứng và bệnh tích
+ Buổi sáng sau khi công cường độc cá vẫn bình thường. Tuy nhiên, vào buổi chiều cùng ngày cá có biểu hiện lờ đờ, bơi lội yếu ớt trên mặt nước. Từ ngày thứ 2 cá bắt đầu chết với số lượng rất nhiều, tất cả cá chết đều có biểu hiện xuất huyết nặng ở các gốc vây, lỗ hậu môn, xuất huyết điểm dày đặc quanh miệng, vùng
55
sọ đầu bị xuất huyết nặng, các hốc mắt xuất huyết và kèm theo hiện tượng lồi mắt, thận xuất huyết nặng, lách sẫm màu và sưng, gan, bóng hơi, dạ dày có hiện tượng sung huyết làm nổi rõ các mạch máu, xuất huyết xoang bụng nghiêm trọng. Từ ngày thứ 7 trở đi cá trong các bể bơi lội hoàn toàn bình thường và không có cá chết.
Hình 3.10. Cá chết vào ngày thứ 2 khi công cường độc với A. hydrophila có hiện tượng lồi mắt và xuất huyết dưới phần sọ đầu, xuất huyết nặng ở các gốc vây
Hình 3.11. Cá chết vào ngày thứ 2 khi công cường độc với A. hydrophila có biểu hiện xuất huyết ở thận, lách sưng và sẫm màu, gan, dạ dày có hiện tượng sung huyết
+ Về mặt vi thể: Cũng giống với mẫu mô gan cá bị nhiễm E. ictaluri, các tế bào gan cá nhiễm A. hydrophila không còn sát nhau như ở mẫu mô bình thường mà tách rời ra thành từng tế bào riêng lẻ hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc. Tùy theo mức độ của bệnh mà cấu trúc tế bào bị phá vỡ nhiều hay ít. Bên cạnh đó ngoài một số vùng xuất huyết hiện tượng sung huyết cũng được nhận thấy khi quan sát mô bệnh, các đảo tụy bị phá vỡ. Đối với mẫu mô thận, cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, nhiều vùng bị xuất huyết và sung huyết, hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại. Lách hoại tử với nhiều mức độ khác nhau và xuất huyết, bên cạnh đó có kèm hiện tượng sung huyết. Có thể thấy được sự khác biệt về mặt mô học của cá bị nhiễm A. hydrophila so với E. ictaluri là sự xuất hiện của các vùng sung huyết trong các mẫu mô quan sát.
56
Hình 3.12. Mẫu mô gan cá bị nhiễm A. hydrophila (H&E, x 100), các tế bào gan bị thoái hóa, các đảo tụy bị hư hại và có hiện tượng sung huyết
Hình 3.13. Mẫu mô thận cá bị nhiễm A. hydrophila (H&E, x 100), cấu trúc các ống thận bị hư hại có kèm hiện tượng sung huyết
Hình 3.14. Mẫu mô lách cá bị nhiễm A. hydrophila (H&E, x 100), xuất hiện nhiều vùng hoại tử không còn nhận ra cấu trúc, có hiện tượng sung huyết
● Kết quả định danh vi khuẩn
Tiến hành cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách cá chết trên các đĩa môi trường NA sau đó đem ủ ở nhiệt độ 300C. Kết quả cho thấy vi khuẩn phát triển rất nhanh, hoàn toàn thuần, tạo thành các khuẩn lạc vàng, nhẵn, lồi, kích thước 1,5 – 2,5 mm, đặc biệt khi phát triển trên môi trường chọn lọc Rimler Shotts cho các khuẩn lạc có màu vàng. Khi tiến hành nhuộm gram vi khuẩn bắt màu hồng, gram âm, trực khuẩn ngắn, cho phản ứng catalase và oxidase dương tính. Khi tiến hành định danh 15 gốc vi khuẩn trong số các gốc vi khuẩn thu được bằng test định danh vi khuẩn API 20E của công ty BioMérieus cho kết quả 100% đều là A. hydrophila
57
với code là 726712567 với độ tin cậy là 99%. Kết quả của các phản ứng sinh hóa được thể hiện thông qua phụ lục 3.
Hình 3.15. Kết quả cấy phân lập A.
hydrophila từ cá bệnh chết trên môi trường NA, thuần và đồng nhất
.
Hình 3.16. Vi khuẩn A. hydrophila phát triển trên môi trường Rimler Shotts cho khuẩn lạc màu vàng
● Kết quả cấy kiểm tra vi khuẩn đối với cá còn sống sau 21 ngày công cường độc
Đối với cá còn sống sau 21 ngày công cường độc, cũng tiến hành mổ khám 5 cá để cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách kiểm tra khả năng còn phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn tại các cơ quan này, để đưa ra dự đoán tình trạng sức khỏe của cá sau 21 ngày công cường độc. Kết quả cho thấy rằng cá còn sống sau 21 ngày công cường độc với A. hydrophila hoàn toàn bình thường và khi tiến hành cấy phân lập không phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn tại các cơ quan này
● Tỷ lệ bảo hộ
Từ các kết quả trên chứng tỏ rằng tất cả số cá chết trong quá trình công cường độc với A. hydrophila đều do A. hydrophila gây ra. Trên cơ sở đó chúng tôi tính toán tỷ lệ bảo hộ trung bình của các nghiệm thức cấp vaccine và được thể hiện thông qua biểu đồ 3.6.
58 54,21
51,4
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tỷ lệ bảo hộ trung bình (%)
A1 B1
Nghiệm thức
Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ bảo hộ trung bình của các nghiệm thức cấp vaccine khi công cường độc với A. hydrophila vào ngày thứ 46
Qua biểu đồ 3.6 cho thấy mặc dù nghiệm thức B1 là nghiệm thức được cấp vaccine đa giá phòng bệnh do E. ictaluri và A. hydrophila nhưng lại có tỷ lệ bảo hộ trung bình đối với A. hydrophila là 51,4% thấp hơn so với nghiệm thức A1 được cấp vaccine đơn giá A. hydrophila có tỷ lệ bảo hộ trung bình là 54,21%. Tuy tỷ lệ bảo hộ trung bình của 2 nghiệm thức này chưa thật sự cao nhưng vẫn lớn hơn 50%.