KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CỊI BẰNG KĨ THUẬT PCR Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM THỊ HUYỀN TRANG Niên khoá : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ THUẬT PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI PHẠM THỊ HUYỀN TRANG Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Các Thầy Cô anh chị Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình nghiên cứu thực khóa luận Kỹ sư Võ Khánh Hưng, chị Bùi Thị Kim Hằng tận tình bảo hướng dẫn em trình thực đề tài Tập thể lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 32 bạn bè động viên giúp đỡ suốt q trình học tập thực khố luận Thành phố Hồ Chí Minh tháng năm 2010 Phạm Thị Huyền Trang i TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát nhiễm Porcine circovirus type mẫu : huyết thanh, hạch, phân từ heo còi kĩ thuật PCR” thực nhằm mục đích tìm phương hướng chẩn đoán sớm PCV2 Đề tài tiến hành gồm ba nội dung: phát PCV2 kỹ thuật PCR từ loại mẫu khác nhau; phân tích trình tự PCV2 thu nhận tiến hành xây dựng sinh dòng Bằng kỹ thuật PCR phát 47 ca dương tính với PCV2 tổng số 57 heo khảo sát chiếm tỷ lệ 82,4 % Tỷ lệ dương tính với PCV2 theo biểu lâm sàng: 29/31 heo có biểu còi cọc, 3/5 heo có biểu viêm da; 15/21 heo bình thường Tỷ lệ dương tính theo hạng heo: 22/24 heo cai sữa, 21/26 heo thịt, 3/7 heo nái Tỷ lệ dương tính loại mẫu khảo sát: 12 ca dương tính với PCV2 12 mẫu hạch, 16 ca dương tính 25 mẫu huyết 27 ca dương tính 35 mẫu phân Xây dựng sinh dòng từ chủng PCV2 phân lập từ trại heo địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh trại heo Đồng Nai với 23 chủng PCV từ ngân hàng gene Có thể sử dụng kỹ thuật PCR phát PCV2 từ mẫu máu mẫu phân thu nhận heo sống mà khơng phải giết mổ, mẫu phân mẫu tốt dùng để chẩn đốn PCV2 Hiện chưa có biến đổi nhiều cấu trúc di truyền chủng PCV2 Việt Nam giới ii SUMARY The thesis title "Detection of Porcine circovirus infection type on the serum, ganglion and feces from pigs with PCR technology" aims to early diagnosis PCV2 Topic was including three content: detected PCV2 by PCR technique from the different samples; sequence analysis of PCV2 obtained and build phylogenetic tree By PCR technique detected 47/57 case positive with PCV2 proportion of 82.4% The rate of pigs positive for PCV2 with the clinical symptoms: 29/31 stunted pig, 3/5 dermatitis pig; 15/21 normal pig The rate of positive pigs in group: 22/24 weaned pigs; 21/26 pig meat; 3/7 sows Positive rate on the survey samples: 12/12 ganglions samples, 17/25 serum samples, and 27/35 feces samples positive for PCV2 Phylogenetic tree was build with two strains of PCV2 obtained from farms in Ho Chi Minh City and one strain of PCV2 obtained from farm of Dong Nai province in comparing with 23 PCV2 isolation from gene bank the PCR technique could detect easily PCV2 from serum or feces samples collected on alive pig There are not much of change in genetic between PCV2 strains in Viet Nam and on the world iii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMARY iii DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu hội chứng còi cọc heo sau cai sữa 2.1.1 Dịch tễ học .4 2.1.2 Cơ chế sinh bệnh 2.1.3 Triệu chứng bệnh tích 2.1.3.1 Triệu chứng .5 2.3.3.2 Bệnh tích 2.2 Porcine circovirus 2.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất .7 2.2.2 Cấu trúc gen PCV .8 2.3 Chẩn đoán 10 2.5 Một số cơng trình nghiên cứu chẩn đốn PCV2 ngồi nước .13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm: 15 3.2 Đối tượng khảo sát số lượng mẫu: 15 3.3 Vật liệu dụng cụ .16 3.3.1 Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 16 3.3.2 Vật liệu hoá chất cho chiết tách DNA PCR .16 3.3.3 Vật liệu cho phản ứng PCR 17 iv 3.3.4 Vật liệu hoá chất cho điện di sản phẩm PCR 19 3.4 Các bước tiến hành .19 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu 19 3.4.1.1 Thu nhận xử lý mẫu huyết thanh: .19 3.4.1.2 Thu nhận xử lý mẫu hạch 20 3.4.1.3 Thu nhận xử lý mẫu phân 21 3.5.2 Thực phản ứng PCR 22 3.4.2.1 Thực phản ứng PCR máy luân nhiệt với thông số sau 23 3.4.2.2 Điện di sản phẩm 23 3.5 Phân tích trình tự gene PCV2 .24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phát PCV2 phương pháp PCR 26 4.2 Tỷ lệ heo dương tình với PCV2 theo biểu lâm sàng 28 4.3 Tỷ lệ nhiễm PCV2 nhóm heo 29 4.4 Kết phát PCV2 loại mẫu: mẫu hạch, huyết phân 30 4.5 Giải trình tự xây dựng sinh dòng PCV2 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .35 5.1 Kết luận .35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC v DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PMWS Post - Weaning Multisystemic Wasting Syndrome PCV1 Porcine circovirus type PCV2 Porcine circovirus type PPV Porcine parpovirus dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate DN Đồng Nai Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh PRRSV Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus PCR Polymerase chain reaction AHL Animal Health Laboratory DNA Deoxyribonucleic acid ORF Open reading frames RF Double- stranded Replicate Form IIP Indirect immunoperoxidase IFA Indirect Immunoflourescence assay ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ICC Immunocytochemistry ISH In situ hybridization CTV Cộng tác viên CS Cộng vi DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.2 Virion PCV Hình 2.3 So sánh cấu trúc steem-loop PCV1 PCV2 Hình 2.4 Cấu trúc gen PCV2 với khung đọc mở Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng PCR 12 Hình 3.1 Kết align primer F PCV1 17 Hình 3.2 Kết align primer R PCV1 17 Hình 3.3 Kết align primer F PCV2 18 Hình 3.4 Kết align Primer R PCV2 18 Hình 4.1 Heo còi dương tính với PCV2 26 Hình 4.3 Heo bị viêm da nặng sau mang tai 27 Hình 4.4 Kết phát PCV 27 Hình 4.5 Kết align trình tự PCV2 32 Hình 4.6 Cây sinh dòng PCV2 33 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số lượng mẫu 15 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 23 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng 4.1 Tỷ lệ heo dương tính PCV2 theo biểu lâm sàng .28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PCV2 theo nhóm heo 29 Bảng 4.3 Kết phát PCV2 mẫu 30 Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính PCV2 loại mẫu 31 viii p=0.618 (phụ lục 3) Như vậy, khả phát PCV2 heo còi cao nhất, triệu chứng heo còi cọc dấu hiệu đặc trưng để chẩn đốn PCV2 Tuy nhiên, khác biệt có ý ngĩa tỷ lệ dương tính PCV2 heo còi tỷ lệ heo dương tính với PCV2 từ heo có biểu viêm da heo chưa có biểu bệnh cao Do chẩn đốn PCV2 khơng đơn heo còi cọc, heo chưa có biểu bệnh PMWS hay heo có biểu viêm da bị nhiễm PCV2 4.3 Tỷ lệ nhiễm PCV2 nhóm heo Trong số 57 heo khảo sát chia làm nhóm : heo cai sữa, heo thịt, heo nái Tỷ lệ dương tính với PCV2 thị bảng Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PCV2 theo nhóm heo Nhóm heo Tỷ lệ dương tính Heo cai sữa Heo thịt Heo nái Dương tính 22 21 Âm tính Tổng 24 26 80,7% (x) 42,8 % (y) Tỷ lệ dương tính 91,6 % (x) Kí hiệu thống kê: (x) khác biệt khơng có ý nghĩa nhóm heo cai sữa heo thịt; (y) Sự khác biệt có ý nghĩa nhóm heo cai sữa, heo thịt với nhóm heo nái Qua nhiều nghiên cứu (Lâm Thị Thu Hương cs 2005, Eliss cs năm 1998…) cho thấy PCV2 xác định gây nhiễm nhiều heo cai sữa sau cai sữa từ – 16 tuần tuổi Kết nghiên cứu đạt phù hợp với nghiên cứu trên, tỷ lệ heo cai sữa dương tính với PCV2 cao (91,6%) Tuy nhiên nghiên cứu nhận thấy tỷ lệ nhiễm PCV2 đàn heo thịt cao Qua phân tích thống kê sử dụng trắc nghiệm χ2 khơng thấy có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học nhóm heo cai sữa với nhóm heo thịt (p= 0,267) (phụ lục 4) 29 có khác biệt có ý ngĩa nhóm heo cai sữa với heo nái (p=0,028) (phụ lục 5), nhóm heo thịt nhóm heo nái với p= 0,045 (phụ lục 6) Như PCV2 gây nhiễm nhiều lứa tuổi heo không riêng heo cai sữa, ảnh hưởng đàn heo ngày lan rộng việc phòng chống PCV2 vấn đề cấp thiết Mặc dù tỷ lệ dương tính PCV2 heo nái khơng cao so với hai nhóm heo lại nghiên cứu phát heo khảo sát Heo nái xem nguồn lưu trữ PCV2 nên heo dễ bị nhiễm PCV2 sớm tiếp xúc với virus Do việc phát PCV2 heo mẹ quan trọng để có biện pháp hạn chế lây nhiễm PCV2 từ heo mẹ sang heo 4.4 Kết phát PCV2 loại mẫu: mẫu hạch, huyết phân Các mẫu thu nhận để chẩn đoán PCV2 gồm: 25 mẫu huyết 35 mẫu phân thu nhận heo sống, 12 mẫu hạch thu nhận từ heo qua giết mổ Bảng 4.3 Kết phát PCV2 mẫu Loại mẫu Mẫu hạch Mẫu huyết Mẫu phân Kết Dương tính 12 17 27 Tổng số mẫu 12 25 35 68 % (m) 77% (n) Tỉ lệ % dương tính 100 % (m) Kí hiệu thống kê: (m): khác biệt khơng có ý nghĩa mẫu hạch mẫu phâ); (n):Sự khác biệt có ý nghĩa mẫu hạch mẫu huyết Trong số 12 mẫu hạch khảo sát cho kết dương tính 100 %, kết phù hợp với nghiên cứu trước mà mẫu hạch xác định có khả phát PCV2 cao Điều đặc biệt 12 heo còi dương tính với virus PCV2 xét nghiệm trước mẫu phổi cho thấy chúng nhiễm virus PRRSV Như trường hợp heo bị đồng nhiễm PCV2 PRRSV phổ biến Cả virus kết hợp gây bệnh làm cho bệnh ngày trầm trọng heo Do việc tiêm 30 phòng vaccine PRRSV sống cần lưu ý tiêm heo nhiễm PCV2 để tránh tình trạng kết hợp gây bệnh chủng virus Kết khảo sát PCV2 mẫu phân mẫu huyết cho kết cao, với 77% dương tính mẫu phân 68% dương tính mẫu huyết Kết phân tích thống kê sử dụng trắc nghiệm χ2 cho thấy khác biệt tỷ lệ dương tính PCV2 mẫu hạch mẫu phân khơng có ý nghĩa P = 0,069 ( phụ lục 7) Tuy nhiên, có khác biệt có ý nghĩa tỷ lệ dương tính mẫu hạch so với mẫu huyết p= 0,0268 (phụ lục 8) Trong nghiên cứu A Caprioli ctv, 2006 số heo gây nhiễm thực nghiệm với PCV2, tác giả sử dụng PCR phát PCV2 loại mẫu hạch, phân máu Kết phân tích thống kê tác giả so sánh tỷ lệ dương tính với PCV2 loại mẫu (P = 0,332) khác biệt tỷ lệ dương tính PCV2 mẫu khơng có ý nghĩa, khả phát PCV2 loại mẫu Sử dụng mẫu hạch để chẩn đốn sớm PCV2 khơng phù hợp heo chưa có biểu bệnh nhiễm PCV2 thu nhận mẫu hạch khó khăn phải qua giết mổ thu nhận được, tỷ lệ phát PCV2 loại mẫu cao Hai loại mẫu: huyết phân dễ thu nhận thích hợp dùng để chẩn đốn PCV2 gây bệnh heo heo chưa có biểu bệnh lâm sàng Với mục đích tìm loại mẫu thích hợp nhât cho chẩn đốn PCV2 chúng tơi sử dụng 11 mẫu huyết phân heo để đánh giá khả phát PCV2 loại mẫu Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính PCV2 loại mẫu Loại mẫu Mẫu huyết Mẫu phân Tỷ lệ dương tính Dương tính Âm tính Sai biệt thống kê P= 0,169 Tổng số mẫu 11 11 Tỷ lệ dương tính 54,5% 81,8% 31 Kết phân tích thống kê p=0,169 (phụ lục 9) cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa tỷ lệ dương tính với PCV2 loại mẫu, nghĩa loại mẫu thích hợp việc chẩn đốn PCV2 Trong nghiên cứu A Caprioli ctv, 2006 cho biết tỷ lệ heo dương tính với PCV2 tăng lên từ – 21 ngày sau gây nhiễm mẫu hạch mẫu phân, mẫu máu từ 12 – 21 ngày sau gây nhiễm, trước 12 ngày không phát PCV2 Tuy nhiên lấy mẫu huyết chẩn đốn gây thương tổn cho heo, mặt khác tỷ lệ dương tính với PCV2 mẫu phân cao mẫu huyết nhiều 81,8 % so với 54,5 %, kết phân tích thống kê cho thấy có khác biệt có ý ngĩa so sánh tỷ lệ heo dương tính mẫu hạch mẫu huyết heo thu nhận mẫu chẩn đốn, chúng tơi phát PCV2 mẫu phân hạch mà không phát mẫu huyết Vì mẫu phân có nhiều thuận lợi việc phát PCV2 việc ly trích DNA virus mẫu huyết thực dễ dàng 4.5 Giải trình tự xây dựng sinh dòng PCV2 Để khẳng định kết chạy PCR phát cính xác PCV2, tơi tiến hành giải trình tự chủng PCV2 phát được: PL1 19M phát trại heo địa bàn TP HCM chủng T2P trại heo Trảng Bom - ĐN Hình 4.5 Kết align trình tự PCV2 32 Kết align trình tự chủng PCV2 xác định so với số chủng PCV2 phân lập giới cho thấy: chủng virus 19M, PL1 T2P phát kĩ thuật PCR PCV2 Từ tơi tiến hành xây dựng sinh dòng dựa chủng xác định trình tự gene 23 chủng PCV2 lấy từ ngân hàng gene Cây sinh dòng xây dựng khung đọc mở ORF2 Khung đọc mở ORF2 mã hóa protein vỏ capsid bao bọc virus protein đa dạng phức tạp nhất, sử dụng nhiều chẩn đoán PCV2 sử dụng phần mềm phân tích trình tự MEGA4.1, phương pháp neighbor-joining, tỷ số Ts/Tv 5.096, giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần Hình 4.6 Cây sinh dòng PCV2 Cây sinh dòng xây dựng chia làm nhánh PCV1 PCV2 Cả chủng virus xác định thuộc vào nhóm nhánh PCV2 Trong 19M PL1 có tới 99,6 % trình tự nucleotide tương đồng với xếp vào nhóm nhánh PCV2, phân nhóm 2.2 Mặc dù tương đồng cao 93,5% so với chủng PCV2 nhóm lại chủng PCV2 thu nhận xếp thành 33 nhóm riêng chủng PCV2 Đồng Nai khơng nằm nhóm với chủng TP Hồ Chí Minh (94,6 – 95 % trình tự Nu tương đồng) Điều cho thấy nhiều khuynh hướng biến đổi, khác biệt trình tự nu chủng PCV2 phân lập Việt Nam so với giới chủng PCV2 phân lập địa bàn khác Việt Nam Việc phân tích cấu trúc di truyền PCV2 biến đổi cần nghiên cứu sâu rộng khung đọc mở vùng khác Việt Nam, để hiểu rõ chế gây bệnh PCV2 từ có cách phòng chống hiệu 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ƒ Tỷ lệ dương tính PCV2 mẫu khảo sát cao, chiếm 82,4 % tổng số 57 heo khảo sát Trên heo khơng có biểu bệnh cho kết dương tính với PCV2 cao (71,4%) cho thấy PCV2 lây lan rộng đàn heo Việt Nam ƒ Các loại mẫu: huyết thanh, hạch, phân sử dụng chẩn đốn PCV2 cho kết dương tính cao, mẫu hạch cao (100 %), mẫu huyết cho kết thấp mẫu lại (68 %), mẫu phân (77 % ) Việc thu nhận mẫu phân dễ không gây tổn hại đến heo nên mẫu phân thích hợp chẩn đoán phát sớm PCV2 ƒ PCV2 lây nhiễm nhiều hạng heo Tỷ lệ heo cai sữa dương tính với PCV2 91,6 %, heo thịt 80,7 % heo nái 42,8 % Phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa tỷ lệ ƒ Các chủng PCV2 thu nhận thuộc phân nhóm PCV2-2.2 Tỷ lệ tương đồng chủng PCV2 thu nhận chủng PCV2 giới khoảng 93,5 – 98 % 5.2 Đề nghị • Sử dụng mẫu phân dùng kỹ thuật PCR xét nghiệm phát PCV2 gây bệnh heo • Phân tích di truyền với nhiều chủng thực địa với đoạn gene có kích thước dài để có thơng tin xác virus PCV2 gây bệnh Việt Nam 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Lê Tiến Dũng 2007 Phát Porcine circovirus type kĩ thuật PCR phân lập định danh số vi khuẩn gây bệnh hô hấp heo nghi mắc hội chứng còi cọc sau cai sữa Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái niệm - Phương pháp - Ứng dụng) Tái lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Lâm Thị Thu Hương, Đường Chi Mai Trần Hoàng Vũ 2005 Bước đầu ghi nhận diện Porcine circovirus type heo biểu còi số trại heo cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh vùng phụ cận Tiếng Anh A Caprioli , F McNeilly , I McNair , P Lagan-Tregaskis , J Ellis , S Krakowka , J McKillen , F Ostanello anh G Allan 2006 PCR detection of porcine circovirus type (PCV2) DNA in blood, tonsillar and faecal swabs from experimentally infected pigs Andrel Hamel, Lihual Lin, And Gopip Nayar 1998 Nucleotide Sequence of Porcine Circovirus Associated with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in Pigs Dominique Mahé, Philippe Blanchard, Catherine Truong, Claire Arnauld, Pierre Le Cann, Roland Cariolet, Franỗois Madec, Emmanuel Albina and Andrộ Jestin 2000 Differential recognition of ORF2 protein from type and type porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes Journal of General Virology (2000), 81, 1815-1824 36 Gordon M Allan, John A Ellis Porcine circoviruses: a review J Vet Diagn Invest 12:3–14 (2000) John Ellis et al.1999 Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets J Vet Diagn Invest 11:3–14 (1999) 10 Kwang Soo Lyoo, Hyeun Bum Kim and Han Soo Joo 2009 Evaluation of a nested polymerase chain reaction assay to differentiate between two genotypes of Porcine circovirus-2 Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Vol 20 Issue 3, 283-288 11 Krakowka S, Ellis, J Meehan, B., Kennedy, S., Mc Neilly, F., Allan and G.M 2000 Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of PMWS in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus-2 (PCV-2) and porcine parvovirus (PPV) Veterinary Pathology 37, 254–263 12 Krakowka S, Ellis JA, McNeilly F, Ringler S, Rings DM and Allan G 2001 Activationof the immune system is the pivotal event in the reproduction of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2) Vet Path 2001, 38:31-42 13 Krakowka S, Ellis J, McNeilly F, Waldner C and Allan G 2005 Features of porcine circovirus-2 disease: Correlations between lesions, amount and distribution of virus, and clinical outcomes J Vet Diagn Invest 2005;17:213–222 14 Kawashima K, Tsunemitsu H, Horino R, et al 2003 Effects of dexamethasone on the pathogenesis of porcine circovirus type infection in piglets J Comp Pathol 129:294–302 15 15 Kim J, Chung HK, Jung T et al 2002 Postweaning multisystemic wasting syndrome of pigs in Korea: prevalence, microscopic lesions and coexisting microorganisms J Vet Med Sci 64:57–62 16 Mankertz, A., Mankertz, J., Wolf, K and Buhk, H J 1998a Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus Journal of General Virology 79, 381-384 37 17 Maria Calsamiglia, Joaquim Segalés, Josefina Quintana,2 Carles Rosell and Mariano Domingo Detection of Porcine Circovirus Types and in Serum and Tissue Samples of Pigs with and without Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome 18 Mandrioli L, Sarli G, Panarese S, Baldoni S and Marcato PS 2004 Apoptosis and proliferative activity in lymph node reaction in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) VetImmunol Immunopathol 2004, 97:2537 19 Porntippa Nawagitgul, Igor Morozov, Steven R Bolin, Perry A Harms, Steven D Sorden and Prem S Paul 2000 Open reading frame of porcine circovirus type encodes a major capsid protein J Gen Virol 2000 81: 2281-2287 20 R Larochelle , M Antaya , M Morin and R Magar 1999 Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR Journal of Virological Methods 80 (1999) 69–75 21 Susy Carman.et al 2007 The emergence of a new strain of porcine circovirus-2 in Ontario and Quebec swine and its association with severe porcine circovirus associated disease 2004 - 2006 The Canadian Journal of Veterinary Research 2008;72:259–268 38 PHỤ LỤC • Phụ lục 1: Kết phân tích thống kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo còi heo viêm da Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 4.90645 0.0267566 2.09758 0.147532 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.00000 0.00000 0.00000 Uncertainty Coeff 0.13133 0.12251 0.14152 Somer's D 0.36749 0.40625 0.33548 • Phụ lục 2: Kết phân tích thống kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo còi heo bình thường Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 4.70549 0.0300665 3.15968 0.0754778 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.13793 0.19048 0.00000 Uncertainty Coeff 0.08172 0.06687 0.10506 Somer's D 0.28714 0.40909 0.22120 • Phụ lục 3: Kết phân tích thống kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo viêm da heo bình thường Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 0.247619 0.618757 0.00000 1.00000 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.00000 0.00000 0.00000 Uncertainty Coeff 0.00831 0.00939 0.00745 Somer's D -0.09639 -0.08333 -0.11429 • Phụ lục 4: Kết phân tích thống kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo cs heo thịt Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 1.23094 0.267224 0.492216 0.482940 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.03226 0.04167 0.00000 Uncertainty Coeff 0.02318 0.01837 0.03140 Somer's D 0.14703 0.22591 0.10897 • Phụ lục 5: Kết phân tích thống kê kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo cs heo nái Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 4.77491 0.0288774 2.56382 0.109334 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.08333 0.14286 0.00000 Uncertainty Coeff 0.13429 0.12268 0.14833 Somer's D 0.38926 0.44615 0.34524 • Phụ lục Kết phân tích thống kê kê tỷ lệ dương tính với PCV2 heo thịt heo nái Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 3.99657 0.0455931 2.31370 0.128238 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.06250 0.00000 0.11111 Uncertainty Coeff 0.10045 0.10718 0.09452 Somer's D 0.34673 0.31944 0.37912 • Phụ lục 7: Kết phân tích thống kê kê tỷ lệ dương tính với PCV2 mẫu huyết hạch Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 3.30549 0.0690486 1.88525 0.169738 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.00000 0.00000 0.00000 Uncertainty Coeff 0.10919 0.09844 0.12258 Somer's D 0.26230 0.30769 0.22857 • Phụ lục 8: Kết phân tích thống kê kê tỷ lệ dương tính với PCV2 mẫu phân hạch Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 4.89931 0.0268674 3.19298 0.0739552 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.00000 0.00000 0.00000 Uncertainty Coeff 0.17101 0.15635 0.18870 Somer's D 0.36090 0.41379 0.32000 • Phụ lục 9: Kết phân tích thống kê kê tỷ lệ dương tính với PCV2 mẫu phân huyết Summary Statistics for Contingency Tables -Chi-square D.F Significance 1.88571 0.169686 0.838095 0.359942 with Yates correction WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.16667 0.27273 0.00000 Uncertainty Coeff 0.06661 0.06336 0.07021 ... lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thi u trình tự DNA, đặc biệt... ctv(1998) thi t kế mồi cho kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng virus PCV2 có kích thước 361bp Ellis ctv (1998) nghiên cứu thành công kỹ thuật PCR phát PCV2 đoạn mồi tác giả thi t kế khuếch... are not much of change in genetic between PCV2 strains in Viet Nam and on the world iii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMARY iii DÁCH SÁCH CÁC