KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ THUẬT PCR

Đề tài được tiến hành gồm ba nội dung: phát hiện PCV2 bằng kỹ thuật PCR từ các loại mẫu khác nhau; phân tích trình tự của PCV2 thu nhận được và tiến hành xây dựng cây sinh dòng.. Từ nhữn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ NHIỄM PCV2 TRÊN CÁC LOẠI MẪU: HUYẾT THANH, HẠCH VÀ PHÂN TỪ HEO CÒI BẰNG KĨ

THUẬT PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên con xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập

Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Kỹ sư Võ Khánh Hưng, chị Bùi Thị Kim Hằng đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Tập thể lớp Công nghệ Sinh học khóa 32 và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2010

Phạm Thị Huyền Trang

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát sự nhiễm Porcine circovirus type 2 trên các mẫu : huyết thanh,

hạch, phân từ heo còi bằng kĩ thuật PCR” được thực hiện nhằm mục đích tìm ra phương hướng chẩn đoán sớm PCV2

Đề tài được tiến hành gồm ba nội dung: phát hiện PCV2 bằng kỹ thuật PCR từ các loại mẫu khác nhau; phân tích trình tự của PCV2 thu nhận được và tiến hành xây dựng cây sinh dòng

Bằng kỹ thuật PCR phát hiện được 47 ca dương tính với PCV2 trên tổng số 57 heo được khảo sát chiếm tỷ lệ 82,4 %

Tỷ lệ dương tính với PCV2 theo biểu hiện lâm sàng: 29/31 heo có biểu hiện còi cọc, 3/5 heo có biểu hiện viêm da; 15/21 heo bình thường

Tỷ lệ dương tính theo hạng heo: 22/24 heo cai sữa, 21/26 heo thịt, 3/7 heo nái

Tỷ lệ dương tính trên các loại mẫu khảo sát: 12 ca dương tính với PCV2 trên 12 mẫu hạch, 16 ca dương tính trên 25 mẫu huyết thanh và 27 ca dương tính trên 35 mẫu phân

Xây dựng được cây sinh dòng từ 3 chủng PCV2 phân lập từ 2 trại heo trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh và 1 trại heo tại Đồng Nai cùng với 23 chủng PCV từ ngân hàng gene

Có thể sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện PCV2 từ mẫu máu hoặc mẫu phân thu nhận trên heo còn sống mà không phải giết mổ, trong đó mẫu phân là mẫu tốt nhất dùng để chẩn đoán PCV2 Hiện tại chưa có sự biến đổi nhiều về cấu trúc di truyền giữa các chủng PCV2 tại Việt Nam và thế giới

SUMARY

The thesis title "Detection of Porcine circovirus infection type 2 on the serum, ganglion and feces from pigs with PCR technology" aims to early diagnosis PCV2 Topic was including three content: detected PCV2 by PCR technique from the different samples; sequence analysis of PCV2 obtained and build phylogenetic tree

By PCR technique detected 47/57 case positive with PCV2 proportion of 82.4% The rate of pigs positive for PCV2 with the clinical symptoms: 29/31 stunted pig, 3/5 dermatitis pig; 15/21 normal pig

The rate of positive pigs in group: 22/24 weaned pigs; 21/26 pig meat; 3/7 sows Positive rate on the survey samples: 12/12 ganglions samples, 17/25 serum samples, and 27/35 feces samples positive for PCV2

Phylogenetic tree was build with two strains of PCV2 obtained from 2 farms in

Ho Chi Minh City and one strain of PCV2 obtained from 1 farm of Dong Nai province

in comparing with 23 PCV2 isolation from gene bank

the PCR technique could detect easily PCV2 from serum or feces samples collected on alive pig There are not much of change in genetic between PCV2 strains

in Viet Nam and on the world

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMARY iii

DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa 3

2.1.1 Dịch tễ học 4

2.1.2 Cơ chế sinh bệnh 5

2.1.3 Triệu chứng và bệnh tích 5

2.1.3.1 Triệu chứng 5

2.3.3.2 Bệnh tích 6

2.2 Porcine circovirus 7

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất 7

2.2.2 Cấu trúc bộ gen của PCV 8

2.3 Chẩn đoán 10

2.5 Một số công trình nghiên cứu chẩn đoán PCV2 trong và ngoài nước 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm: 15

3.2 Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu: 15

3.3 Vật liệu và dụng cụ 16

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 16

3.3.2 Vật liệu và hoá chất cho chiết tách DNA và PCR 16

3.3.4 Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm PCR 19

3.4 Các bước tiến hành 19

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu 19

3.4.1.1 Thu nhận và xử lý mẫu huyết thanh: 19

3.4.1.2 Thu nhận và xử lý mẫu hạch 20

3.4.1.3 Thu nhận và xử lý mẫu phân 21

3.5.2 Thực hiện phản ứng PCR 22

3.4.2.1 Thực hiện phản ứng PCR bằng máy luân nhiệt với các thông số sau 23

3.4.2.2 Điện di sản phẩm 23

3.5 Phân tích trình tự gene PCV2 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả phát hiện PCV2 bằng phương pháp PCR 26

4.2 Tỷ lệ heo dương tình với PCV2 theo biểu hiện lâm sàng 28

4.3 Tỷ lệ nhiễm PCV2 trên các nhóm heo 29

4.4 Kết quả phát hiện PCV2 trên 3 loại mẫu: mẫu hạch, huyết thanh và phân 30

4.5 Giải trình tự và xây dựng cây sinh dòng PCV2 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DÁCH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.2 Virion của PCV 7

Hình 2.3 So sánh cấu trúc steem-loop của PCV1 và PCV2 9

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của PCV2 với 6 khung đọc mở 9

Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng PCR 12

Hình 3.1 Kết quả align primer F của PCV1 17

Hình 3.2 Kết quả align primer R của PCV1 17

Hình 3.3 Kết quả align primer F của PCV2 18

Hình 3.4 Kết quả align Primer R của PCV2 18

Hình 4.1 Heo còi dương tính với PCV2 26

Hình 4.3 Heo bị viêm da nặng nhất là ở sau mang tai 27

Hình 4.4 Kết quả phát hiện PCV 27

Hình 4.5 Kết quả align trình tự PCV2 32

Hình 4.6 Cây sinh dòng PCV2 33

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số lượng mẫu 15

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 23

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 23

Bảng 4.1 Tỷ lệ heo dương tính PCV2 theo biểu hiện lâm sàng 28

Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PCV2 theo nhóm heo 29

Bảng 4.3 Kết quả phát hiện PCV2 trên các mẫu 30

Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính PCV2 trên 2 loại mẫu 31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam trong những năm gần đây, các nhà chăn nuôi heo nước ta luôn phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc phòng và chữa trị bệnh trên heo Trong đó, hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome - PMWS) mới được phát hiện gần đây đã gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng Đây là một bệnh truyền nhiễm do virus gây ra trên heo sau cai sữa Mặc dù căn bệnh diễn biến chậm nhưng tăng dần lên với mức độ nguy hại cao

Virus gây bệnh PMWS là một DNA virus chuỗi đơn, thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus thường được gọi là porcine circovirus (PCV) Khi nghiên cứu về

PCV người ta nhận thấy có đến 2 loại PCV: PCV1 và PCV2 PCV1 xuất hiện đã lâu và không gây bệnh trên heo PCV2 mới xuất hiện gần đây và gắn liền với bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Ngày nay có rất nhiều phương pháp để chẩn đoán PCV2, trong đó kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi nhất nhờ ưu điểm chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ chính xác cao Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán và khảo sát tình hình nhiễm PCV2 Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu khảo sát trên mẫu mô do đó việc thu nhận mẫu rất khó khăn đòi hỏi phải giết mổ heo bệnh Dịch bệnh do PCV2 gây ra ngày càng lan rộng và gây thiệt hại kinh tế trầm trọng Việc xác định nhanh, sớm và chính xác sự hiện diện của virus khi heo mới có biểu hiện bệnh lâm sàng có tầm quan trọng rất lớn, là cơ sở cho công tác phòng trị bệnh và các nghiên cứu về sau

Từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Khảo sát sự nhiễm

PCV2 trên các loại mẫu: máu, hạch, phân từ heo còi bằng kĩ thuật PCR”.

1.2 Yêu cầu của đề tài

Ghi nhận một số biểu hiện bệnh lâm sàng và bệnh tích trên heo được chọn lấy mẫu

Thu nhận được mẫu tốt dùng cho chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR xác định sự hiện diện của virus trên 3 loại mẫu máu, hạch, phân

Xác định tỉ lệ nhiễm PCV2 giữa các mẫu

1.3 Nội dung thực hiện

Ghi nhận một số biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo được chọn lấy mẫu Ứng dụng kĩ thuật PCR phát hiện PCV2 trên các loại mẫu thu nhận được: máu, hạch, phân

Phân tích trình tự bộ gen của chủng PCV2 phân lập được và so sánh với trình tự

gene của các chủng PCV2 phân lập được trên thế giới

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa

PMWS (Post - Weaning Multisystemic Wasting Syndrome) đã trở thành một vấn

đề nhận được nhiều sự quan tâm trên thế giới trong những năm qua, đặc biệt là tại Canada, Mỹ, Châu Âu và Châu Á Hội chứng gầy còm trên heo con sau cai sữa (PMWS) được ghi nhận lần đầu tiên trên một đàn heo ở Canada vào năm 1991 Trên đàn heo này, một số heo sau cai sữa khoảng hai tuần bắt đầu có biểu hiện còi cọc và không có đáp ứng tốt với việc điều trị Cho đến nay, bệnh được phát hiện trên nhiều đàn heo ở Mĩ, nhiều nước Châu Âu, Châu Á và đã gây thiệt hại kinh tế rất lớn trong ngành chăn nuôi heo công nghiệp ở những nước này

Hội chứng PMWS thường xuất hiện ở heo lứa tuổi từ 6 đến 18 tuần tuổi, tỉ lệ chết có thể đến 30% ở một số đàn heo Bệnh xuất hiện với những triệu chứng điển hình như gầy còm nhanh, thở khó, tiêu chảy thỉnh thoảng có một số heo bị vàng da, nhạt màu…

Nguyên nhân gây ra bệnh là do một loại virus có tên là porcine circovirus type 2

gọi tắt là PCV2: một loại virus DNA chuỗi đơn, vòng, không có vỏ bọc, thuộc họ

Circoviridae Virus này mới được phân lập vào năm 1997 Virus PCV2 được xem là

yếu tố tiền phát gây suy yếu hệ miễn dịch làm heo dễ bị nhiễm kế phát một số mầm bệnh khác và làm triệu chứng trầm trọng hơn

PMWS gây thiệt hại kinh tế đáng kể và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn heo trong ngành chăn nuôi heo công nghiệp của nhiều quốc gia

Trong một cáo cáo gần đây của susy carman năm 2007 về ảnh hưởng của PCV2 gây bệnh PMWS trên heo cho thấy tốc độ lây lan của bệnh tăng lên đáng kể từ năm

2004 – 2006

Hình 2.1 Tổng số trường hợp bệnh do PCV2 và tỉ lệ phần trăm tương ứng trong

tổng số các trường hợp heo bệnh được gởi về AHL từ năm 1998 đến năm 2006 (nguồn Susy Carman, 2007)

Các nước Châu Âu có trên 8 triệu heo mắc hội chứng này mỗi năm và thiệt hại

do PMWS được ước tính từ 562 - 900 triệu EURO hàng năm

PMWS có chiều hướng lây lan rộng trên khắp thế giới nhưng những hiểu biết về bệnh vẫn còn hạn chế, vì thế các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu và tìm cách khống chế căn bệnh này

1 ngày tuổi với PCV2, acid nucleic của virus đã được phát hiện trong phân, nước bọt

và nước mắt của heo sau 31 ngày gây nhiễm (Ellis và cs, 2000)

PCV2 có thể lây truyền ngang hoặc dọc theo các đường hô hấp, đường máu, nhau thai và đường sinh dục Bệnh chủ yếu lây truyền từ heo bệnh sang heo khỏe qua phân, qua tiếp xúc trực tiếp, mật độ chăn nuôi cao, stress… PCV2 có thể lan truyền giữa các đàn khi chuyển heo từ đàn này sang đàn khác hoặc thông qua những động vật trung gian mang mầm bệnh như chuột, chim…

Ngoài ra PCV2 có trong tinh dịch của những nọc bị nhiễm bệnh có thể lây truyền virus qua giao phối (Kim và ctv, 2002)

2.1.2 Cơ chế sinh bệnh

Hiện nay cơ chế gây bệnh của PCV2 chưa được hiểu rõ , sau khi gây bệnh thực nghiệm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch, người ta nhận thấy có sự hiện diện virus trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào ở phổi, hạch hạnh nhân, lách, hạch lympho và những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch

Khi virus xâm nhập vào cơ thể, trong những ngày đầu virus có thể sinh sản không kiểm soát trong tế bào miễn dịch sơ khai, sự sinh sản nhanh chóng của virus phá hủy nhanh chóng hệ thống miễn dịch của heo con, do đó heo trở nên nhạy cảm hơn với các tác nhân gây bệnh khác Trong một nghiên cứu về sự đồng nhiễm của PCV2 (S Krakowka, 2001) cho thấy khi nhiễm thứ cấp PCV2 với một số loại virus

khác như: porcine parpovirus (PPV), PRRSV thì biểu hiện bệnh PMWS điển hình

hơn và bệnh xảy ra trầm trọng hơn so với khi heo nhiễm một mình PCV2

PCV2 được xem như yếu tố mở đường cho những virus và vi khuẩn khác xâm nhiễm và gây bệnh Tuy nhiên biểu hiện bệnh phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của heo

chảy (30 %), thở khó do viêm phổi kẽ Một số con có triệu chứng thần kinh Tỷ lệ heo bệnh trong đàn có thể từ 3-50% và tỉ lệ chết có thể lên đến 80% trong số những heo bị nhiễm bệnh

PWMS đồng nhiễm với hội chứng viêm da, bệnh thận ở heo (Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome - PDNS) gây chết đột ngột (tỷ lệ chết 6 – 10 %) trên đàn heo bệnh Bệnh biểu hiện qua viêm vành tai, viêm da phía sau đùi, nặng hơn viêm da

toàn thân (giống triệu chứng viêm da tiết dịch do nhiễm Staphylococcus), bệnh có thể

kéo dài nhiều tháng trong đàn, từ nhóm này sang nhóm khác Điều trị hiệu quả không cao

2.3.3.2 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể: Bệnh tích đại thể chủ yếu là tổn thương mô nhất là mô bạch

huyết và mô phổi Lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to Phổi bị xơ, cứng, dai, nặng, không bị xẹp khi bóp mạnh Lách cũng sưng lớn nhưng không sung huyết Vùng nối thực quản với dạ dày bị loét, vách dạ dày sưng, ruột viêm, thành ruột mỏng Ngoài ra bệnh tích viêm gan, thận sưng lớn đồng thời phù thủng cũng có thể được tìm thấy

“Heo nái nhiễm PCV2 có thể bị sẩy thai, thai khô, heo con chết khi sinh và bị viêm cơ tim nặng” (dẫn liệu Lâm Tiến Dũng, 2003)

Bệnh tích vi thể: Bệnh tích đặc trưng tại các cơ quan lympho là sự suy giảm tế

bào lympno Đại thực bào nhiều nhân thường xuất hiện, đặc biệt là tại mảng Peyer’s và hạch bạch huyết Thể vùi trong bào tương và lympho bào hoại tử cũng hiện diện ở mảng Peyer’s và hạch hạnh nhân (Lâm Thị Thu Hương và cộng sự, 2005)

Xét nghiệm mô học thường thấy viêm phổi kẽ,u mô bào lympho Phổi bị bong tróc một phần hay toàn phần với sự hiện diện của những tế bào biểu mô xơ hóa, xuất hiện tế bào có nhiều nhân khổng lồ, suy giảm hạch bạch huyết và sự xuất hiện của kháng thể chống PCV2 trong cơ quan đại thực bào của tế bào chất Một số biến đổi khác xảy ra trong gan và thận (Susy Carman và ctv, 2007)

2.2 Porcine circovirus

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất

PCV được xác định vào năm 1970 là một virus không gây bệnh tích tế bào khi gây nhiễm trên môi trường tế bào thận heo ( PK15 – pig kidny cell line 15) Cùng với virus gây bệnh thiếu máu gà và virus gây bệnh trên mỏ và lông chim mỏ vẹt, PCV đã

được phân loại vào họ virus mới gọi là circoviridae (Ellis và cs, 1999)

Circovirus là những virus nhỏ nhất lây nhiễm sang động vật có vú được công

nhận Virus không có vỏ bọc, hình khối 20 mặt, khích thước vào khoảng 17 nm, đường kính 15 - 24 nm Bộ máy di truyền là một vòng DNA chuỗi đơn (Ellis và cs, 1999)

Hình 2.2 Virion của PCV (nguồn M Allan, 2000).

Trước đây PCV được cân nhắc là virus không gây bệnh Gần đây, các nghiên cứu

về PCV tiếp tục phát triển và đã phát hiện một loại kháng nguyên và cấu trúc bộ gene PCV khác biệt trên đàn heo Virus mới này có độc tính cao và là nguyên nhân gây

bệnh trên heo được gọi là porcine circovirus type 2 ( PCV2) Chủng PCV gốc không gây bệnh được gọi là porcine circovirus type 1 ( PCV1)

PCV1 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1974, nhiễm phổ biến trên các đàn heo trên thế giới Một lượng kháng thể huyết thanh chống PCV1 đã được phát hiện từ những heo bị bệnh còi Tuy nhiên, khi tiến hành thử nghiệm lây nhiễm trên heo mới sinh thì không gây triệu chứng bệnh lâm sàng và PCV1 được kết luận là yếu tố không gây bệnh

PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1991 trên đàn heo ở phía tây Canada Kháng thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh trên đàn heo nuôi tại Bỉ năm 1985 Từ những nghiên cứu ban đàu cho thấy khi gây nhiễm trên heo, heo có một

số biểu hiện tổn thương đặc trưng của bệnh PMWS Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh còn là do sự nhiễm thứ cấp của một số virus và vi khuẩn như PPV hay PRRS cùng với yếu tố môi trường và kĩ thuật chăm sóc (G Allan at al, 2000)

Mật độ nổi của PCV1 trong CSCl là 1,33 - 1,34 g/cm3 ( G allan và cs 2000) Hệ

số lắng của PCV là 57s và nhân lên tốt trên môi trường PK-15 PCV không có tính chất gây ngưng kết hồng cầu của một số động vật và có khả năng đề kháng cao với một số chất sát trùng mạnh như (ethanol, chloroform, formaldehyde…) Nó có thể tồn tại trong môi trường nhiều tháng, không bị bất hoạt ở Ph 3,0 và nhiệt độ 70oC trong 15 phút (Ellis và ctv , 1999) Để bất hoạt PCV2 có thể dùng sodium hydroxide với độ pha loãng 1% (Royer và ctv, 2001)

2.2.2 Cấu trúc bộ gen của PCV

Kích thước của bộ gen của các phân lập PCV1 vào khoảng 1758 – 1760 bp và của PCV2 là 1767 – 1768 bp PCV sao chép thông qua khuôn sao chép sợi đôi (Double- stranded Replicate Form – RF), cả 2 sợi PCV- RF đều phiên mã và mã hóa thành các protein (Ellis và cs, 1999)

Phân tích bộ gen của PCV2 phân lập từ Bắc Mỹ và Châu Âu cho thấy chúng thuộc về một nhóm có quan hệ mật thiết với hơn 96% trình tự Nu tương đồng, trong khi so sánh trình tự gen giữa PCV1 và PCV2 thì chỉ có khoảng 80% trình tự Nu tương đồng Các phân lập PCV2 có nhiều kiểu gen khác nhau và được xếp vào 2 nhóm chính: PCV2a và PCV2b

Bộ gene của PCV1 và PCV2 có cấu trúc steem-loop và các trình tự nonanucleotide motif gần giống nhau Đây là vùng được xem là cần thiết cho sự nhân lên của virus

Hình 2.3 So sánh cấu trúc steem-loop của porcine circovirus type 1 và 2 (nguồn

Andrel, 1998) a, cấu trúc stem-loop dạng thẳng của PCV1 và PCV2 Dấu sao chỉ các

trình tự Nu tương đồng; b, cấu trúc steem-loop dạng vòng mô phỏng từ hình a

PCV1 có 7 khung đọc mở - open reading frames (ORFs) có khả năng mã hóa các protein có kích thước lớn hơn 5 KDa, PCV2 có 6 khung đọc mở

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của porcine circovirus type 2 với 6 khung đọc mở

(nguồn Andrel, 1998)

ORF1 của PCV1 kích thước 936 Nu và của PCV2 kích thước là 942 Nu, tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotic và 86 % axit amin giữa PCV1 và PCV2 (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) ORF1 mã hóa protein liên quan đến sự nhân lên của virus, sản phẩm protein mã hóa có kích thước 35,7kDa (Mankertz et al.,1998a) ORF1 được gọi là rep gen

ORF2 mã hóa protein vỏ capsid ORF2 ở cả PCV1 và PCV2 điều có kích thước

699 nu chỉ tương đồng 67% về trình tự nucleotide và 65% axit amin Sản phẩm protein

mã hóa có kích thước 27,8 kDa ORF2 được gọi là cap gen Khi giải mã trình tự gen khung đọc mở ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập PCV2 ở châu Mỹ có tính tương đồng rất cao với các phân lập PCV2 khác trên thế giới Mặc dù có một số khác biệt về gen của ORF2 nhưng vùng gen mã hóa đầu N cuối (N- terminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập virus được nghiên cứu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Gần đây, gen ORF3 của PCV2 cũng được nghiên cứu Gen ORF3 có kích thước 315bp ORF3 có vai trò cảm ứng virus gây ra hiện tượng apoptosis Tuy nhiên, ORF3 không cần thiết cho viêc nhân rộng của virus và các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng apoptosis chưa phải là đặc tính đáng lưu ý trong việc phát triển thương tổn lympho do PMWS (Resendes AR, Majo Nl, Segales J, Mateu E, Calsamiglia M, Domingo M,2004) Ý nghĩa của các ORFs còn lại vẫn chưa được hiểu biết nhiều

2.3 Chẩn đoán

Chẩn đoán PMWS cần dựa vào 3 tiêu chí: Biểu hiện lâm sàng, bệnh tích đặc trưng và xét nghiệm chứng minh acid nucleic hoặc kháng nguyên của PCV2 liên quan bệnh tích đặc trưng

Các phương pháp phát hiện PCV2:

¾ Phương pháp huyết thanh học: Sử dụng các phương pháp Indirect immunoperoxidase (IIP), Indirect Immunoflourescence assay (IFA), ELISA… để phát hiện kháng thể kháng PCV2 Phương pháp ELISA cạnh tranh hiện được sử dụng nhiều

để chẩn đoán PCV2 do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp huyết

thanh học chẩn đoán PCV2 cần được lưu ý do có thể xảy ra hiện tượng nhiễm chéo giữa PCV1 và PCV2, sự đồng nhiễm của PCV2 với các virus khác như PPV, PRRSV gây khó khăn cho việc chẩn đoán

¾ Phương pháp mô hóa miễn dịch (immunocytochemistry – ICC) và lai in situ (in situ hybridization – ISH) được dùng để phát hiện kháng nguyên PCV2 trực tiếp

trên mô bệnh Trong đó kỹ thuật ICC được đánh giá là nhạy hơn so với kỹ thuật ISH

¾ Phương pháp nuôi cấy tế bào: PCV2 được phân lập trên môi trường tế bào PK15 ly trích từ những mô của heo không bị nhiễm PCV1 Phương pháp này chủ yếu phục vụ cho việc bào chế vaccine và định type virus

¾ Phương pháp PCR: đây là phương pháp có độ nhạy, độ chính xác cao và ít tốn thời gian nên được sử dung chủ yếu để chẩn đoán PCV2 phân biệt với PCV1

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme

polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu

về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :

• Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách

thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp

2 mạch bổ sung mới

• Bước 2: (Bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

• Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc

bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m: số bản sao của chuỗi mã hóa

2.5 Một số công trình nghiên cứu chẩn đoán PCV2 trong và ngoài nước Trong nước

Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) khảo sát tỷ lệ nhiễm PCV2 cho biết tỉ lệ dương tính với PCV2 trên heo còi tại một số trại heo công nghiệp ở thành phố HCM

và vùng phụ cận biến động rất lớn từ không nhiễm đến 60 % trong tổng 25 bộ mẫu hạch của 25 heo xét nghiệm

Lê Thị Hồng Hạnh (2005) đã ứng dụng kỹ thuật PCR báo cáo tỉ lệ heo dương tinh với virus PCV2 cao nhất thuộc nhóm heo 9-11 tuần tuổi (40%), thấp nhất ở nhóm heo 12-18 tuần tuổi (28,58%)

Theo Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) bằng kỹ thuật miễn dịch trên tế bào một lớp (IPMA) đối với các mẫu máu lưu trữ từ năm 2000 của một số tỉnh thành phía nam, trong đó có Tp.HCM đã phát hiện kháng thể PCV2 trong điều kiện vẫn chưa có vaccine chủng ngừa bệnh này

Porntippa Nawagitgul, Igor Morozov, Steven R Bolin, Perry A Harms, Steven

D Sorden, and Prem S Paul (2000) ghi nhận ORF2 của PCV2 mã hóa protein capsid

Mahé D, Blanchard P, Truong C, Arnauld C, Le Cann P, Cariolet R, Madec

F, Albina E and Jestin.A (2000) ghi nhận sự khác nhau của protein ORF2 của type1

và type2 của PCV và sự nhận dạng của immunorelevant epitopes

Kim và ctv (2002) cho biết kỹ thuật ISH tỏ ra hữu dụng để có thể phân biệt giữa PCV1 và PCV2 ngay cả trong trường hợp nhiễm kép bởi những mầm bệnh khác như PPV hoặc PRRS

Neilly và ctv(2002) cho biết kỹ thuật mô hóa miễn dịch, phân lập định lượng virus và ELISA phát hiện kháng nguyên đã phân biệt được heo nhiễm virus PCV2 hay bệnh liên quan PCV2

Acaprioli và ctv (2006), đã nghiên cứu kỹ thuật PCR trong phân tách DNA PCV2 trong mẫu máu, hạch và phân trong thí nghiệm gây nhiễm trên heo Kết quả thu được với sai biệt thống kê p=0,332 cho thấy khả năng phát hiện PCV2 trên cả 3 loại mẫu là như nhau

Năm 2009, Kwang Soo Lyoo, Hyeun Bum Kim and Han Soo Joo, Khảo nghiệm

đánh giá phương pháp nested PCR để phân biệt giữa hai kiểu gen của PCV2: PCV2a

và PCV2b Kết quả là đã xây dựng được cây sinh dòng phân biệt 2 nhánh PCV2a và

PCV2b trên cây di truyền của PCV2

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm:

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2010 đến tháng 6/ 2010

Địa điểm lấy mẫu: Một số trại heo trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các vùng phụ cận

Địa điểm phân tích: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3.2 Đối tượng khảo sát và số lượng mẫu:

Các mẫu được lấy từ 57 con heo : 7 heo nái, 22 heo cai sữa, 28 heo thịt

Dựa theo biểu hiện bệnh: 31 heo con từ 4 - 16 tuần tuổi có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PMWS (triệu chứng còi cọc), 5 heo có biểu hiện viêm da và 21 heo bình thường

Heo nái Heo bình thường

Gồm 35 mẫu phân, 25 mẫu máu và 12 mẫu hạch trong đó có 1 mẫu huyết thanh, phân và hạch được thu nhận trên cùng 1 heo; 11 mẫu huyết thanh và phân thu nhận trên cùng một heo 45 mẫu còn lại (20 mẫu phân, 11 mẫu hạch và 14 mẫu huyết thanh) được thu nhận trên 45 con heo khác nhau

3.3 Vật liệu và dụng cụ

Các dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, bình đá…

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR

™ Tủ cấy vô trùng, máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)

™ Tủ -70oC, -20oC (Sanyo Ultra Low), tủ lạnh (Electrolux)

™ Máy PCR (Biorad), máy PCR effpendorf, máy PCR-system 9700

™ Máy Vortex; bộ nguồn và bồn điện di

™ Micropipet, đầu tuýp và eppendorf (Promega)

™ Máy đọc gel (Chemidoc – Bio-rad); máy đo OD

3.3.2 Vật liệu và hoá chất cho chiết tách DNA và PCR

Bộ kít sử dụng tách chiết DNA

™ QIAamp DNA Tissue Mini kit (Qiagen) Thành phần bộ kit: Cột lọc DNA( DNeasy Mini Spin Columns); ống thu nhận (collection tubes 2ml; dung dịch đệm AL, AW1, AW2, AE; proteinase K

™ QIAamp DNA Serum Mini kit (Quiagen) Thành phần bộ kit: Cột lọc DNA( DNeasy Mini Spin Columns); ống thu nhận ( collection tubes 2ml); dung dịch đệm ATL, AW1, AW2, AE; proteinase K

™ QIAamp DNA stool Mini kit (Quiagen)

Thành phần bộ kit: Cột lọc DNA( DNeasy Mini Spin Columns); ống thu nhận ( collection tubes 2ml); dung dịch đệm ASL,AL, AW1, AW2, AE; proteinase K; viên InhibitEX