Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) chọn lọc các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao mang QTLgen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN ĐĂNG KHÁNH THÁI NGUYÊN - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan trực tiếp thực hầu hết nghiên cứu luận văn Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giải luận văn Đỗ Ngọc Tuyền Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học này, xin bày tỏ biết ơn vô sâu sắc tới TS.Trần Đăng Khánh – Phòng sinh học phân tử - Viện di truyên Nông Nghiệp hướng dẫn tận tình, chu đáo bên cạnh kiến thức sinh học bổ ích khác Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn hướng dẫn, giúp đỡ quý báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp Khoa Khoa học sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên nơi tiến hành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học Luận văn thực với nguồn kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học Cơng nghệ Quốc gia Tác giả luận văn Đỗ Ngọc Tuyền Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa lúa 1.2 Chỉ thị phân tử công tác chọn tạo giống 1.2.1 Chỉ thị phân tử 1.2.2 Ứng dụng thị phân tử công tác chọn tạo giống ( Phương pháp Marker assisted selection- MAS) 11 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu 15 1.3.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1.Giống lúa nghiên cứu 24 2.1.2.Các thị phân tử hóa chất thí nghiệm 24 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 25 2.2.2 Các phương pháp thí nghiệm phòng 25 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.3 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 30 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Chương 3: KẾT QỦA NGHIÊ N CỨUTHẢO VÀ LUẬN 31 3.1 Kết xác định thị phân tử đa hình vị trí QTL/gen Yd7 giống Khang Dân 18 giống KC25 31 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 31 3.1.2 Kết xác định thị phân tử đa hình vị trí QTL/gen Yd7 31 3.2 Kết lai tạo hệ F1 tổ hợp Khang Dân 18 KC25 32 3.3 Kết xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 quần thể F1 tổ hợp lai Khang Dân 18 KC25 33 3.4 Kết xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 quần thể F2 tổ hợp lai Khang Dân 18 KC25 34 3.5 Kết xác định cá thể quần thể F3 tổ hợp Khang Dân 18 KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt/bơng 37 3.6 Kết xác định dòng lúa triển vọng mang QTL/gen Yd7 cho suất cao 40 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn nhân chọn lọc Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ Cs : Cộng dNTP : Deoxynucleotide triphosphate MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ thị phân tử PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/QTLs : Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm sốt tính trạng số lượng RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN nhân ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại trình tự đơn giản TBE : Tris-Boric Acid-EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thông tin cặp mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 3.1: Bảng thống kê kết thí nghiệm 40 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Minh họa QTL/gen Yd7………….……………………………… 26 Hình 3.1: Kết tách DNA tổng số gel agarose 0,8% …… ….… …31 Hình 3.2: Sản phẩm điện di với thị gel agarose 2,5% .… …32 Hình 3.3: Kết lai tổ hợp Khang dân 18 KC25……………….……… 33 Hình 3.4: Kết điện di gel agarose 2,5% với chị thị RM500 33 Hình 3.5: Kết điện di gel agarose 2,5% với chị thị RM21615 34 Hình 3.6 : Kết điện di kiểm tra quần thể F2 với thị RM21615 35 Hình 3.7: Kết điện di kiểm tra quần thể F2 với thị RM500 36 Hình 3.8: Kết điện di kiểm tra quần thể F3 với thị RM500 38 Hình 3.9: Kết điện di kiểm tra quần thể F3 với thị RM445 39 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 across environments by using a doubled-haploid populaton”, Theor Appl Genet, 94: 145-150 45 Mei H W., Luo L J., Ying C S., Wang Y P., Yu X Q., Guo L B., Paterson A H and Li Z K (2003), “Gene actons of QTLs affectng several agronomic traits resolved in a recombinant inbred rice populaton and two testcross populatons”, Theor Appl Genet, 107: 89-101 46 Moncada P., Martínez C P., Borrero J., Chatel M., Gauch H., Guimaraes E., Tohme J and McCouch S R (2001), “Quanttatve trait loci for yield and yield components in an Oryza sativa X Oryza rufipogon BC2F2 population evaluated in an upland environment”, Theor Appl Genet, 102: 41-52 47 Nagata K., Fukuta Y., Shimizu H., Yagi T and Terao T (2002), “Quantitative Trait Loci for Sink Size and Ripening Traits in Rice (Oryza satva L.)”, Breed Sci, 52: 259-273 48 Olson M., Hood L., Cantor C., Bostein D (1989), “A common languague for physical mapping of the human genome”, Science, 29: 1434-1435 49 Saghai-Maroof M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and populaton dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 8014-8018 50 Septiningsih E M., Prasetyono J., Lubis E., Tai T H., Tjubaryat T., Moeljopawiro S and McCouch S R (2003), “Identification of quantitative trait loci for yield and yield components in an advanced backcross populaton derived from the Oryza sativa variety IR64 and the wild relatve O rufipogon”, Theor Appl Genet, 107: 1419-1432 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 58 51 Scascitelli M., Whitney K D., Randell R A., King M., Buerkle C A., Rieseberg L H (2010), “Genome scan of hybridizing sunflowers from Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 59 Texas (Helianthus annuus and H debilis) reveals asymmetric patterns of introgression and small islands of genomic differentation”, Molecular Ecology, 19: 521–541 52 Temnykh S (2011), “The map-based sequence of the rice genome”, Nature, 2005 53 Thomson M J., Tai T H., McClung A M., Lai X H., Hinga M E., Lobos K B., Xu Y., Martinez C P and McCouch S R (2003), “Mapping quantitative trait loci for yield components and morphological traits in an advanced backcross population between Oryza rufipogon and the Oryza sativa cultivar Jefferson”, Theor Apll Genet, 107: 479-493 54 Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M (1995), “AFLP: a new technique for DNA fingerprintng”, Nucleic Acids Res, 11: 4407– 4414 55 Weising K., Nybom H (2005), “DNA Fingerprinting in plant: Principles, methods and application – 2nd Edition”, CRC Press – Taylor & Francis Group 56 Williams J G (1990), "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetc marker", Nucleic Acid Research, 18: 6531-6535 57 Xing Y Z., Zhang Q (2010), “Genetic and molecular bases of rice yield”, Annu Rev Plant Biol, 61: 421–442 58 Xing Z., Tan F., Hua P., Sun L., Xu G., Zhang Q (2001), “Characterizaton of the main effects, epistatc effects and their environmental interactions of QTLs on the genetic basis of yield traits in rice”, Theor Appl Genet, 105: 248-257 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 60 59 Xiao J., Li J., Yuan L., Tanksley S D (1996), “Identfication of QTLs affecting inbred traits of agronomic Số hóa Trung tâm Học liệu importance in a recombinant http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 61 population derived from a subspecific rice cross”, Theor Appl Genet, 92: 230–244 60 Xiao J., Li J M., Grandillo S., Ahn S N., Yuan L P., Tanksley S D and McCouch S R (1998), “Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relatve, Oryza rufipogon”, Genetics, 150: 899-909 61 Xu Y., Crouch J H (2008), “Marker-assisted selection in plant breeding: from publications to practice”, Crop Sci, 48: 391–407 62 Xu J L., Xue Q Z., Luo L J and Li Z K (2001), “QTL dissection of panicle number per plant and spikelet number per panicle in rice (Oryza sativa L.)”, Acta genetca Sinica, 28: 752-759 63 Yang W., de Oliveira A C., Godwin I., Schertz K., and Bennetzen J L., (1996), “Comparison of DNA marker technologies in characterizing plant genome diversity: Variability in Chinese sorghums”, Crop Sci, 36: 1669 – 1676 64 Yu S B., Li J X., Xu C G., Tan Y F., Gao Y J., Li X H., Zhang Q and Maroof M A (1997), “Importance of epistasis as the genetic basis of heterosis in an elite rice hybrid’, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 9226-9231 65 Zhang J., Li X., Jiang G., Xu Y., He Y (2006), “Pyramiding of Xa7 and Xa21 for the improvement of disease resistance to bacterial blight in hybrid rice”, Plant Breed, 125(6): 600–605 66 Zhao X P and Kochert G (1993), ”Phylogenetic distribution and genetic-mapping of a (GGC) (N) microsatellite from rice (Oryza-sativa L)”, Plant Molecular Biology, 21: 607–614 67 Zheng K (1995), “PCR-based marker assisted selection in rice breeding”, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 62 Geological Publishing House Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 68 Zietkiewicz E., Rafalski A., and Labuda D., (1994), “Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) – anchored polymerase chain reaction amplification”, Genomics, 20: 176 – 183 69 Zhuang J Y., Lin H X., Lu J., Qian H R., Hitalmani S., Huang N and Zheng K L (1997), “Analysis of QTL x environment interacton for yield components and plant height in rice”, Theor Appl Genet, 95: 799-808 70 Zhuang J Y., Fan Y Y., Rao Z M., Wu J L., Xia Y W and Zheng K L (2002), “Analysis on additive effects and additive-by-additve epistatic effects of QTLs for yield traits in a recombinant inbred line population of rice”, Theor Appl Genet, 105: 1137-1145 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh mục hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu Hóa chất: Hóa chất tách chiết ADN: STT Hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ làm việc NaOH 1M 0,25M TrisHCl 1M 0,1 M Nước cất Hóa chất thực phản ứng PCR: STT Hóa chất Nồng độ làm việc Buffer 10X MgCl2 25 mM dNTPs 2,5 mM Taq Takara : 50 Primer 15 ng/µl Nước cất Hóa chất điện di agarose - Hóa chất pha TBE 10X (V = 1000 ml): STT Hóa chất Khối lượng Tris base 108 gram EDTA 0,5 M pH 8,0 20 ml Axit boric 55 gram Nước cất Đong đủ 1000 ml Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Agarose SFR - Ethidium bromide 10 mg/ ml - Nước cất - Thang ADN chuẩn (50 bp X174HindIII) Dụng cụ thiết bị: - Máy nghiền mẫu Retsch Mixer mill MM200 - Máy ly tâm lạnh Mikro Zentrifugen - Máy khuấy từ gia nhiệt Fisher Scientific- Mỹ - Máy vortex Julabo Paramix - Máy PCR Vertti 96 wells Applied Biosystems - Bộ điện di ngang Owl A2-BP Large Gel Electrophoresis System - Bộ nguồn Power Supply Thermo Scientific EC 3000XL - Hệ thống đèn UV soi gel - Tủ sấy Memmert Paraffin Oven UNE 500PA - Pipet loại (1 kênh, kênh, 12 kênh, pipet điện tử) - Các thiết bị khác (lò vi sóng, nồi khử trùng, máy cất nước ) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phụ lục 2: Một số hình ảnh thí nghiệm Thực phản ứng PCR Chạy gel Polyacrylamid Chạy sản phẩm máy PCR Soi gel Đọc kết Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phụ lục 3: kết xử lí phần mềm IRRISTAT5.0 BALANCED ANOVA FOR VARIATE S? BôNG FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB VARIATE V003 S? BôNG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO PROB ER SQUARES LN ============================================================================= CT$ 3.46667 385185 1.86 0.126 N.LAI 266667 133333 0.64 0.542 * RESIDUAL 18 3.73333 207407 * TOTAL (CORRECTED) 29 7.46667 257471 - BALANCED ANOVA FOR VARIATE TR?C/ Bô FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB VARIATE V004 TR?C/ Bô LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO PROB ER SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7744.30 860.478 10.01 0.000 N.LAI 232.867 116.433 1.35 0.283 * RESIDUAL 18 1547.80 85.9889 * TOTAL (CORRECTED) 29 9524.97 328.447 - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BALANCED ANOVA FOR VARIATE P1000 FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB VARIATE V005 P1000 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO PROB ER SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1.72700 N.LAI 526667E-01 263333E-01 2.72 0.091 * RESIDUAL 191889 18 174000 19.85 0.000 966668E-02 * TOTAL (CORRECTED) 29 1.95367 673678E-01 - BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB VARIATE V006 NSTT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO PROB ER SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1033.58 114.842 17.02 0.000 N.LAI 1.70082 850409 0.13 0.882 * RESIDUAL 18 121.489 6.74938 * TOTAL (CORRECTED) 29 1156.77 39.8885 - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSLT FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB VARIATE V007 NSLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO PROB ER SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2109.33 234.370 17.01 0.000 N.LAI 3.47269 1.73635 0.13 0.882 * RESIDUAL 18 247.962 13.7756 * TOTAL (CORRECTED) 29 2360.76 81.4056 - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS S? BôNG TR?C/ Bô P1000 NSTT ÐC 6.00000 146.333 19.6667 50.7670 C1-16-11 6.66667 150.667 19.9333 58.6823 C1-16-50 7.00000 138.333 19.6000 55.8020 C1-16-55 6.66667 132.667 20.2333 52.4240 C1-16-63 6.66667 141.333 20.1333 55.5667 C1-16-88 6.66667 134.000 20.0667 52.4747 C1-16-90 7.00000 157.000 20.4000 65.9060 C1-16-94 6.33333 179.667 20.1667 67.1340 C1-16-99 6.33333 177.667 20.2000 66.6137 C1-16-109 6.00000 162.000 20.1667 57.6277 SE(N= 3) 5%LSD 18DF CT$ ÐC C1-16-11 C1-16-50 C1-16-55 C1-16-63 C1-16-88 C1-16-90 C1-16-94 C1-16-99 C1-16-109 0.262937 5.35378 0.567647E-01 1.49993 0.781224 15.9069 0.168656 4.45651 NOS NSLT 72.5240 83.8320 79.7170 74.8917 79.3813 74.9633 94.1513 95.9057 95.1620 82.3247 SE(N= 3) 2.14287 5%LSD 18DF 6.36677 MEANS FOR EFFECT N.LAI N.LAI NOS S? BôNG TR?C/ Bô P1000 10 6.60000 149.800 20.1000 10 6.60000 150.200 20.0000 10 6.40000 155.900 20.0700 SE(N= 10) 5%LSD 18DF N.LAI NSTT 58.2022 58.0695 58.6277 0.144016 2.93239 0.310913E-01 0.821546 0.427894 8.71255 0.923768E-01 2.44093 NOS NSLT 10 83.1460 10 82.9561 10 83.7538 SE(N= 10) 1.17370 5%LSD 18DF 3.48723 - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 19/ 5/** 15:26 PAGE Thi nghiem bo tri theo kieu CRB F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N.LAI | (N= 30) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | S? BôNG 30 6.5333 0.50742 0.45542 7.0 0.1258 0.5419 TR?C/ Bô 30 151.97 18.123 9.2730 6.1 0.0000 0.2831 P1000 30 20.057 0.25955 0.98319E-01 0.5 0.0000 0.0911 NSTT 30 58.300 6.3157 2.5980 4.5 0.0000 0.8823 NSLT 30 83.285 9.0225 3.7116 4.5 0.0000 0.8823 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... HỌC ĐỖ NGỌC TUYỀN SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG CHUYÊN NGÀNH... đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử (MAS) chọn lọc dòng lúa triển vọng cho suất caomang QTL/gen quy định tnh trạng tăng số hạt bông với mục têu thông qua phương pháp MAS (Marker... đến vấn đề chọn giống nhờ thị phân tử Trong chọn giống nhờ thị phân tử, trình chọn lọc dựa sở thị phân tử liên kết với gen quy định tính trạng cần quan tâm Chọn lọc nhờ thị phân tử chọn giống trở