tài liệu Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử trình bày các nội dung: khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống, cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử, cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian, tách sản phẩm trên gel ureaacrylamid. Đây là tài liệu tham khảo môn Sinh học.
Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Chương KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE Ở SINH VẬT Tóm tắt: Sinh học phân tử nòng cốt cơng nghệ sinh học Phân tích sinh học phân tử việc thu nhận dịch chiết ADN từ tế bào sống đủ để thực phân tích Tuỳ theo vật liệu nghiên cứu mà có phương pháp tách chiết ADN phù hợp Dung dịch ADN sau kiểm tra hàm lượng độ sử dụng để phân tích theo mục đích khác Southem blot, Northem blot, xác định trình tự ADN, PCR, RFLP, AFLP, Nội dung chương gồm vấn đề bản: (1) Phương pháp tách chiết ADN, (2) Lai phân tử, (3) Xác điịh trình tự nucleotit, (4) Kĩ thuật RFLP, (5) Trình tự nucteotit lặp lại Thành tựu sinh học đại hiểu biết di truyền học phân tử làm sở cho việc nghiên cứu, xây dựng kĩ thuật sinh học đại Những kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng phân tích genome sinh vật cơng bố tạp chí khoa học sách chuyên khảo §1 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng axit nucleic, đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Điều quan tâm hàng đầu kĩ thuật tách chiết axit nucleic thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ tác nhân học hố học Có thể lấy ví dụ bước tách ADN từ mầm hạt đậu dây: Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 79 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Hình 6.1 Sơ đồ quy trình tách chiết ADN từ mầm hạt đậu tương đậu xanh Từ ví dụ cụ thể ta thấy quy trình tách chiết ADN gồm ba bước sau: Bước 1: Phá màng tế bào màng nhân (tế bào Eukaryot) Thông thường người ta nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) proteinase K Hỗn hợp phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải phóng ADN mơi trường đồng thời phân huỷ protein Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn, chủ yếu protein li tâm Bước 3: Tủa axit nucleic ethanol isopropanol thu nhận axit nucleic dạng cô đặc Sau thu nhận axit nucleic dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính định lượng chúng số phương pháp đo mật độ quang, điện đi, siêu li tâm, sắc kí (hình 6.2 6.3) Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 80 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Hình 6.2 Phổ hấp thụ ADN bước sóng 260 nm Điện di ADN kĩ thuật sử dụng để kiểm tra chất lượng chế phẩm ADN tách từ tế bào sống Đồng thời kết điện di cho phép dự đoán hàm lượng ADN dung dịch tách chiết Phương pháp điện di dược sử dụng kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự ADN Hình 6.3 Cấu trúc agarose (theo Nông Văn Hải, 2002) Gel agarose sử dụng để phân tích điện di ADN Agarose dạng bột dược pha với dung dịch TBE TAE tuỳ theo mục đích phân tích ADN mà pha gel với nồng độ thích hợp Kĩ thuật điện di ADN bao gồm bước (hình 6.4): Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 81 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Hình 6.4 Các bước tạo gel điện di agarose (1, 2) Tạo khuôn ga agarose; (3) Đổ ga khuôn ga ; (4) Tra dung dịch ADN ; (5) Chạy điện di Sản phẩm điện di ADN nhuộm EtBr chụp ảnh ánh sáng đèn cực tím (1) Nhuộm gel EtBr ; (2) Soi gel ánh sáng đèn cực tím để phát có mặt ADN ; (3) Chụp ảnh để phân tích Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 82 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Hình 6.5 Hình ảnh điện di ADN tách từ mầm đậu tương ADN chuẩn 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: ADN tách từ mầm đậu tương Hình 6.6 Cấu trúc EtBr (theo Nơng Văn Hải, 2002) §2 LAI PHÂN TỬ Mục đích kĩ thuật phát trình tự nucleotit đặc thù, nghiên cứu cấu trúc ADN hệ gene (gencomic ADN) Phân tử ADN bị phân cắt enzyme giới hạn thành phân đoạn ADN riêng biệt Bằng phương pháp điện di phân đoạn ADN với kích thước khác tách (separate) gel thạch hoặc poliacrylamit chuyển sang màng lai phân tử Quá trình lai phân tử xảy phân tử ADN đoạn dò ADN có gắn nhãn phóng xạ theo quy tắc liên kết bổ trợ Các đoạn ADN đặc thù phát theo phương pháp thẩm tách Southern phương pháp lai phân tử với đoạn dò ADN có trình tự nucleotit tương đồng Phương pháp tự ghi phóng xạ (autoradiogrophy) nhận biết vị trí đoạn dò ADN màng lai phân tử Từ E.M Southern thuộc Trường Đại học tổng hợp Edinburgh phát kĩ thuật (1975) gọi kĩ thuật phân tích màng thấm truyền Southern (Southern blot analisis) gọi tắt Southern, ứng dụng rộng rãi lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử di truyền Khi ứng dụng kĩ thuật Southern ARN gọi Northern, với protein gọi Western Hiện có nhiều cải tiến phương pháp, hình thành nhiều kĩ thuật phối hợp Southwestern Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 83 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 2.1 Phương pháp Southern blot Sử dụng trình tự ADN biết trước lai với đoạn ADN cần tìm Các bước tiến hành thực theo bước sau: - Cắt ADN enzyme giới hạn thành đoạn ADN nhỏ dịch chuyển gel agasore - Biến tính sợi ADN kép gel agarose phương pháp xử lí với kiềm - Chuyển ADN biến tính sang màng nylon nitrocellulose - Lai với trình tự ADN đánh dấu phóng xạ huỳnh quang Hình 6.7 Sơ đồ mơ tả phương pháp Southern blot Phương pháp Southern blot cho phép xác định trình tự đoạn ADN cần tìm, phát đột biến đoạn thêm đoạn so sánh cá thể đột biến với cá thể bình thường 2.2 Phương pháp Northern blot Phương pháp Northern blot tương tự phương pháp Southern blt, mục tiêu phương pháp Northern blot nghiên cứu cấu trúc mARN Đó kỹ thuật lai mARN với trình tự ADN biết trước, đánh dấu phóng xạ (1) Tách chiết ARN tổng số biến tính (2) ARN chuyển sang màng lai với trình tự ADN đặc hiệu (3) Vị trí số lượng đoạn ARN lai với ADN phát phim phóng xạ Phương pháp Northern blot cho phép nghiên cứu cấu trúc ARN, phát đột biến Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 84 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn §3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN Có nhiều kĩ thuật xác định trình tự đơi bazơ chuỗi ADN: - Kĩ thuật điện phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định trình tự chuỗi ADN sợi đơn - Xác định trình tự nucleotit thơng qua trình tự amino axit dựa vào ba mã hoá, nhiên số mã amino axit thường có số nucleotit trùng lặp số ba quy định loại amino axit, trình tự ADN thu tương đối - Xác định trực tiếp thông qua phản ứng kết thúc đầu cuối Nguyên tắc tạo ADN sợi đơn, mà phân tử sau có trình tự dài phân tử trước nucleotit đầu cuối Gene tế bào tiền nhân có trình tự liên tục, gene sinh vật nhân thực gián đoạn Đoạn nucleotit mã hố protein gọi exon, đoạn khơng mã hoá gọi intron 3.1 Phương pháp hoá học Maxam-Gilbert Nguyên tắc phương pháp hoá học Maxam-Gilbert sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ (P32), xử lí hố học để phá huỷ nucleotit tạo hàng loạt đoạn ADN có kích thước khác Các đoạn DNA bị phá huỷ nucleotit Điện di gel poliacrylamid Hình 6.8 Sơ đồ minh hoạ phương pháp Maxam-Gilbert Các khâu phương pháp Maxam-Gilbert : (1) ADN sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn (2) Đánh dấu phóng xạ (P32) đầu 5' (3) Sử dụng loại hoá chất khác nhau, loại hoá chất phá huỷ loại nucleotit định tiến hành phản ứng độc lập, kết qủa tạo đoạn ADN kích thước khác Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 85 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn (4) Sản phẩm phản ứng tiến hành điện di gel poliacrylamid Trình tự nucleotit đọc từ lên theo chiều từ 5'→3' 3.2 Phương pháp Sanger Nguyên tắc phương pháp sử dụng deoxynucleotit khơng có nhóm OH vị trí 3' trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit trình tổng hợp bị dừng lại Kết tạo đoạn ADN có kích thước nucleotit, sở xác định trình tự nucleotit Hình 6.9 Deoxynucleotit oxy vị trí C 3' phân tử đường Các khâu phương pháp Sanger: (1) Biến tính ADN sợi kép thành ADN sợi đơn (2) Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn (3) Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm: ADN sợi khuôn, primer, ADN polimerase dNTP Sự gắn dNTP nhóm OH vị trí 3' vào chuỗi polinucleotit làm trình tổng hợp bị dừng lại (4) Điện di gel poliacrylamid xác định trình tự đoạn ADN Hình 6.10 Sơ đồ xác định trình tự nucleotit theo Sanger Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 86 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn §4 RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN) Trong năm gần kĩ thuật phân lập gene dần thúc đẩy lĩnh vực thú vị việc sử dụng đoạn ADN phân lập thị phân tử Kĩ thuật phân tích đa hình độ dài phân đoạn ADN kĩ thuật mẻ đầy hứa hẹn làm thay đổi hoàn toàn số lĩnh vực truyền chọn giống Thông tin di truyền chứa chuỗi ADN nhiễm sắc thể nhân gene quan tử Cây trồng có khả chép phân tử ADN với chế độ xác cao mau lẹ song có nhiều tác động tự nhiên nhân tạo gây biến dị trình tự ADN Những biến đổi cặp bazơ nitơ xuất biến đổi chuỗi ADN phạm vi rộng lớn kết đảo đoạn, chuyển đoạn khuyếtđoạn chuyển chỗ nhiễm sắc thể Có số cách xác định biến dị chuỗi ADN, xác định trình tự ADN so sánh đoạn; sử dụng enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành phân đoạn có chiều dài khác Hình 6.11 Thiết bị tự động xác định trinh tự ADN mao quản Biến đổi trình tự nucleotit locus dẫn đến xuất ADN gel thạch poliacrylamid Hiện tượng gọi đa hình độ dài phân đoạn ADN Hiện tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN thị phân tử Bằng cách sử dụng thị phân tử (chỉ thị phân tử RFLP) nhà sinh học phân tử di truyền chọn giống thiết lập đồ gene liên kết di truyền định vị gene có tầm quan trọng kinh tế Kĩ thuật RFLP tiến hành theo bước sau: Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 87 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn (1) Tách ADN từ mô sống (2) Sử dụng enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành đoạn có kích thước khác (3) Điện di gel agarose (4) So sánh đoạn ADN đối tượng nghiên cứu 4.1 Bản đồ RFLP 4.1.1 Nguyên lí Nguyên lí kĩ thuật dựa khác biệt tự nhiên chuỗi nucleotit phân tử ADN phân tử ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ enzyme cắt hạn chế đoạn ADN khác kích thước hay chiều dài Sự khác khai thác để phân tích phân li đoạn nhiễm sắc thể lai tạo Các phân tử ADN có kích thước nhỏ ADN lục lạp sử dụng enzyme (RE) giới hạn để lập đồ RFLP, nhiên khả ứng dụng ADN lục lạp tạo giống hạn chế, hầu hết gene có ý nghĩa kinh tế quan trọng lại nằm nhân Phân tích RFLP ứng dụng với ADN nhân, phức tạp ADN nhân có kích thước lớn hàm lượng nhiều Khi sử dụng RE ADN hàng triệu phân đoạn ADN tạo thành 4.1.2 Thư viện thị RFLP Người ta dùng đoạn nhiễm sắc thể làm thị đánh dấu để nhận biết phân đoạn cắt hạn chế áp dụng phương pháp lai ADN - ADN có tính đặc hiệu cao việc sử dụng đoạn ADN mẫu để nhận biết phân đoạn ADN nhân từ hỗn hợp đoạn ADN tạo thành việc xử lí RE Tập hợp đoạn ADN mẫu gọi thư viện RFLP Đoạn ADN mẫu có độ dài 2-5 kb trạng thái tinh khiết sử dụng để lai phân tử Các đoạn ADN tinh khiết người ta cần phải thực kĩ thuật nhân gene (gene cloning) Kĩ thuật nhân đoạn ADN sau: Đoạn ADN gắn vào plasmit biến nạp vào vi khuẩn Vi khuẩn sinh sản dẫn đến đoạn ADN nhân lên tạo nhiều đoạn ADN Bằng kĩ thuật nuôi cấy phân lập plasmit từ vi khuẩn tạo số lượng lớn đoạn ADN dùng làm mẫu cho lai ADN Quy trình xác định RFLP thực theo bước sau : (1) Tách chiết ADN nhân ; (2) Xử lí ADN với enzyme cắt giới hạn ; (3) điện di sản phân cắt RE ; (4) Biến tính ADN thành dạng sợi đơn; (5) Chuyển lên màng lai nitrocellulose (Southern blot) để đoạn nADN mẫu lai với đoạn ADN tương đồng theo nguyên tắc bổ sung cặp bazơ Người ta sử dụng kĩ thuật phát quang hoá học (Enhanced Chemical Luminesence = ECL) đánh dấu phóng xạ để xác định kết lai phim âm phóng xạ tự ghi Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 88 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 4.1.3 Thiết lập đồ di truyền RFLP Người ta tiến hành lai hữu tính F1 cho F1 tự thụ cho F2 Khi F1 giảm phân hình thành giao tử nhiễm sắc thể có tái tổ hợp thông qua trao đổi chéo Trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp sở cho việc thiết lập đồ di truyền truyền thống (bản đồ liên kết) Kĩ thuật RFLP cho phép quan sát trực tiếp phân tử thị ADN đoạn nhiễm sắc thể Các thị RFLP phân li hoàn tồn xác thị gene tn theo định luật Menđen cách nghiêm ngặt Vì đồ RFLP thiết lập theo nguyên tắc thị truyền thống Quy trình thiết lập đồ di truyền thị RFLP thực theo bước sau: (1) Chọn cặp bố mẹ loài xa mặt di truyền tạo F1 Tách ADN sử dụng RE xử lí ADN Sàng lọc tính đa dạng cặp bố mẹ có mực độ đa dạng thích hợp chọn làm cặp lai (2) Tạo quần thể lập đồ Cho cặp bố mẹ lai với F1, cho F1 tự phối F2 lai ngược Một quần thể F2 lai ngược có 50 cá thể đủ xây dựng đồ di truyền chi tiết (3) Đánh giá RFLP quần thể Tách ADN cá thể tiến hành kĩ thuật RFLP Quá trình lập đồ tiến hành theo trình sau: - Sàng lọc RFLP: Mẫu thử với cặp bố mẹ để phát loại enzyme giới hạn thích hợp tạo đa dạng RFLP rõ rệt hai cá thể bố mẹ - Chọn cặp thị 1enzyme: Chọn cặp thị /enzyme thích hợp, loại enzyme cắt ADN Có thể tiến hành sau: tách ADN bố, mẹ để lập đồ Sử dụng loại enzyme cắt, điện di, thấm truyền lên màng lai (mỗi enzyme dùng màng lai riêng), chọn cặp thị / enzyme thể đa dạng kiểu gene dùng để lập đồ - Đánh giá mức độ liên kết: Khi so sánh hai thị thu hai kết quả, (1) Chúng có xu hướng phân li hai thị có mối liên kết Ví dụ: F2 dị hợp thị dị hợp thị bố mẹ đồng hợp hai thị (2) Sự phân bố tính đồng hợp hay dị hợp hai thị không theo quy luật mà hồn tồn ngẫu nhiên, chúng khơng liên kết Sử dụng nhiều thị xác định mức độ liên kết khác thị nhóm thị 4.2 Ứng dụng RFLP Việc phát triển kĩ thuật phân tính tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN mở rộng cánh cửa tới phát hiện, theo dõi điều khiển biến dị di truyền nhiều loại trồng mà trước làm (Tanksley Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 89 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn cộng sự, 1989) Những nghiên cứu gần lúa (Mc Couch cộng sự, 1988), cà chua (Pettersun cộng sự, 1988, 1990, 1991), đậu tương (Keim cộng sự, 1990), lúa mì (Sharp cộng sự, 1989), Ngô (Burr cộng sự, 1988, Grant cộng 1989, Beavis cộng 1991, Stuber cộng sự, 1992) chứng tỏ việc lập đồ thị phân tử RFLP phương pháp có sức mạnh lớn lao việc xác định locus điều khiển tính trạng số lượng - đặc tính có tầm quan trọng mặt nơng nghiệp Người ta xác định nhiều tính trạng đơn gene lúa thông qua liên kết với thị phân tử RFLP (Mackill cộng sự, 1993, Ronald cộng sự, 1992, Mc Couch Tanksley, 1991, Yu cộng sự, 1991, Yoshimura cộng sự, 1992) Kĩ thuật phân tích tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN cho phép phát hiện tượng đa hình gene thơng qua so sánh đồ phân cắt ADN cá thể khác Các thị phân tử RFLP mang tính chất riêng biệt, đồng trội khơng gây hại Các thị phân tử không chịu tác động điều kiện môi trường (kể thay đổi mùa vụ vị trí địa lí giai đoạn phát triển Việc phân tích tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN tiến hành phân tử ADN tách chiết từ non, tránh việc phải chăm sóc non tới lúc trưởng thành Người ta áp dụng thị phân tử RFLP vào công tác chọn giống gián tiếp, làm rút ngắn trình chọn lọc gene quý hiếm, gene có tầm quan trọng kinh tế Bởi lẽ thị phân tử RFLP liên kết chặt chẽ với gene trì trình phân li Vì người ta theo dõi chọn lọc gene thơng qua thị phân tử N R Apuyru cộng (1988) xác định tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN hai giống đậu tương hoang dại Minsoy Norin cách sử dụng dòng ADN chọn lọc ngẫu nhiên làm đoạn dò ADN Các tác giả nhận thấy số năm đoạn dò thử nghiệm bộc lộ tính đa hình Hơn số băng đa hình xuất có xếp lại phân tử ADN P Kềnh cộng (1989) khảo sát 58 giống đậu tương chọn lọc từ Geneus Glicine Subgeneus Soja 17 thị phân tử RFLP để đánh giá mức độ đa dạng phân tử, tính hữu hiệu thị phân tử thể số giống đậu tương dạng trồng biểu nhiều giống thuộc loài đậu tương khác Glicine max (L) Merr, G soja Sieb Zucc Các thị phân tử RFLP áp dụng cho việc lập đồ gene, nghiên cứu đa dạng sinh học, phân loại phát sinh chủng loại điều khiển vật ni trồng Nó công cụ đắc lực công tác lai tạo chọn giống thực Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 90 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn vật Đồng thời việc xác lập thị phân tử RFLP mở hướng phân lập gene mà chưa biết sản phẩm THẢO LUẬN Thế lai phân tử? Phân biệt phương pháp Southern blot, Northern blot Những ứng dụng phương pháp Vấn đề xác định trình tự ADN Nguyên tắc phương pháp Vấn đề xác định thị RFLP đồ RFLP Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 91 ... phân đoạn ADN) Trong năm gần kĩ thuật phân lập gene dần thúc đẩy lĩnh vực thú vị việc sử dụng đoạn ADN phân lập thị phân tử Kĩ thuật phân tích đa hình độ dài phân đoạn ADN kĩ thuật mẻ đầy hứa... lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio 86 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn §4 RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích tượng đa hình độ dài phân đoạn... hình độ dài phân đoạn ADN Hiện tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN thị phân tử Bằng cách sử dụng thị phân tử (chỉ thị phân tử RFLP) nhà sinh học phân tử di truyền chọn giống thiết lập đồ gene liên