Tiểu luận vi sinh vật cố định đạm

Tiểu luận vi sinh vật học nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm với kiến thức được mở rộng giúp ích cho học sinh, sinh viên và giáo viên. Nhận thấy được tầm quan trọng, thiết yếu của vi sinh vật cố định đạm đối với nông nghiệp nói chung và nông dân nói riêng, tác giả đã tìm hiểu nhiều tài liệu nhằm giúp học sinh, sinh viên và các giáo viên tìm hiểu mở rộng kiến thức chuyên môn cũng như đời sống của mình

Đề tài: Nghiên cứu cơ chế cố định Nitơ của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium ở cây họ đậu và ứng dụng.

Phần I: Phần mở đầu

1 Lý do chọn đề tài

2 Mục đích nghiên cứu

3 Mục tiêu nghiên cứu

4 Nội dung

4.1 Khái quát về quá trình cố định đạm

4.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định đạm Rhizobium

4.3 Ứng dụng

5 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Phần II: Nội dung

1 Khái quát về quá trình cố định đạm

2 Tổng quan về vi khuẩn cố định đạm Rhizobium

2.1 Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium

2.2 Cơ chế cố định đạm của vi khuẩn Rhizobium

2.2.1 Sự hình thành nốt sần ở rễ cây họ đậu

2.2.2 Enzym Nitrogenase

2.2.3 Cơ chế cố định đạm

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm

2.4 Vai trò của vi khuẩn Rhizobium

3 Ứng dụng

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Phần III: Kết luận và đề nghị

Tài liệu tham khảo

I Phần mở đầu

1 Lí do chọn đề tài

Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và ngay cả các loài vi sinh vật Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, riêng trong không khí, nitơ chiếm 78,16% Người ta ước tính rằng, trong bầu khí quyển chứa tới 4x105 tấn nitơ, trên mỗi km2 đất đai có khoảng 8.000.000 tấn nitơ Số lượng nitơ này đủ thỏa mãn cho nhu cầu về nitơ của cây trồng trên mảnh đất đó (với thu hoạch 20 tạ/hecta) trong khoảng 80 triệu năm Thế nhưng cây trồng lại không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn nitơ lớn lao này Sở dĩ như vậy vì trong không khí, phân tử nitơ tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ ba dây nối rất bền vững (N≡N) Mặc dù rất cần nguyên tố này nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO3- và NH4+

Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có hai con đường chính là hóa học và sinh học Trong con đường hóa học, con người phải cung cấp các điều kiện để phá vỡ các liên kết ba này như nhiệt độ cao (khoảng 1000oC),

áp suất lớn (vài trăm đến 1000 atm),lại đòi hỏi nhiều chất xúc tác và thiết bị đắt tiền cũng như hiệu quả không cao Năm 1995, phân đạm hóa học sản xuất được khoảng 20 triệu tấn; năm 2013, sản xuất được 198,4 triệu tấn Bằng cách bón phân nitơ con người mới chỉ trả lại cho đất 50% Ngoài ra, việc sủ dụng quá nhiều phân đạm vô cơ đã làm cho môi trường đất và nước

bị ô nhiễm, hàm lượng nitrate tích lũy trong nhiều loại sản phẩm nông

nghiệp gây ảnh hưởng đến sứ khỏe con người và thậm chí có thể gây ung thư khi biến dổi thành nitrite Trong con đường sinh học, vi sinh vật có thể

cố định nitơ trong không khí và cung cấp cho cây trồng Chính vì vậy mà vai trò của các vi sinh vật cố định nitơ có một ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp nói chung và cây đậu nói riêng Những nghiên cứu gần đây cho biết tổng số nitơ cố định được bởi vi sinh vật trên toàn thế giới là hơn 200 triệu tấn/năm Đặc biệt, các vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh trong cây

họ đậu (Rhizobium) đóng góp hơn 80 triệu tấn/năm, chúng có thể cố định được 80-300 kg N/ha

Từ việc nhận thấy vai trò quan trọng của vi khuẩn Rhizobium đố với nông nghiệp, tôi chọn đề tài Nghiên cứu cơ chế cố định Nitơ của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium ở cây họ đậu và ứng dụng để tìm hiểu rõ hơn về cơ chế của quá trình cố định đạm và ứng dụng trong cuộc sống

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm hiểu cơ chế cố định Nitơ của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium

- Tìm hiểu vai trò của chế phẩm phân vi sinh có nhiễm vi khuẩn cố định đạm trong nông nghiệp

3 Mục đích nghiên cứu

- Hoàn thiện kiến thức về vi khuẩn cố định đạm sống cộng sinh trên cây họ đậu và ứng dụng của nó trong nông nghiệp

II Nội dung

1 Khái quát về quá trình cố định đạm

Quá trình cố định đạm (quá trình cố định N) là quá trình sinh hóa đặc trưng riêng của một số vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật trong các nốt sần hoặc sống tự do trong đất, nước Chúng sử dụng nitơ trong khí quyển để chuyển thành NH3 Có thể xếp chúng thành 3 nhóm lớn[3]:

- Vi sinh vật cộng sinh, chủ yếu thuốc về họ vi khuẩn nốt sần

- Vi khuẩn sống tự do gồm rất nhiều loại khác nhau

- Vi khuẩn lam

2 Tổng quan về vi khuẩn cố định đạm Rhizobium

2.1 Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium

Dựa vào tốc độ phát triển trên môi trường thạch đặc nhân tạo, vi khuẩn nốt sần được chia thành hai loại:

- Loại mọc nhanh (Rhizobium): Ví dụ như Rhizobium meliloti, sống cộng sinh với cây đậu xanh, đậu Hà Lan, đậu tằm, Loại này có chu kì sinh trưởng 2-4 giờ Trên môi trường thạch đĩa tạo khuẩn lạc đường kính 2-4 mm sau 3-5 ngày nuôi cấy[1]

- Loại mọc chậm (Bradyrhizobium): như

Bradyrhizobium japonicum sống cộng sinh với cây đậu tương, đậu đũa, Loại này có chu kì sinh trưởng 6-8 giờ Khuẩn lạc hình thành trên môi trường thạch đĩa sau 5-7 ngày nuôi cấy Đường kính khuẩn lạc nhỏ không quá 1 mm[1]

Vi khuẩn Rhizobium là loại vi khuẩn đơn bào có trong đất, có thể xâm nhiễm vào rễ cây họ đậu tạo thành nốt

sần cho nên còn gọi là vi khuẩn nốt sần Vi khuẩn

Rhizobium thuộc loại vhui khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, kích thước 0,5-0,9 x 1,2-3 micromet Khi còn non

có khả năng di động nhờ tiên mao, không có bào tử, sinh sản bằng cách phân bào[1]

Vi khuẩn Rhizobium thuộc loại vi khuẩn nhuộm gram

âm, phát triễn tốt ở nhiệt độ 28-30oC, pH 6,5-7,0 Trên môi trường đặc, Rhizobium thường tạo khuẩn lạc tròn, lồi, mép nhăn, bóng, nhầy, đục không màu Khi già vi khuẩn trở nên bất động, lúc này vi khuẩn bắt màu từng đoạn khi nhuộm anilin Có lúc vi khuẩn tạo thành dạng hình cầu di động hoặc không di động Chúng sử dụng nhiều loại

đường, một vài axit hữu cơ, thậm chí cả polysacarit làm nguồn cung cấp năng lượng, có thể phát triễn trong môi trường nghèo đạm[1]

2.2 Cơ chế cố định đạm của vi khuẩn Rhizobium

2.2.1 Sự hình thành nốt sần ở rễ cây họ đậu

Người đầu tiên chứng minh rằng các cây họ đậu có thể sinh trưởng trong đất không chứa nitơ và chúng có khả năng sử dụng nitơ không khí là hai nhà khoa học Đức H Hellrigel và H Wilfard vào năm 1886 Hai năm sau (1888),

Hình 1 Khuẩn lạc Rhizobium

meliloti

nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijerinck đã phân lập được loại

vi khuẩn nốt sần ở rễ mốt số cây họ Đậu Ông đặt tên cho

vi khuẩn này là bacilulus radicicola Năm 1889 được đổi

tên thành Rhizobium (B.Frank, 1889)[4].

Cần lưu ý rằng mỗi loại vi khuẩn nốt sần thường chỉ

xâm nhiễm vào một số cây họ đậu, đó là tính chuyên hóa

của vi khuẩn nốt sần Cũng có trường hợp vi khuẩn nốt

sần xâm nhập được vào những loại đậu không đặc biệt đối

với chúng, khi đó chúng chỉ có thể tạo ra rất ít nốt sần hữu

hiệu và cố định nitơ rất yếu Có khoảng 57/969 loài ở họ

Đậu không có khả năng tạo nốt sần Nhân tố quyết định

tính chuyên hóa của vi khuẩn nốt sần tồn tại trên ADN của

chúng[2] Tính chuyên hóa này có thể bị dao động bởi

nhiều tác nhân: như bacteriocide (meloloticin triolicin,

phaseolicin ) do vi khuẩn tiết ra, có thể nâng cao tính

xâm nhiễm bằng cách đưa nhiều lần vi khuẩn vào thực

vật, xử lí phóng xạ, dòng điện, conxixin [3]

Nốt sần hữu hiệu

Nốt sần vô hiệu

Hình 2 Nốt sần trên rễ cây đậu

Con đường xâm nhiễm ở rễ các cây họ đậu bắt nguồn từ lông hút, đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ Mỗi loại cây đậu thường tiết ra chung quanh bộ rễ của mình những chất kích thích sự phát triễn của các vi khuẩn tương ứng Muốn cho quá trình xâm nhiễm nhanh, cần đạt tới mật độ

104 tế bào/g đất[3]

Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn nốt sần, rễ cây họ đậu tiết

ra enzym polygalacturonaza, nó phá hủy thành tế bào lông hút giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ, trong lông hút vi khuẩn nốt sần sẽ tạo thành dây xâm nhập, đó là một khối chất nhầy dạng sợi[2], tại lông hút chúng phát triễn thành đường xâm nhập, những đường này được bao bọc bởi màng mỏng xenlulaza, đường xâm nhập tiếp tục luồn sâu qua những tế bào biểu bì vào đến vỏ rễ với tốc

độ 5-8 Mm/s, vi khuẩn đi đến đâu được bao bọc bởi màng chất nguyên sinh của tế bào chủ với sắc tố leghemoglobin

- nó gần giống với hemoglobin của tế bào máu, nó cố định oxy giúp cho vi khuẩn hiếu khí phát triễn trong điều kiện kị khí Ở tế bào vỏ rễ, vi khuẩn kích thích các tế bào nhân lên nhanh chóng, với sự tham gia của các đoạn gen vi khuẩn, làm những tế bào này thành các tế bào tứ bội, tế bào tứ bội phát triễn nhanh tạo thành đường xâm nhiễm chằng chịt, kết cục là tạo ra nốt sần Trong các nốt sần hữu hiệu này các vi khuẩn biến dạng: phình to lên (10-12 lần) có hình côn, hình chùy, giọt nước, thể chữ V, chữ X,

mà người ta gọi là thể giả khuẩn (bacteroid) Trong nốt sần

vô hiệu vi khuẩn vẫn có dạng hình que, kích thước bé và nốt sần có màu trắng[3]

Vi khuẩn nốt sần hữu hiệu thường tạo nên những nốt sần lớn và tập trung trên rễ cái của cây đậu Còn vi khuẩn

vô hiệu thì thường tạo nên những nốt sần nhỏ phân tán trên khắp bộ rễ Nốt sần tạo nên bởi các vi khuẩn hữu hiệu thường có màu hồng, sắc tố hồng thuộc loại heamin Sắc

tố này tồn tại trong tế bào của tế bào thực vật chứ không phải tế bào vi khuẩn Ở các cây đậu một năm khi đã kết thúc quá trình cố định nitơ, người ta nhận thấy màu hồng

ở các nốt sần sẽ chuyển thành màu lục Khi đó một số dây nối metin ở vòng pocrhirin của sắc tố bị rách ra và liên kết oxy Ở các cây đậu nhiều năm, hiện tượng này không xảy ra[2]

Ở nốt sần trưởng thành, người ta có thể thấy rõ ba vùng sau đây:

- Vỏ nốt sần: Gồm một vài lớp té bào không bị vi khuẩn xam nhiễm Những tế bào này thường có kích thước nhỏ hơn các tế bào vỏ rễ Sau khi hình thành

Hình 3 Hình ảnh nốt sần và quá trình vi

khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ

vỏ nốt sần phần vỏ rễ sẽ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần[2]

- Vùng phân cắt mạnh mẽ: Vùng này cũng gồm những

tế bào không bị xâm nhiễm, nằm bên dưới lớp vỏ nốt sần Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hóa

và tạo thành các tế bào vỏ nốt sần, các tế bào chứa

vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn[2]

- Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn với các- tế bào không chứa vi khuẩn Thể tích của mỗi tế bào chưa vi khuẩn có thể lớn gấp 8 lần so với tế bào không chứa

vi khuẩn[2]

- Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần bắt đầu phát triển, một số tế bào nằm giữa phần vỏ nốt sần

và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hóa và phân cắt thành các tế bào mạch dẫn của nốt sần Về sau các mạch dẫn này sẽ liên kết với hệ thống mạch dẫn của

rễ cây[2]

2.2.2 Enzym Nitrogenase

Nitrogenase chứa 2 loại protein molybdoferredoxin và azoferredoxin

Ở hầu hết vikhuẩn, các điện tử được chuyển từ NAD(P)H hoặc pyruvate đến ferredoxin, một FeS protein Nếu Fe trong ferredoxin thiếu sẽ được thay thế bởi flavodoxin, một flavoprotein Azoferredoxin chuyển điện tử từ sự khử flavodoxin (hoặc ferrodoxin) đến molybdoferredoxin[5]

Molybdoferrodoxin là một tetramer gồm 2 chuỗi alpha và 2 chuỗi beta Các tiểu đơnvị alpha và beta tương tự nhau nhưng khác nhau là được

mã hóa bởi gen hai gen khácnhau (nifK và nifD) Mỗi tetramer chứa 2

nguyên tố Mo và nhiều nhóm FeS Molypden này là một phần cofactor của phân tử trọng lượng thấp có chứa Mo liên kết với cụm Fe7S8 và

homocitrate Cofacter MoFe này là duy nhất trong cố định đạm và nó khác vớicác cofactor Mo-protein của Mo protein khác (như nitrate reductase, xanthineoxidase)[5]

Azoferredoxin là một dimmer của các tiểu đơn vị giống nhau được mã hóa bởi gen nifH và chưa một nhóm Fe4S4 duy nhất cho mỗi dimmer

Azoferrdoxin được biến đổi bởi NifM protein Molybdoferrodoxin từ một chi (gennus) thường có thể tương tác với các azoferredoxin từ các chi khác nhau cho hoạt động enzym Hai loại protein này có nhiều tên khác nhau[5]: Molybdoferredoxin = thành phần I, MoFe protein, hoặc "nitrogenase"

Azoferredoxin = thành phần II, Fe protein, hoặc "reductase nitrogenase"

Một số chức năng cụ thể của gene nif được đề cập dưới dây Cácgene

mã hóa nifHDK, protein cấu trúc cơ bản của enzyme nitrogenase Các sản phẩm gene khác được mã hóa bởi cụm nif (nifV, nifEN, nifH) này là cần thiết

cho sự tổng hợp của Fe-Mo-cofactor, một thành phần thiết yếu của enzyme giúp cho việc gắn với cơ chất và thực hiện phản ứng Sự hình thành các cụm Fe-S nằm ở các vị trí khác trong enzyme có liên quan đến vận chuyển điện

tử đến cofactor (NifU, NifS) và tham gia vào các khía cạnh khác của sự trưởng thành enzyme Thêm vào đó là một cụm, nằm ở nơi khác

trong bộ gene của A vinelandii, trong đó bao gồm nifL và, nifA trong một

operon mã hóa cho protein điều hòa NifL và NifA, và các protein khác tham gia vào tổng hợp cofactor của nitrogenase và chế biến Mo (sản phẩm

của operon nifB, fdxN, nifO, nifQ) NifL cản trở sự biểu hiện của các gennif

khác nếu hàm lượng cao của ammonia và oxy có mặt, điều kiện đó tương ứng, hoặc sẽ làm cho nitrogenase không cần thiết cho sự tăng trưởng hoặc trở nên không hoạt động Protein NifL, mang một cofactor flavin, ức chế

hoạt tính của NifA, nhưng lại hoạt hóa phiên mã của các gen nif và operon khác dưới điều kiện này (Dixon, 1998) Sự hiện diện của gen nif là đặc điểm

của các vi khuẩn cố định đạm (diazotroph)[5]

Các protein Nif (liên quan đến cố định nitơ) thường được gọi bằng tên của các gen[5]:

nifJ = pyruvate flavodoxin reductase nifF = flavodoxin

nifH = azoferredoxin nifM = quá trình chế biến NifH protein nifK, D = molybdoferredoxin

nifB,N,E,V,W,Z = tổng hợp MoFe cofactor nifY = sự gắn MoFe cofactor

nifQ = thu hút các molybdenum

nifA,L,R = điều hòa

nifU,S = Trung tâm tổng hợp kim loại (metal center biosynthesis) nifX,T = chưa rõ chức năng

Giảm sự cân bằng

2.2.3 Cơ chế cố định đạm của vi khuẩn

Rhizobium

Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzym

nitrogenase theo phương trình sau[5]:

N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16Pi

Cơ chế cố định đạm có thể được tóm tắt như sau (Sylvia

và cộng sự, 1999):

- Dinitrogenase reductase nhận các electron từ chất khử yếu, chẳng hạn như ferrodoxin hoặc flavodoxin

và liên kết với hai phức hợp MgATP

Sơ đồ 2.2.2 Vai trò của các thành phần

trong enzym nitrogenase

- Phức hợp này được chuyển electron cùng một lúc cho dinitrogenase

- Dinitrogenase reductase và dinitrogenase từ một phức hợp, điện tử được chuyển và 2 MgATP được thủy phân thành MgADP + Pi

- Dinitrogenase reductase và dinitrogenase tách ra và quá trình này được lặp đi lặp lại

- Khi dinitrogenase đã nhận đủ các điện tử, nó liên kết với phân tử N2, khử N2 thànhamoni

- Dinitrogenase sau đó nhận thêm điện tử từ

dinitrogenase reductase để lập lại chu kì

Các nhóm NH3 (được hấp thu dưới dạng NH4+ hay NO3-) sau khi được cây hấp thu sẽ tham gia các quá trình chuyển hóa các chất trong cây như sau[3]:

- Axit α xetoglutaric + NH3 + NADPH + H+ → Axit

glutamic + H2O

- Axit glutamic + ATP + NH3 → Glutamine + ADP + P

- Axit aspartic + NH3 → Asparagine + AMP + P-P

Sơ đồ 2.2.3 Sơ đồ quá trình cố định nitơ

phân tử

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định

đạm

Mối quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây họ đậu cũng như hoạt tính cố định nitơ của chúng chịu ảnh

hưởng của một số điều kiện ngoại cảnh sau đây:

- Độ ẩm của đất: Nốt sần thường chỉ được tạo thành ở những đất có độ ẩm khoảng 40-80% so với độ ẩm tuyệt đối Độ ẩm thích hopwh nhất là 60-70% Khi nốt sần đã hình thành rồi thì độ ẩm có cao hơn cũng không ảnh hưởng mấy đến hoạt động của chúng Mức độ phản ứng đối với độ ẩm cũng tùy theo loại vi

khuẩn và loại cây Chẳng hạn Medicago rất mẫn cảm đối với sự khô cạn, trong đó thì Ornobrychis lại có thể

tạo thành nốt sần ngay cả ở những nơi có độ ẩm rất thấp [2]

- Độ thoáng khí: Trong thí nghiệm trồng cây họ đậu với

kĩ thuật tách rễ ra thành từng nhóm nuôi trong các dung dịch có độ thông khí khác nhau người ta nhận thấy nốt sần tạo thành rất nhiều ở những bình thông khí tốt Khi kém thông khí, người ta nhận thấy lượng chứa leghemoglobin trong nốt sần giảm đi một cách

rõ rệt Người ta cũng nhận thấy ở các lớp rễ càng sâu, số lượng nốt sần càng giảm [2]

- Nhiệt độ: Hoạt động cố định nitơ chỉ được thực hiện mạnh mẽ trong một phạm vi nhiệt độ xác định Phạm

vi này thay đổi đối với tùy loại cây trong họ đậu

Những cây thuộc vùng nhiệt đới có khả năng cố định nitơ cao hơn các cây cùng loài ở vùng ôn đới [2]

- pH của đất: Một số nghiên cứu cho biết nhiều loại đậu có thể mọc được ở phạm vi pH = 3,9-9,6, nhưng chỉ tạo được nốt sần ở phạm vi pH = 4,6-8,0 [2]

- Phân đạm: Khi cây còn non, chưa hình thành nốt sần thì việc bổ sung một lượng đạm thích hợp sẽ kích