PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM NGỌC HÀ Niên khóa : 2006 – 20010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT PHẠM NGỌC HÀ KS BIỆN THỊ LAN THANH Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Em xin gởi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh dạy, truyền đạt trang bị cho em kiến thức bổ ích suốt q trình học tập thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Như Nhứt cô Biện Thị Lan Thanh tạo điều kiện thuận lợi cho em có hội làm việc, học tập thực tốt đề tài tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn kỹ sư Đỗ Hoành Quân tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Anh người thầy, người bạn sẵn sàng giúp đỡ chia sẻ với em khó khăn, bế tắc thực đề tài Xin gởi lời cảm ơn đến: Những người bạn lớp DH06SH san sẻ buồn vui, học tập trao đổi kiến thức suốt thời sinh viên Toàn thể nhân viên Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường dạy, hỗ trợ cho tơi q trình thực đề tài Đặc biệt cho gởi lời biết ơn chân thành sâu sắc đến gia đình Mẹ bên cạnh, tin tưởng, ủng hộ chỗ dựa tinh thần vững cho để vững bước đến ngày hơm Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Phạm Ngọc Hà i TĨM TẮT Trong khí quyển, nitơ nguyên tố dồi nhất, chiếm tới 80 % thể tích khí quyển, nhiên thực vật lại sử dụng trực tiếp Một vấn đề cần đặt để sử dụng nguồn đạm phong phú cách hiệu hữu ích cho trồng Xuất phát từ ý tưởng trên, thực đề tài: “Phân lập, tuyển chọn thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”; với mục đích thu nhận chủng Azotobacter Azospirillum có khả cố định đạm tốt để biến nitơ khí thành dạng nitơ hữu ích cho trồng Để thực mục đích trên, chúng tơi sử dụng số phương pháp sau: phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân lập làm thuần, xác định mật độ tế bào phương pháp đo độ đục, xác định nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl Với phương pháp trên, thu nhận số kết sau: phân lập 20 chủng môi trường đặc trưng cho Azotobacter 30 chủng môi trường đặc trưng cho Azospirillum Trong đó, chọn hai chủng có đặc trưng giống với Azotobacter có kí hiệu Az 2.2 Az 5.1 phát triển cố định đạm tốt môi trường Fedorow với nguồn carbon - 2,5 % mannitol, pH tối ưu - 8, thời gian ni cấy thích hợp 120 Hai chủng chọn lọc khác có đặc điểm tương tự với giống Azospirillum có kí hiệu As 2.5 As 4.1; chúng phát triển cố định đạm tốt môi trường NFb với nguồn carbon % sucrose, pH tối ưu - 7,5, thời gian ni cấy thích hợp 120 ii SUMMARY In the atmosphere, nitrogen is one of the abundant elements, occupy 80% of the atmosphere volumn However, plants are not able to absorb directly The problem is offered is how to use the rich source of nitrogen efficiently and to be useful for plants Therefore, we carried out the thesis “ Isolation, selection and collection biomass free nitrogen-fixing organism” to collect Azotobacter and Azospirillum strains and to produce bioproduct being able to fix nitrogen well to transfer from molecular nitrogen in the atmosphere to useful nitrogen for plant For the above purpose, some main methods were used There included collecting sample, isolating and homogenizing, determining cellular density by the optical density method, determining total nitrogen the Kjeldahl method By the mentioned methods, we collected results such as: isolated 20 strains by Azotobacter’s selective medium and 30 strains by Azospirillum’s selective medium There were strains having specific characteristics similar to Azotobacter They were named Az 2.2 and Az 5.1 developing and fixing nitrogen well in Ferodow medium with - 2,5 % mannitol, optimal pH - 8, and a 120-hour incubation period was Two different selected strains named As 2.5 and As 4.1 had specific characteristics similar to Azospirillum; they developed and fixed nitrogen fairly well in NFb medium with 1% sucrose, optimal pH 7,5, a 120-hour incubation period Key words: Azotobacter, Azospirillum, free nitrogen-fixing organism iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn nitơ tự nhiên 2.2 Vai trò nitơ thực vật 2.3 Q trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 2.3.1 Q trình khống hóa 2.3.2 Quá trình phản nitrat hóa 2.3.3 Quá trình cố định nitơ phân tử 2.4 Đại cương vi khuẩn cố định nitơ 2.4.1 Phân loại 2.4.2 Đặc điểm 2.4.3 Vai trò vi khuẩn cố định nitơ tự nhiên 2.5 Đặc điểm số loài vi sinh vật cố định đạm 2.5.1 Azotobacter a Đặc điểm hình thái b Đặc điểm phân loại 10 c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 11 2.5.2 Azospirillum 14 iv a Đặc điểm hình thái 14 b Đặc điểm phân loại 15 c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16 2.6 Ứng dụng Azotobacter Azospirillum 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu 21 3.2.1 Mẫu thí nghiệm 21 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 21 3.2.3.Các mơi trường dùng cho thí nghiệm 21 3.3 Phương pháp thí nghiệm 22 3.3.1 Tăng sinh vi khuẩn 22 3.3.2 Phương pháp định lượng vi sinh vật 23 3.3.3 Định lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl 23 3.3.4 Thí nghiệm 1: phân lập làm 24 3.3.4.1 Lấy mẫu 24 3.3.4.2 Phân lập Azotobacter 24 3.3.4.3 Phân lập Azospirillum 24 3.3.5 Thí nghiệm 25 3.3.6 Thí nghiệm 25 3.3.6.1 Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram 25 3.3.6.2 Khảo sát số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn chọn lọc 26 a Thử nghiệm khả sử dụng carbon 26 b Thí nghiệm xác định quan hệ oxy 26 c Thử nghiệm oxydase 27 d Thí nghiệm xác định khả tạo thành indol 28 e Thử nghiệm tính di động mơi trường thạch mềm 29 3.3.7 Thí nghiệm 29 a Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon 29 v b Khảo sát ảnh hưởng nồng độ carbon 29 c Khảo sát ảnh hưởng pH 30 d Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1.Kết 31 4.1.1.Thí nghiệm 1: phân lập làm 31 4.1.2 Thí nghiệm 33 4.1.3 Thí nghiệm 36 4.3.5 Thí nghiệm 38 a Ảnh hưởng nguồn carbon 38 b Ảnh hưởng nồng độ carbon 42 c Ảnh hưởng pH 46 d Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 49 4.2 Thảo luận 53 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ACC deaminase 1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase ADP Adenosin diphosphate ATP Adenosin triphosphate CRA Congo Red Agar GA3 Giberrellic acid IAA Indole-3-acetic acid ILA Indole lactic acid NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical density TMPD N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng nitơ cố định Bảng 2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 13 Bảng 2.3 Các loài Azospirillum 16 Bảng 2.4 Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa 18 Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Giá trị pH 20 mẫu đất thu thập 31 Bảng 4.2 Danh mục chủng vi sinh vật 32 Bảng 4.3 Danh mục chủng vi sinh vật 33 Bảng 4.4 Hàm lượng nitơ 20 chủng 34 Bảng 4.5 Hàm lượng nitơ 30 chủng 35 Bảng 4.6 Kết nhuộm Gram 37 Bảng 4.7 Kết thử nghiệm sinh lý, sinh hóa 38 Bảng 4.8 Hàm lượng nitơ tổng số 38 Bảng 4.9 Mật độ tế bào chủng Az 39 Bảng 4.10 Hàm lượng nitơ tổng số 40 Bảng 4.11 Mật độ tế bào chủng As 41 Bảng 4.12 Hàm lượng nitơ tổng số 42 Bảng 4.13 Mật độ tế bào chủng Az 43 Bảng 4.14 Hàm lượng nitơ tổng số 44 Bảng 4.15 Mật độ tế bào chủng As 45 Bảng 4.16 Hàm lượng nitơ tổng số 46 Bảng 4.17 Mật độ tế bào chủng Az pH 47 Bảng 4.18 Hàm lượng nitơ tổng số chủng As pH 48 Bảng 4.19 Mật độ tế bào chủng As pH khác 48 Bảng 4.20 Hàm lượng nitơ tổng số 49 Bảng 4.21 Mật độ tế bào thời gian khác chủng Az 50 Bảng 4.22 Hàm lượng nitơ tổng số 51 Bảng 4.23 Mật độ tế bào thời gian khác chủng As 52 viii B TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 11 Abbas Akbari Gh., Seyyed Mehdi Arab, Alikhani H.A, Allahdadi I., and Arzanesh M.H 2007 Isolation and Selection of Indigenous Azospirillum sp And the IAA of Superior Strains Effect on Wheat Roots World Journal of Agrricultural Sciences, Vol 3, No 4, p 523-529 12 Baldani, V.L.D and J Döbereiner 1980 Host-plant specificity in the infection of cereals with Azospirillum spp Soil Biol Biochem., Vol 12, p 433-439 13 Barbara Reinhold, Thomas Hurek, Ernst-Georg Niemann, and Istvan Fendrik 1986 Close association of Azospirillum and diazotrophic rods with different root zone of kallar grass Applied and evironmental microbiology, Vol 52, p 520-526 14 Enrique A Rodríguez Cáceres 1982 Improved medium for isolation of Asospirillum spp American society for microbiology, Vol 44, No 4, p 990991 15 George J Sorger 1968 Regulation of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii OP and in an apparently partially constitutive mutant Journal of bacteriology, Vol 95, No 5, p 1721-1726 16 Mohammad Abdus Sattar, Mohammad Fazlar Rahman, Dipak Kumar Das, and Abu T.M.A Choudhury 2001 Prospects of using Azotobacter, Azospirillum and cyanobacteria as supplements of urea nitrogen for rice production in Bangladesh Journal 2, No 2, p 122-127 17 N Tejera, C Lluch, M V Martinez-Toledo, and J Gonzalez-Lopez 2005 Isolation and characterization of Azotobacter and Azospirillum strains from the sugarcane rhizosphere Plane and soil, Vol 270, p 223-232 18 Premsekhar, M and Rajashree, V 2009 Influence of bio-fertilizers on the growth characters, yield attributes, yield and quality of tomato AmericanEurasian Journal of sustsinable agriculture, Vol 3, No 1, p 68-70 19 Rajeswari K and Mangai Kasthuri G 2009 Molecular characterization of Azotobacter spp nifH gene isolated from marine source African journal of biotechnology, Vol 8, No 24, p 6850-6855 20 Rolf D.Joerger, Telissa M.Loveless, Richard N.Pau, Lesley A Mitchenall, Benjamin H Simon, and Paul E Bishop 1990 Nucleotide saquences and mutational analysis of the structural genes foe nitrogenase of Azotobacter vinelandii Journal of bacteriology, Vol 172, No 6, p 3400-3408 21 Yoav Bashan and Gina Holguin 1996 Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances Can J Microbiol., Vol 43, p 103120 C TÀI LIỆU TỪ MẠNG INTERNET 22 http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ctt/ChuyenTrang/DMPhanbon.aspx?idnhom19 23 http://d.violet.vn/uploads/resources/415/185672/preview.swf 60 24 http://www.wattpad.com/107658-qu-tr-nh-ph-n-nitrat-h-a- 25 http://www.nature.com/nrmicro/journal/v2/n8/fig_tab/nrmicro954_F1.html 26 http://bioclub.forumotion.com/forum-f13/topic-t43.htm 27 http://www.answers.com/topic/azotobacter-1 28 http://www.google.com.vn/imglanding 29 http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/vikhuan-contrung/20071_Codinh-ni-to-moi-quan-he-giua-thuc-vat-va-vi-khuan-Phan-1.aspx 30 http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen_fixation 61 PHỤ LỤC A Thành phần mơi trường thí nghiệm Thành phần môi trường NFb DL-malic acid 5g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,2 g KOH 4g NaCl 0,1 g CaCl2 0,02 g Agar 1,75 g Dung dịch vi lượng (dạng vết) ml Dung dịch alcoloic Bromothymol Blue (5%) ml Fe EDTA ml Dung dịch vitamin ml pH = 6,8 (điều chỉnh NaOH) Nước cất 1000 ml - Thành phần dung dịch vi lượng: Na2MoO4.2H2O 200 mg MnSO4.H2O 235 mg H3BO3 280 mg CuSO4.5H2O mg ZnSO4.7H2O 24 mg Nước cất 200 ml - Thành phần dung dịch vitamin: Biotin 10 mg Pyridoxine 20 mg Nước cất 100 ml Thành phần môi trường Ashby Mannitol glucose 20 g K2HPO4 0,2 g MgSO4.7H2O 0,2 g NaCl 0,2 g CaSO4 2H2O 0,1 g CaCO3 5g Nước cất vơ đạm vừa đủ lít pH = 6,8-7 Agar 15 -20 g Thành phần môi trường CRA DL-malic acid 5g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,2 g KOH 4,5 g NaCl 0,1 g Agar 15-20 g Yeast extract 0,5 g FeCl3.6H2O 0,015 g Dung dịch đỏ congo (0,25%) 15 ml pH = 7,0 Nước cất 1000 ml Thành phần môi trường Fedorow Mannitol 20 g K2HPO4 0,3 g CaHPO4 0,2 g MgSO4.7H2O 0,3 g K2SO4 0,2 g NaCl 0,5 g FeCl3 6H2O 0,1 g CaCO3 5g Dung dịch vi lượng ml Nước cất 1000 ml - Thành phần dung dịch vi lượng: H3BO3 5g (NH4)2MoO4.H2O 5g KI 0,5 g NaBr 0,5 g ZnSO4.7H2O 0,2 g Al2(SO4)3.18H2O 0,3 g Nước cất 1000 ml Thành phần môi trường thạch - thịt - pepton - glucose Cao thịt 3g Pepton 10 g Glucose 2g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,5 g NaCl 0,5 g Fe2(SO4)3 0,02 g (NH4)2SO4 0,1 g Nước 990 ml Thạch 20 g Thành phần môi trường pepton Pepton 10 g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH = 7,5 B Phương pháp thí nghiệm Cách lấy mẫu Mẫu đất rễ lấy nơi có độ ẩm cao giàu chất hữu Tại địa điểm, mẫu lấy độ sâu cách mặt đất khoảng 10 - 20 cm, cho vào túi nylon vơ trùng để lưu mẫu, vị trí lấy mẫu cách km Các mẫu chuyển phòng thí nghiệm, xử lý mẫu tiến hành phân lập môi trường vô đạm Phương pháp định lượng vi sinh vật ™ Tăng sinh vi khuẩn theo mục 3.3.1 ™ Sau đó, đem pha lỗng dịch ni cấy để đạt giá trị ∆OD600nm từ 0,2 đến ™ Ở giá trị ∆OD600nm, xác định mật độ tế bào phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn môi trường thạch đĩa (Ashby CRA) (CFU/ml) Pha loãng 1ml dịch canh trường nuôi cấy với ml nước muối sinh lý (0,85 %) ta có nồng độ 10-1 , sau thực tương tự ta nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 105… Cấy 0,1 ml mẫu pha lỗng vào đĩa petri chứa mơi trường Cấy độ pha loãng liên tiếp, độ pha loãng cấy đĩa Trải dung dịch bề mặt đĩa khô mặt thạch Lật ngược đĩa ủ nhiệt độ phòng khoảng 72 Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa Chọn đĩa khoảng 20 - 250 khuẩn lạc/đĩa để tính kết Tính số lượng tế bào ml môi trường: Ni = A.10.di Trong đó: Ni : số lượng tế bào độ pha loãng di A : số khuẩn lạc đếm đĩa di : độ pha loãng ™ Dựng đường tương quan tuyến tính OD600nm log (N/ml) Excel Định lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl Q trình gồm giai đoạn ¾ Giai đoạn 1: Vơ hóa mẫu ™ Ngun tắc: tất chất đạm có nguyên liệu dù nằm dạng (hữu cơ, vô cơ, protein) chuyển thành hợp chất vô (NH4)2SO4 cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc chất xúc tác H2SO4 đậm đặc (NH4)2SO4 Chất đạm Xúc tác, t ™ Cách tiến hành: hút 10 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào bình Kjeldahl Thêm vào khoảng 0,5 g chất xúc tác K2SO4/CuSO4 ml H2SO4 đậm đặc Đun sôi hỗn hợp tủ hút khí độc khoảng 2-3 dung dịch có màu xanh da trời nhạt suốt Để nguội pha loãng thành 100 ml với nước cất vô đạm Thực lần thử khơng (dịch mơi trường khơng có vi khuẩn) lần thử thật với dịch khuẩn ƒ a: Bình cầu ƒ b: Bình rửa ƒ c: Bình phản ứng ƒ d: Ống làm lạnh ƒ e: Phễu ƒ f: Bình đựng mẫu Hình Cấu trúc máy Parnas - Wargner ¾ Giai đoạn 2: Cất đạm Đốt bình cầu a sôi, rửa máy cất đạm, tiến hành cất đạm cách sau: Đặt bình tam giác f có chứa 10 ml dung dịch H2SO4 N/100 giọt methyl đỏ, đặt vào vòi ống sinh hàn d, cho đầu nhọn ống sinh hàn nhúng chìm dung dịch Hút 10 ml dung dịch đạm vơ hóa pha lỗng cho vào phễu e máy cất đạm, mở khóa cho vào bình c từ từ hết, tráng phễu e lần, lần với nước cất cho xuống bình c Cho 10 ml dung dịch NaOH đậm đặc cho xuống bình c từ từ, tráng nước cất (mỗi lần cần chừa lại để hệ thống kín) Để máy lơi vòng phút hạ bình tam giác xuống, để thêm phút Rửa vòi tia nước cất (nước rửa cho vào bình tam giác) Rồi lấy bình tam giác ra, định phân với dung dịch NaOH có chuẩn độ x.N/100 có màu vàng cam Thực mẫu thử thật, mẫu thử không để lấy trị số trung bình Phải xác định hệ số hiệu chỉnh x dung dịch NaOH N/100 dung dịch (COOH)2 N/100 ¾ Giai đoạn 3: Chuẩn độ tính tốn kết Lượng H2SO4 N/100 thừa chuẩn độ dung dịch NaOH N/100 Quá trình chuẩn độ kết thúc dung dịch chuyển từ tím đỏ sang vàng cam (như hình 3.1) Trước chuẩn độ Sau chuẩn độ Hình Sự chuyển màu dung dịch chuẩn độ từ tím đỏ sang vàng cam ™ Tính tốn kết Lượng nitơ tổng số có lít dịch ni cấy vi khuẩn ngun liệu: Gọi Vo thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình lần thử khơng) Gọi V1 thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình lần thử thật) Vậy ΔV = Vo - V1 lượng NaOH tương đương với lượng đạm ammoniac phóng thích 10 ml dung dịch vơ pha loãng mol ammoniac tương đương với mol NaOH Do số mol ammoniac phóng thích 10 ml dịch vơ hóa pha lỗng là: ΔV x (1/100) = ΔV.x.10-5 mol 1000 Số g đạm tổng số có 10 ml dịch vơ pha loãng là: 14 ΔV x 10-5 g Số gam đạm tổng số có 100 ml dung dịch vơ hóa pha lỗng hay 10 ml nguyên liệu: 14 ΔV x 10-5 100 10 = 14 ΔV x 10-4 g Số gam đạm tổng có lít nguyên liệu: 14 ΔV x 10-4 1000 = 0,14 ΔV x (g/lít) 10 Phương pháp nhuộm Gram Làm tiêu mẫu cần nhuộm ƒ Cố định mẫu cách hơ nhẹ lam qua lửa đèn cồn ƒ Nhuộm mẫu với crystal violet phút Rửa nước cất tối đa giây ƒ Thêm dung dịch Lugol (1 % iot, % KI) phút Rửa nước cất ƒ Rửa nhanh cồn 96o giọt cồn suốt sau rửa lại nước ƒ Nhuộm với safranin fuchsin phút Rửa nước cất Để khơ ƒ Quan sát kính hiển vi vật kính 100X (sử dụng giọt dầu soi) Hình Các bước nhuộn Gram Quan sát kết Gram âm: màu hồng Gram dương: màu xanh tím C Kết quả, số liệu Đường tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 2.2 Bảng Giá trị tương quan OD600nm mật độ tế bào Az 2.2 0,234 5,80 6,76 ∆OD600nm Mật độ tế bào (×106CFU/ml) LogN/ml 0,403 7,20 6,86 7,4 0,607 10,50 7,02 0,812 14,80 7,17 1,033 20,00 7,30 y = 0,6918x + 6,5952 7,3 R = 0,9969 LogN/ml 7,2 7,1 7,0 6,9 6,8 6,7 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Delta OD Hình Đồ thị tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 2.2 Đường tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 5.1 Bảng Giá trị tương quan OD600nm mật độ tế bào Az 5.1 ∆OD600nm Mật độ tế bào (×106CFU/ml) LogN/ml 0,212 4,60 6,66 0,408 7,10 6,85 0,621 9,40 6,97 0,803 12,80 7,11 1,039 17,80 7,25 y = 0,6972x + 6,539 7,3 R = 0,9923 7,2 LogN/ml 7,1 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Delta OD Hình Đồ thị tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 5.1 Đường tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào As 2.5 Bảng Giá trị tương quan OD600nm mật độ tế bào As 2.5 0,235 0,49 7,69 ∆OD600nm Mật độ tế bào (×108CFU/ml) LogN/ml 0,439 0,82 7,91 0,622 1,31 8,12 0,802 1,86 8,27 8,5 y = 0,9498x + 7,4917 8,4 R = 0,9903 0,989 2,51 8,40 LogN/ml 8,3 8,2 8,1 8,0 7,9 7,8 7,7 7,6 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Delta OD Hình Đồ thị tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào As 2.5 Đường tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 4.1 Bảng Giá trị tương quan OD600nm mật độ tế bào As 4.1 0,249 0,16 7,20 LogN/ml ∆OD600nm Mật độ tế bào (×108CFU/ml) LogN/ml 0,414 0,26 7,41 8,2 8,1 8,0 7,9 7,8 7,7 7,6 7,5 7,4 7,3 7,2 7,1 0,629 0,46 7,66 0,812 0,7 7,85 1,005 1,17 8,07 y = 1,1295x + 6,9367 R = 0,9986 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Delta OD Hình Đồ thị tương quan tuyến tính OD600nm mật độ tế bào Az 4.1 Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với nguồn carbon khác Bảng Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với nguồn carbon khác STT Độ pha loãng Chủng Rỉ đường Az 2.2 0,530 9,16 Az 5.1 0,150 4,40 Mannitol Az 2.2 0,866 15,64 Az 5.1 0,729 11,15 Az 2.2 0,786 13,76 Az 5.1 0,182 4,63 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 0,215 5,54 Az 5.1 0,648 9,78 Az 2.2 0 Az 5.1 0 Az 2.2 0,018 4,05 Az 5.1 0,025 3,60 Glucose Lactose Sucrose Malic acid Tinh bột ∆OD Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Nguồn carbon lần Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với nguồn carbon khác Bảng Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với nguồn carbon khác STT Độ pha lỗng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Nguồn carbon Chủng ∆OD Rỉ đường As 2.5 0,184 46,39 As 4.1 0,206 14,77 Mannitol As 2.5 0,211 49,16 As 4.1 0,198 14,45 As 2.5 0,199 47,94 As 4.1 0,203 14,66 As 2.5 0,235 As 4.1 0,244 As 2.5 0,748 As 4.1 0,862 81,34 As 2.5 0,677 136,37 As 4.1 0,747 60,24 As 2.5 0,020 32,41 As 4.1 0,017 9,02 Glucose Lactose Sucrose Malic acid Tinh bột 10 lần 51,81 16,30 159,10 Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với nồng độ carbon khác Bảng Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với nồng độ carbon khác Nồng độ mannitol (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 10 5,0 STT Độ pha loãng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Chủng ∆OD Az 2.2 0,242 28,93 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 0,216 0,286 0,263 0,300 24,48 31,03 26,38 29,93 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 0,288 0,388 0,321 0,381 0,346 0,380 0,308 0,379 0,294 0,279 0,280 0,251 0,266 0,244 0,263 27,48 31,74 28,97 36,14 30,12 32,84 28,38 36,14 27,73 30,70 27,10 29,36 26,53 29,04 26,40 lần Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với nồng độ carbon khác Bảng Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với nồng độ carbon khác STT Nồng độ sucrose (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 10 5,0 Độ pha loãng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Chủng ∆OD As 2.5 0,704 144,51 As 4.1 As 2.5 As 4.1 0,758 0,807 0,850 62,07 181,01 78,85 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 0,749 0,748 0,758 0,793 0,780 0,783 0,729 0,739 0,728 0,728 0,695 0,685 0,729 0,739 0,720 0,670 159,62 60,40 162,62 67,89 170,82 66,24 152,79 59,07 152,46 57,41 141,84 51,33 152,79 59,07 149,82 49,37 10 lần Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với giá trị pH khác Bảng Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az với giá trị pH khác STT Độ pha loãng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Giá trị pH Chủng ∆OD 5,0 Az 2.2 0,000 19,69 5,5 6,0 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 0,000 0,343 0,000 0,360 17,30 34,02 17,30 34,93 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 10 9,5 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 0,325 0,381 0,335 0,392 0,343 0,381 0,349 0,379 0,335 0,349 0,222 0,252 0,200 0,204 0,193 29,14 36,10 29,60 36,78 29,98 36,13 30,30 35,99 29,61 34,33 24,72 29,40 23,85 27,23 23,59 lần 10 Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với giá trị pH khác Bảng 10 Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As với giá trị pH khác STT ∆OD Độ pha loãng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Giá trị pH Chủng 5,0 As 2.5 0,010 31,71 5,5 6,0 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 0,011 0,017 0,036 8,88 32,16 8,64 33,53 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 10 9,5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 0,006 0,017 0,740 0,787 0,953 1,073 0,858 0,765 0,723 0,749 0,734 0,737 0,755 0,718 0,636 8,78 32,16 59,15 173,27 102,93 323,86 80,40 165,31 56,67 159,62 58,24 155,32 61,50 149,00 45,19 10 lần 11 Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az thời gian nuôi cấy khác Bảng 11 Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy Az thời gian nuôi cấy khác Thời gian nuôi cấy (giờ) 24 48 72 96 120 144 168 192 216 10 240 STT Độ pha lỗng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Chủng ∆OD Az 2.2 0,006 19,89 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 0,005 0,264 0,217 0,479 17,43 29,97 24,51 42,21 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 Az 2.2 Az 5.1 0,292 0,642 0,334 0,641 0,568 0,636 0,569 0,647 0,569 0,638 0,570 0,646 0,568 0,644 0,574 27,65 54,70 29,55 54,64 43,07 54,19 43,13 55,21 43,11 54,35 43,21 55,06 43,07 54,89 43,44 lần 12 Bảng giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As thời gian nuôi cấy khác Bảng 12 Giá trị ∆OD canh trường nuôi cấy As thời gian nuôi cấy khác STT Thời gian nuôi cấy (giờ) 24 48 72 96 120 144 168 192 216 10 240 Độ pha lỗng Mật độ tế bào (×106CFU/ml) Chủng ∆OD As 2.5 0,047 34,38 As 4.1 0,063 0,096 0,104 10,17 38,23 11,31 0,613 0,133 0,740 0,742 0,866 0,854 0,811 0,854 0,856 0,800 0,912 0,914 0,871 0,880 0,872 0,855 118,56 12,22 156,51 59,46 205,95 79,57 182,61 79,67 201,49 69,14 227,74 93,00 208,44 85,24 208,67 79,77 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 As 2.5 As 4.1 10 lần ... tuyển chọn thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do 1.2 Yêu cầu ™ Phân lập chủng Azotobacter Azospirillum có khả cố định đạm ™ Tuyển chọn thu nhận sinh khối số chủng vi khuẩn Azotobacter... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO Hướng... sinh vật tiết enzyme nitrogenase để thực trình sinh học đặc biệt - q trình cố định nitơ Nhóm vi sinh vật có khả thực q trình gọi vi sinh vật cố định nitơ Vi c sử dụng phân bón vi sinh chứa vi sinh