Phân bón vi sinh vật cố định đạm

thích sinh trưởng thực vật mà còn có các loại VSV có khả năng ức chế, tiêu diệt VSV gây bệnh cây trồng Các VSV được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất phân bón gồm các sinh vật cố định

Chủ đề: PHÂN BÓN VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP

I Mở đầu

II Vi khuẩn cộng sinh trong rễ cây họ đậu: Rhizobium

1 lịch sử phát triển

2 phân loại

4 vai trò

5 các yếu tố ảnh hưởng( nhiệt độ, pH…)

6 cơ chế hình thành nốt sần ở cây họ đậu

7 Quy trình sản xuất các chế phẩm Rhizobium,

Phân lập Rhizobium

8 Đánh giá hoạt tính sinh học

9 Phương pháp bảo quản

10 Quy trình sản xuất chung

11 Yêu cầu chất lượng đối với phân bón vsv cố định

đạm

12 Hiệu quả của phân vi khuẩn nốt sần

13 Tài liệu tham khảo

14 Lời cảm ơn đến thầy

I Mở đầu:

- Phân bón vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa VSV sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng

có thể sử dụng được (N,P, K, S, Fe,…) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất

lượng nông sản Phân VSV phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Phân VSV là sản phẩm có chứa không chỉ có các VSV làm phân bón như cố định nitơ, phân giải lân, kích

thích sinh trưởng thực vật mà còn có các loại VSV có khả năng ức chế, tiêu diệt VSV gây bệnh cây trồng Các VSV được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất phân bón gồm các sinh vật cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium, Bzadyrhizobium), sống tự do trong đất, nước (Azotobacter, Clostridium,

…),…

- Vậy trong tất cả các VSV được nghiên cứu và sản xuất phân bón thì các sinh vật cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium) là gần gũi và mang lại hiệu quả cao cho việc chăm sóc cây trồng và phát triển cây

II Rhizobium

1 Lịch sử phát triển

 Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố định nitơ phân tử Họ đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy được nitơ khí quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần( VKNS) sống ở vùng rễ cây họ đậu Họ đặt

tên cho loài vsv này là Bacillus radicicola

 Năm 1889, Pramovskii đã đổi tên vsv này thành Bacterium radicoicola

 Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium

 Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón

vi sinh cố định nitơ mà thànhphần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do, các xạ khuẩn có khả năng giải cellulose …

 Ở việt nam phân vsv cố định đạm cây họ đậu đã nghiên cứu

từ năm 1960 Đến năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh

2 Phân loại

Ở đây nhóm sẽ trình bày 2 cách phân loại Tất nhiên không có cách phân loại nào sai cả, mà là tùy theo từng

giai đoạn hay từng người mà người ta có những cách phân loại khác nhau

a) Cách phân loại thứ nhất:

Chia làm hai nhóm lớn(theo khóa phân loại Bergay’s:

Rhizobium thuộc họ Rhizobiuaceae)

- Nhóm I:

Rhizobium leguminosarum

Rhizobium meliloti

Rhizobium phaseolin

Rhizobium trifolii

- Đặc điểm nhóm I:

2-6 vòng tiêm mao, mọc nhanh trên môi trường chiết nấm men Di chuyển bằng 2-6 vòng tiêm mao

Khuẩn lạc dạng vòng, lồi, nửa sáng đục, mọc thẳng và

có dịch nhày, thường đường kính 2-4 mm trong vòng

3-5 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa khoáng, dịch chiết nấm men, manitol Hầu hết sử dụng nguồn carbon: glucose, sucrose Một vài loài cần biotin hoặc vitamin hòa tan

Rhizobium leguminosarum: gây ra sự hình thành nốt

sần ở các loài Pisum ssp ( đậu hà lan), Vicia ssp( đậu tằm)…

Rhizobium phaseolin: gây ra sự hình thành ở các loài

ôn đới

- Nhóm II

Rhizobium lupini

Rhizobium japonicum

Rhizobium ssp

- Đặc điểm nhóm II:

Tiêm mao ở đầu hoặc dưới thân, phát triển chậm trên môi trường dịch chiết nấm men

Chuyển động nhờ tiêm mao trên đầu hoặc dưới thân, không có tua viền

Khuẩn lạc dạng vòng, dạng chấm, đục, lồi và có dạng hạt trong cấu trúc Đường kính không vượt quá 1mm sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa khoáng, dịch chiết nấm men, manitol

b) Cách phân loại thứ 2:

Rhizobium có những loại quan trọng như:

R.phaseoly( ở đậu nành, đậu tây, đậu ngựa) R.leguminosarum( đậu hà lan)

R.trifolli(cỏ ba lá)

- Trong đó có một số chủng mọc chậm không làm acid

hóa môi trường nuôi cấy ) như R.phaseoli) và các

chủng mọc nhanh làm acid hóa môi trường nuôi

cấy( như R.leguminosarum )

3. Cấu tạo

- Rhizobium là một chi vi khuẩn gram âm sống trong đất

có vai trò cố định đạm

- Nghiên cứu của W.nowah, A.Netzsch-Lehner (1965) vi khuẩn có kích thước và hình dạng thay đổi phụ thuộc vào giai đoạn phát triển

- Khi vi khuẩn còn non, tế bào có dạng hình que, kích thước 0,5-0,9 x 2-3 Mm bắt màu đông đều, có khả năng

di động nhờ tiêm mao

- Khi nốt sần hữu hiệu trở nên già, Haemoglobin bị biến đổi thành Leghaemoglobin có sắc tố màu xanh, khi đó

nốt sần không còn khả năng cố định nitơ.

- Khi già, vi khuẩn nốt sần trở nên bất hoạt, khi đó vi khuẩn chuyển sang trạng thái bắt màu phân đoạn khi nhuộm bằng anili

- Khi sống trong đất hoặc trong lúc nuôi cấy, vi khuẩn nốt sần tạo dạng hình cầu di động hoặc không di động

- Trên môi trường nhân tạo cũng như những nốt sần ngta thường gặp những tế bào gọi là thể khuẩn giả So với tế bào hình que bình thường thì chúng có kích thước to hơn, thường phân nhánh

- Trong đất có đạm vô cơ, nốt sần hữu hiệu vẫn hình thành nhưng nhỏ và có đặc điểm gần như nốt sần vô hiệu Khi lượng đạm trong đất cạn, nốt sần hữu hiệu phát triển làm tăng kích thước và lại có khả năng cố định nitơ

- Điều này cần được chú ý đặc biệt trong sản xuất nông nghiệp Để phát huy tối đa hiệu lực của vi khuẩn nốt sần, không nên bón thúc đạm cho cây bộ đậu Bón thúc đạm vừa tốn kém lại không sử dụng được hiệu quả cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây bộ đậu

- Tế bào Rhizobium có kích thước 0,5-0,9 x 1,2-3,2

micromet

- Khuẩn lạc: trên môi trường đặc tạo khuẩn lạc trơn bóng, nhày, màu trắng Chất nhày này là một polysaccharide cấu tạo bởi hexose, pentose và acid uronic

4 Vai trò

- Thông qua cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium với rễ các cây họ đậu, quá trình cố định đạm sinh học được thực hiện, cây chủ sẽ lấy được nguồn đạm vô cơ cho sinh trưởng, ngược lại vi khuẩn sẽ có được các nguồn hydrat cacbon (đường, tinh bột) cho hoạt động sống

- Rhizobium hình thành một nhóm vi khuẩn cộng sinh cố định đạm sống trong rễ của các họ Đậu và Parasponia

Vi khuẩn này xâm chiến tế bào rễ của cây tạo thành các nốt rễ, ở đây chúng biến đổi nitơ trong khí quyển thành ammoniac và sau đó cung cấp các hợp chất nito hữu cơ như glutamin hoặc ureide cho cây Còn cây thì cung cấp các hợp chất hữu cơ cho vi khuẩn từ quá trình quang hợp

 Quan hệ cộng sinh này có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng nitơ , ổn định năng suất cây trồng và bền vững hệ sinh thái Lĩnh vực công nghệ

vi khuẩn cố định đạm Rhizobium đang được quan tâm, thu hút nhiều nghiên cứu và áp dụng cho nhiều cây trồng khác nhau

5.Các yếu tố ảnh hưởng

- Đa số vi khuẩn ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm : 6,5-7,5 Nếu pH từ 4.5-5 hoặc pH=8 thì sinh trưởng giảm

- Độ ẩm: 60-70%

- Nhiệt độ thích hợp: 24-26 độ Ở 37 độ thì sự phát triển của chúng cản trở rõ rệt

- Khi nuôi cấy vi khuẩn nốt sần trên các môi trường có đạm hữu cơ thì quá trình amon của chúng bị yếu đi Nuôi vi khuẩn trên môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng với hàm lượng đạm cao có thể làm mất khả năng xâm nhiễm và tạo nốt sần trên cây họ đậu

- Vì vậy các môi trường chứa nước chiết thực vật được dùng làm môi trường nuôi cấy cho chúng

6 Quá trình hình thành nốt sần rễ cây họ đậu

* Sự hình thành nốt sần

- Chỉ tiêu đánh giá nốt sần trong quá trình cộng sinh

là tính chất về hình thái, sinh lý, sinh hóa của nốt sần tạo nên ở rễ cây, thể hiện trong từng giai đoạn, từng mức độ cố định nitơ của hệ cộng sinh

- Giai đoạn đầu là giai đoạn xâm nhiễm của VKNS vào rễ cây họ đậu:

Vi khuẩn nốt sần thường xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua các lông hút và đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ Mỗi loại cây họ đậu thường tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích thích những chủng vi khuẩn nốt sần chuyên tính và ức chế những chủng không chuyên tính để thực hiện quá trình xâm nhiễm như các hợp chất gluxit, các axit amin, các axit hữu cơ (axit malic, axit asparaginic, )

- Nhiều tác giả cho rằng, VKNS có tính chuyên tính rất cao đối với cây họ đậu cùng chi Một số lại cho rằng chúng có tính chuyên tính thấp đối với cây họ đậu cùng chi

- Theo quan điểm thứ nhất người ta làm thí nghiệm thấy chủng ĐX1 (VKNS cây đậu xanh) nhiễm cho cây lạc không tạo được nốt sần ở lạc, còn theo quan điểm thứ hai thì chủng G3 (VKNS đậu tương) nhiễm cho cây lạc tạo được nốt sần

 - Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn nốt sần, cây hô đậu tiết ra enzym polygalacturonaza làm phá vỡ thành lông hút và giúp cho vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ Ở trong lông hút, vi khuẩn nốt sần sẽ tạo thành “dây xâm nhập”, đó là một khối chất nhày dạng sợi, bên trong chứa đầy vi khuẩn dạng hình que, “dây xâm nhập” đi dần vào bên trong với tốc độ khoảng

5 – 8 /s Sự vận động của “dây xâm nhập” được thực hiện dưới áp lực sinh ra do sự phát triển của VKNS bên trong dây Đến lớp nhu mô, VKNS kích thích các tế bào rễ cây phát triển và phân chia, vi khuẩn thoát ra khỏi “dây xâm nhập” và đi vào tế bào chất Ở đó chúng sinh sản rất nhanh

và tạo dạng giả khuẩn

* Cơ chế xâm nhập của Rhizobium vào rễ cây

- Cường độ cố định nitơ của từng loại cây trồng khác nhau thì khác nhau, vì vậy cho số lượng nốt sần khác nhau, thậm chí còn phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của cây: Cây đậu xanh có nốt sần sớm hơn ở các cây họ đậu đỗ khác (10 – 15 ngày có nốt sần) Cây đậu tương sau 20 -25 ngày có nốt sần, còn ở cây lạc có nốt sần 25 – 30 ngày sau khi cây mọc

- Số lượng nốt sần tổng số và nốt sần hữu hiệu ở cây đậu đỗ đạt cực đại vào thời Kỳ cây ra hoa, hình thành quả non và giảm dần đến cuối vụ thu hoạch

Cây họ đậu

Hệ cộng sinh

Rhizobium

Tạo nốt sần

Không tạo nốt sần

Nốt sần hữu hiệu

Nốt sần vô hiệu

Ký sinh

Nốt sần to

Nốt sần trung bình

Nốt sần bé Nốt sần vô hiệu

7.Quy trình sản xuất và phân lập

a) Quy trình phân lập:

o Nguồn phân lập: các cây họ đậu như đậu nành, đậu xanh, đậu phộng,…

o Môi trường

o MgSO4: 0,2g phân lập: Fred

o Thành phần môi trường:

 Mannit: 10g

 K2HPO4: 0,5g

 NaCl: 0,2g



 CaCO3: 0,3g

 Nước nấm men: 10%/100ml

 Tím tinh thể: 0,01g

 Agar: 20g

 Nước: 900ml

o Quy trình tiến hành:

 Chọn nốt sần lớn, màu hồng nằm trên rễ chính của cây họ đậu vào giai đoạn bắt đầu

ra hoa, rữa sạch cả chùm rễ nhiều lần Sau

đó dung dao cắt lấy các nốt sần ra khỏi rễ (Lưu ý: phải cách nốt sần ra một tí)

 Gấp nốt sần vào becher đựng HgCl 0,1% và ngâm 1-5 phút, sau đó dùng cồn rữa sạch và rữa nhiều lần với nước cất

 Nghiền nát nốt sần trong cối

 Lấy phần dịch tách ra từ nốt sần pha loãng với nước cất vô trùng

 Cấy dịch pha loãng này vào môi trường Fred

 Ủ ở 26o trong 3-4 ngày

 Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, trơn bóng, không màu, khi quan sát dưới kính hiển vi có

các tế bào phân nhánh chứa nhiều glycogen

và volutin

 Ngoài ra thì thường sử dụng môi trường YMA để phân lập Rhizobium:

Thành phần môi trường:

 Cao nấm men: 0,4g

 Manitol : 10g

 NaCl: 1g

 MgSO4.7H2O: 0.2g

 CaCO3: 4g

 K2HPO4: 0,5g

 Agar: 20g

 Nước cất: 1000ml

 Dung dịch tím kết tinh

- Từ các chủng Rhizobium được lựa chọn( chủng gốc) người

ta tiến hành nhân sinh khối bằng phương pháp lên men chìm hoặc lên men xốp

- Sinh khối của chủng được nhân qua cấp 1, 2, 3, trong các điều kiện phù hợp

- các sản phẩm phân vsv tạo ra chủ yếu bằng phương pháp lên men chìm

- Lên men chìm là phương pháp được sử dụng nhiều nhất

Nó có thể cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi, ít t ốn kém mặt bằng Do hệ thống khu ấy trộn tốt nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là một hệ thống nhất

8.Đánh giá hoạt tính sinh học

- Ta có thể tính và định lượng enzyme Nitrogenase thông qua sắc ký chuẩn có hàm lượng nhất định Nếu thấy xuất hiên những vạch tương đương với enzyme chuẩn

thì xác định chúng có enzyme Nitrogenase hay có khả năng cố định đạm

- Nuôi cấy Rhizobium trên môi trường Dobereiner và sử dụng để định đạm tổn số với đối chứng ( môi trường không nuôi cấy) nếu có sự gia tăng hàm lượng đạm thì chứng tỏ chúng có khả năng cố định đạm

9.Các phương pháp bảo quản

 Công tác bảo quản chủng giống vsv là việc làm rất cần thiết

và diễn ra thường xuyên

 Khi đã phân lập và tuyển chọn được chủng giống vsv như ý muốn rồi, thì việc thuần hóa, bảo quản là rất quan trọng

 Phải cấy truyền và nuôi nhắc lại rất nhiều lần để nhận được giống chủng thuần khiết

 Sau đó phải thực hiện đúng nguyên tắc trong công tác bảo quản, giữ giống vsv trong phòng thí nghiệm

 Phương pháp bảo quản:

- Do Rhizobium có khả năng sống trong điều kiện thoáng khí thấp nên có thể bảo quản chúng trong thạch dưới lớp dầu khoáng

- Dưới lớp dầu khoáng, chủng vẫn có thể phát triển được ở tốc

độ chậm do oxi vẫn khuếch tán qua lớp dầu khoáng

- Khi cấy giống hay cấy chuyền ta có thể dùng que cắm xuyên qua lớp dầu khoáng để lấy sinh khối mà không làm hư điều kiện bảo quản

 Lưu ý:

• Chúng ta không nên bảo quản Rhizobium trong cát và cá hạt vô trùng, vì rhizobium không có bào tử

• Để việc bảo quản vi sinh vật có kết quả cần phải đảm bảo chọn giống thuần khiết, chưa bị biến đổi các đặc tính do đột biến ngẫu nhiên đồng thời còn phải chọn giai đoạn tối ưu trong chu trình sống để bảo quản

10 Quy trình sản chung phân bón ố định đạm

 Giải thích sơ đồ:

⁻ phân lập và tuyển chọn vsv

⁻ Tùy theo mục đích sản xuất của từng loại mà ta phân lập các chủng vi sinh cho phù hợp

⁻ Để có được chế phẩm sinh học cố định đạm tốt nhất thì công tác phân lập, tuyển chọn vsv cố định đạm và đánh giá

đặc tính sinh học của chủng là rất quan trọng trong quy trình sản xuất

⁻ Một số chỉ tiêu đánh giá như: thời gian mọc, kích thước khuẩn lạc và kích thước tế bào vsv, điều kiện sinh trưởng và phát triển( pH, oxi ), khả năng cạnh tranh và quan trọng là cường độ cố định nito phân tử

⁻ Chủng vsv sau khi tuyển chọn được bảo quản phù hợp với yêu cầu của từng loài và sử dụng cho sản xuất chế phẩm ở dạng chủng gốc

11.Yêu cầu chất lượng đối với phân bón vi sinh vật cố định đạm

 Yêu cầu chất lượng đối với chế phẩm vsv cố định nitơ nói riêng và phân bón vi sinh nói chung là phải có hiệu quả đối với đất và cây trồng, nghĩa là có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, đến năng suất hoặc chất lượng nông phẩm hoặc độ phì của đất

 Mật độ vsv chuyên tính trong sản phẩm phải đảm bảo các tiêu chuẩn ban hành Tùy theo điều kiện của từng quốc gia,mật độ vsv chuyên tính trong 1 gam hoặc mililit chế

phẩm dao động 10.000.000 ÷ 1.000.000.000 đối với chế phẩm trên nền chất mang khử trùng và 100.000 ÷ 1.000.000 đối với chế phẩm trên nền chất mang không khử trùng

 Theo tiêu chuẩn Việt Nam mật độ vsv chuyên tính trong chế phẩm phảo đạt 108 đối với chế phẩm trên nền chất mang khử trùng và 105 đối với chế phẩm trên nền chất mang

không khử trùng

 Tùy theo yêu cầu của từng nơi, người ta còn đưa thêm các tiêu chuẩn kỹ thuật khác đối với từng loại chế phẩm cụ thể như khả năng cố định nitơ trong môi trường chứa 10g