NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus & Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA, XƯƠNG MỀM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus và Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus và Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp PGS. TS. Nguyễn Văn Thành 2015 Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường tại: Vào lúc: … giờ …. ngày …. tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Trung tâm học liệu – Đại học Cần Thơ 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 CHƯƠNG 1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN 1.1 Tính cấp thiết của đề tài “Cá sặc lên men chua, xương mềm” là dạng sản phẩm cá lên men lactic với đặc trưng là cá vẫn giữ được hình dạng nguyên vẹn nhưng xương rất mềm tạo cảm giác như không có xương khi ăn. Tuy nhiên, bí quyết làm sản phẩm này đang dần thất truyền, đồng thời có nhiều yếu tố tác động lên sản phẩm chưa được nghiên cứu và xác định rõ ràng dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định. Đến thời điểm hiện nay chưa có công trình khoa học nào công bố những vấn đề có liên quan đến sản phẩm. Do đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình chế biến và phân lập vi sinh vật hiện diện trong cá sặc lên men chua, xương mềm” cần được thực hiện để giúp cho việc tiêu thụ sản phẩm cá nhỏ có nhiều xương được dễ dàng hơn; lựa chọn dòng vi sinh vật để bổ sung vào sản phẩm ở mức độ thích hợp nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt, ổn định, không phụ thuộc nhiều vào nguồn vi sinh vật có trong tự nhiên cũng như rút ngắn được thời gian chế biến có thể áp dụng vào sản xuất kinh doanh hoặc sản xuất ở quy mô hộ gia đình góp phần giải quyết việc làm, xóa đói giảm nghèo. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: cải thiện quy trình chế biến, phân lập vi sinh vật trong sản phẩm. Từ đó xác định nguyên nhân làm mềm xương cá và nghiên cứu bổ sung nguồn vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng ổn định, không phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự nhiên, đảm bảo an toàn thực phẩm, giải thích hiện tượng trên cơ sở khoa học phục vụ cho sản xuất, nghiên cứu và giảng dạy. 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: luận án chỉ thực hiện trên nguồn nguyên liệu chính là cá sặc. Từ đó, các kết quả nghiên cứu này là tiền đề, cơ sở để áp dụng vào các nguồn nguyên liệu khác. 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án: về khoa học, luận án đã công bố một số thông tin có liên quan đến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm; phân lập và xác định tên loài, mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm tế bào, đặc tính sinh hóa, giải trình tự gen của 6 dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm; xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, giải thích hiện tượng trên cơ sở khoa học phục vụ nghiên cứu và giảng dạy. Về thực tiễn, đề tài đã cải tiến quy trình chế biến, xác định chế độ bảo quản; xác định dòng vi khuẩn lactic có khả năng được chọn làm giống bổ sung vào sản phẩm giúp cải thiện chất lượng sản phẩm và rút ngắn thời gian lên men để áp dụng vào trong sản xuất và đời sống. 1.5 Những đóng góp mới của luận án - Công bố thông tin về quy trình chế biến; các đặc tính hóa học, cảm quan, vi sinh của hai quy trình chế biến đang được áp dụng. - Xây dựng quy trình chế biến với các thông số tối ưu. Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và giải thích trên cơ sở khoa học. Cung cấp thông tin về chỉ tiêu chất lượng sản phẩm được làm từ quy trình này. - Xác định tên loài, mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm tế bào, giải trình tự gen, xác định được một số đặc tính sinh hóa và khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của các dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm. - Xác định dòng vi khuẩn lactic Pediococcus acidilactici có khả năng được chọn làm giống bổ sung vào sản phẩm giúp cải thiện chất lượng sản phẩm và rút ngắn thời gian lên men. - Đề xuất được chế độ bảo quản sản phẩm nhằm ổn định được chất lượng sản phẩm. - Chứng minh được nguyên nhân và điều kiện xương cá bị mềm trong quá trình lên men là do tác động của acid lactic. 3 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát một số quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm đang được áp dụng. - Cải tiến quy trình chế biến. - Phân lập và định danh các dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm. - Xác định nguyên nhân và khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình làm mềm xương cá trong sản phẩm. - Nghiên cứu bổ sung các dòng vi khuẩn lactic được phân lập trong chế biến sản phẩm. - Khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung 1. Khảo sát một số quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm đang được áp dụng Khảo sát quy trình chế biến cá sặc lên men chua, xương mềm ở các địa phương: Ấp Trung Hưng 1, xã Vĩnh Hưng, huyện Vĩnh Lợi và xã Đông Hải, huyện Gành Hào, tỉnh Bạc Liêu. Lấy mẫu thành phẩm cuối cùng từ hai quy trình này (thực hiện ba đợt lấy mẫu, mỗi đợt lấy ba mẫu/quy trình, mỗi mẫu 500 g) tiến hành xác định: các thuộc tính cảm quan và đánh giá chất lượng cảm quan thành phẩm với các chỉ tiêu về màu sắc, mùi, vị, cấu trúc cơ, xương cá theo phương pháp QDA; pH; hàm lượng NaCl, acid lactic, nitơ tổng số, nitơ acid amin, nitơ amoniac; hàm lượng lipid; mật số vi sinh vật tổng số, vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật gây bệnh như Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, E. coli, coliforms, Salmonella spp. 4 2.2.2 Nội dung 2. Cải tiến quy trình chế biến Dựa trên quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm đang được áp dụng trong dân gian, thiết lập quy trình chung. Từ quy trình chung, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong từng công đoạn chế biến và chọn thông số tối ưu để cho ra sản phẩm có chất lượng tốt nhất. Cụ thể, từ kết quả nội dung thí nghiệm 1 đã xác định được các công đoạn chính cần có bước nghiên cứu, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng là công đoạn xử lý nguyên liệu, công đoạn phối trộn và lên men. 2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm Tiến hành sốc nhiệt cá (cho vào thau nước có nhiệt độ 15 o C) để cá chết đồng loạt và chia ra 2 nhóm: ngâm cá trong nước (với tỷ lệ cá : nước là 1 : 1) và cá cho vào rổ để ngoài không khí. Tổng thời gian xử lý cá trước khi phối trộn bao gồm: thời gian làm sạch cá, thời gian ngâm trong nước (hoặc để ngoài không khí) và thời gian để ráo. Trong đó, thời gian để làm sạch cá nguyên liệu tối đa là 3 giờ, thời gian để ráo cá đến trước khi phối trộn gia vị là 6 giờ. Như vậy thời gian mẫu ngâm trong nước (hoặc để ngoài không khí) theo ba mức độ thí nghiệm là 13, 16 và 19 giờ (tương ứng với tổng thời gian của công đoạn xử lý ở 3 mức độ bố trí thí nghiệm là 22, 25 và 28 giờ). Sau khi xử lý xong tiến hành phối trộn đường, muối, rượu, thính, tỏi, ớt. Trộn đều hỗn hợp rồi cho vào keo gài nén, bịt kín miệng keo lại và ủ. Xác định pH, nhiệt độ thân cá và nhiệt độ môi trường (cứ sau 01 giờ đo 01 lần), mật số vi sinh vật trên nguyên liệu sau khi xử lý. Sau 25 ngày ủ lên men, lấy mẫu thành phẩm đánh giá cảm quan; xác định hàm lượng acid tính theo acid lactic, tỷ lệ chuyển hóa nitơ acid amin/nitơ tổng, nitơ amoniac/nitơ tổng. 5 2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol, muối, đường phối trộn chất lượng sản phẩm Thí nghiệm được thực hiện gồm có 2 bước: + Bước 1: Xác định khoảng nồng độ ethanol, muối, đường phối trộn tạo ra được sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm Cá sặc xử lý theo cách được chọn từ thí nghiệm 2.1 (Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm). Mỗi nghiệm thức sử dụng 300 g cá đã xử lý, bổ sung thêm (tính trên khối lượng cá đã xử lý) 5% thính; 10% gừng, tỏi, ớt và phối trộn ethanol (với 4 mức độ 0, 3, 6, 9%), muối (với 3 mức độ 10, 15, 20%), đường (với 3 mức độ 10, 15, 20%). Sau đó cho hổn hợp đã phối trộn vào keo gài nén, bịt kín miệng keo lại và ủ trong 25 ngày. Lấy mẫu sản phẩm cuối cùng kiểm tra các chỉ tiêu sau: đánh giá sự thay đổi một số thuộc tính về màu sắc, mùi, vị, trạng thái cơ thịt và mức độ mềm xương theo phương pháp PCA; xác định pH, mật số vi khuẩn lactic. + Bước 2: Xác định nồng độ ethanol, muối, đường phối trộn và thời gian lên men thích hợp để tạo ra được sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm có chất lượng tốt nhất. Cá sặc xử lý theo cách được chọn từ thí nghiệm 2.1 (Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm). Mỗi nghiệm thức sử dụng 300 g cá đã xử lý, bổ sung (tính trên khối lượng cá đã xử lý) thêm 5% thính, 10% gừng, tỏi, ớt. Phối trộn ethanol, muối, đường với các nghiệm thức nằm trong khoảng đã được chọn ở bước 1. Sau đó cho hổn hợp đã phối trộn vào keo gài nén, bịt kín miệng keo lại và ủ ở nhiệt độ phòng (28-32 o C). Tiến hành xác định pH, hàm lượng calci còn lại trong xương cá và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp QDA sau 15, 20, 25, 30, 35 ngày ủ. 6 2.2.3 Nội dung 3. Phân lập và định danh các dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm Cá xử lý theo cách được chọn từ thí nghiệm 2.1 (Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm). Mỗi nghiệm thức sử dụng 300 g cá đã xử lý, bổ sung (tính trên khối lượng cá đã xử lý) thêm 5% thính, 10% gừng, tỏi, ớt. Tiến hành phối trộn ethanol, muối, đường với nồng độ tối ưu được chọn từ thí nghiệm 2.2. Cho hổn hợp vào keo gài nén, bịt kín miệng keo lại và ủ. Sau 10, 20, 30 ngày ủ, phân lập giống vi sinh vật trên môi trường MRS và PCA (có bổ sung 6% NaCl) ở nhiệt độ 37 o C trong 48-72 giờ. Các khuẩn lạc sau khi phân lập ròng được nhận diện để xác định loài trên cơ sở: đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram; khả năng sinh enzyme protease, amylase, catalase, oxidase; khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate: tinh bột, saccharose, manitol, lactose và glucose; xác định tên loài bằng sinh học phân tử và mật số của từng dòng vi sinh vật phân lập được sau 10, 20, 30 ngày ủ. 2.2.4 Nội dung 4. Xác định nguyên nhân và khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình làm mềm xương cá 2.2.4.1 Thí nghiệm 4.1. Xác định nguyên nhân làm mềm xương Chuẩn bị các dung dịch acid lactic và acid acetic (có thể tích 1800 ml), thanh trùng ở 121 o C, 15 phút và điều chỉnh pH về pH4. Chuẩn bị môi trường MRS broth (có thể tích 1800 ml), thanh trùng ở 121 o C, 15 phút; chủng các dòng vi sinh vật lên men lactic đã phân lập được từ sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm gồm Pediococcus acidilactici (L1), 2 dòng Lactobacillus farciminis (L2, L3). Tiến hành tăng sinh đến khi pH đạt pH 4-4,5. Sau đó tiếp tục thanh trùng ở 121 o C, 15 phút để vô khuẩn. 7 Chuẩn bị xương cá sặc (phi lê loại bỏ hết phần thịt, mỡ bám trên xương cá), hấp ở 100 o C trong 15 phút. Tiến hành cho 4,8 g xương cá (khoảng 20 mẫu xương) vào dung dịch acid lactic, acid acetic và dung dịch sau tăng sinh (đã chuẩn bị ở trên) ngâm trong 72 giờ, lấy mẫu phân tích kiểm tra các chỉ tiêu: hàm lượng calci trong xương cá và trong dung dịch trước và sau khi ngâm; hàm lượng acid trong dung dịch trước và sau khi ngâm; phân tích thành phần hóa học của xương cá (hàm lượng ẩm, hàm lượng acid amin, hàm lượng calci) trước và sau khi ngâm; chụp X-quang mẫu xương cá. 2.2.4.2 Thí nghiệm 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm đến quá trình làm mềm xương Chuẩn bị dung dịch acid acetic, acid lactic có pH4, pH5 và xương cá như thí nghiệm 4.1. Sau đó cho 4,8 g xương cá (khoảng 20 mẫu xương) vào dung dịch acid acetic, acid lactic đã chuẩn bị ở trên và ngâm trong 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 giờ. Lấy mẫu phân tích kiểm tra các chỉ tiêu: hàm lượng calci trong xương cá trước và sau khi ngâm; hàm lượng acid, hàm lượng calci trong dung dịch trước và sau khi ngâm. 2.2.5 Nội dung 5. Nghiên cứu bổ sung các dòng vi khuẩn lactic được phân lập trong chế biến sản phẩm Trước khi tiến hành chủng vi khuẩn lactic, mẫu sản phẩm được chuẩn bị theo quy trình đề nghị ở nội dung thí nghiệm 2: cá sặc xử lý theo cách được chọn từ thí nghiệm 2.1 (Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm). Mỗi nghiệm thức sử dụng 300 g cá đã xử lý, bổ sung (tính trên khối lượng cá đã xử lý) thêm 5% thính, 10% gừng, tỏi, ớt. Phối trộn ethanol, muối, đường với các nghiệm thức tối ưu đã được chọn ở thí nghiệm 2.2 (Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol, muối, đường đến chất lượng sản phẩm). Sau đó, chủng riêng từng dòng vi khuẩn Pediococcus acidilactici (L1) với [...]... gian lên men dao động trong khoảng 106-2,0.108 cfu/g (Bảng 10) 17 Bảng 10 Mật số của các dòng vi sinh vật (cfu/g) hiện diện trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm theo thời gian lên men 3.4 Kết quả khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm mềm xương cá trong quá trình lên men 3.4.1 Kết quả xác định yếu tố làm mềm xương cá Nghiên cứu đã chứng minh xương cá mềm đi là do acid sinh ra trong quá trình. .. từng đốt (Hình 8 và Hình 9) Hình 8 Xương cá ngâm trong ngâm trong dung dịch có pH4 20 Hình 9 Xương cá ngâm trong dung dịch có pH5 3.5 Kết quả nghiên cứu bổ sung giống vi khuẩn lactic vào sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm Khi phân tích mật số vi sinh vật tổng số, mật số vi khuẩn lactic; các chỉ tiêu hóa học như pH, hàm lượng acid lactic, hàm lượng calci trong xương cá, hàm lượng NH3 và đánh giá cảm... chuẩn về chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh Riêng chỉ tiêu về Salmonella spp mặc dù trong quy chuẩn không có quy định nhưng kết quả kiểm tra cho thấy cũng không có sự xuất hiện vi khuẩn này Bảng 3 Mật số vi sinh vật (cfu/g) hiện diện trên sản phẩm Tiêu chuẩn Mắm cá sặc quy định* mặn** 5 3.109 0,8-0,9.105 . TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus và Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM TÓM TẮT LUẬN. đề tài Nghiên cứu quy trình chế biến và phân lập vi sinh vật hiện diện trong cá sặc lên men chua, xương mềm cần được thực hiện để giúp cho vi c tiêu thụ sản phẩm cá nhỏ có nhiều xương được. pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung 1. Khảo sát một số quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm đang được áp dụng Khảo sát quy trình chế biến cá sặc lên men chua, xương mềm ở các