Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ HUY THƯỞNG ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG GIÁM SÁT CHỦ ĐỘNG BỆNH ĐỐM TRẮNG VÀ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TƠM THẺ CHÂN TRẮNG Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Thị Lụa TS Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Huy Thưởng i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Trung tâm quan trắc môi trường bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, nhờ hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, cán phòng thí nghiệm trung tâm nỗ lực thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn kính trọng sâu sắc tới TS Đặng Thị Lụa, phó Giám đốc trung tâm quan trắc môi trường bệnh thuỷ sản miền Bắc TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng môn công nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể phòng, ban khoa Cơng nghệ sinh học, phòng ban thuộc trung tâm quan trắc mơi trường bệnh thuỷ sản miền Bắc tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên suốt q trình học tập thực tập Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân động viên, cổ vũ tinh thần giúp tơi hồn thành khóa luận này! Hà nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Huy Thưởng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ, hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình ni tơm thẻ chân trắng giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng giới 2.1.2 Tình hình ni tôm thẻ chân trắng Việt Nam 2.2 Tình hình dịch bệnh tôm nuôi giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình dịch bệnh tơm ni giới 2.2.2 Tình hình dịch bệnh tơm ni Việt Nam 10 2.3 Thực trạng áp dụng sinh học phân tử chẩn đốn bệnh tơm 12 2.3.1 Kỹ thuật PCR 13 2.3.2 Kỹ thuật nested PCR (PCR mồi đôi) 13 2.3.3 Kỹ thuật real-time PCR 14 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 15 3.1 Địa điểm nghiên cứu 15 3.1.1 Địa điểm thu mẫu 15 iii 3.1.2 Địa điểm tiến hành phân tích mẫu 15 3.2 Thời gian nghiên cứu 15 3.3 Vật liệu nghiên cứu 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 3.4.1 Phương pháp chọn điểm giám sát tác nhân gây bệnh tôm thời điểm giám sát 15 3.4.2 Thông số, tần suất giám sát phương pháp phân tích thơng số giám sát 16 3.4.3 Phương pháp thu mẫu bảo quản mẫu 17 3.4.4 Phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh tơm 17 3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu: 22 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 23 4.1 Kết nghiên cứu 23 4.1.1 Thông tin ao nuôi tôm lựa chọn để thu mẫu định kỳ 23 4.1.2 Kết phân tích mầm bệnh tơm ni 25 4.1.3 Một số biện pháp kỹ thuật khuyến cáo nhằm giảm thiểu nguy bùng phát dịch bệnh đốm trắng hoại tử gan tụy cấp 35 4.2 Thảo luận 37 4.2.1 Thảo luận bệnh WSSV 37 4.2.2 Thảo luận bệnh AHPND 38 Phần Kết luận kiến nghị 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 Tài liệu tham khảo 44 Phụ lục……… 47 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt WSSV Vi rút gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus) AHPND Vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) EMS Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome) PCR polymerase chain reaction ĐBSCL Đồng sông cửu long NTTS Nuôi trồng thủy sản v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Vùng, điểm giám sát thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV AHPND thường xuyên tôm nuôi 16 Bảng 3.2 Vùng, điểm giám sát thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV AHPND đột xuất tôm nuôi 16 Bảng 3.3 Thông số, tần suất thu mẫu tôm phương pháp phân tích mầm bệnh tơm 16 Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi VP28 dùng xác định WSSV 17 Bảng 3.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định WSSV 18 Bảng 3.6 Kết đọc điện di 20 Bảng 3.7 Trình tự cặp mồi (AP3) dùng xác định AHPND 20 Bảng 3.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định AHPND 21 Bảng 3.9 Kết đọc điện di 22 Bảng 4.1 Thông tin ao nuôi giám sát định kỳ Nghệ An 23 Bảng 4.2 Thông tin ao nuôi giám sát định kỳ Quảng Ninh 24 Bảng 4.3 Bảng tổng hợp số mẫu phân tích định kỳ phân tích đột xuất tơm 25 Bảng 4.4 Kết phân tích mầm bệnh WSSV mẫu tôm thu định kỳ Nghệ An 26 Bảng 4.5 Kết phân tích mầm bệnh WSSV mẫu tơm thu định kỳ Quảng Ninh 26 Bảng 4.6 Kết phân tích mầm bệnh WSSV mẫu tơm thu đột xuất Nghệ An 27 Bảng 4.7 Kết phân tích mầm bệnh WSSV mẫu tơm thu đột xuất Quảng Ninh 28 Bảng 4.8 Kết phân tích mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Nghệ An 29 Bảng 4.9 Kết phân tích mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Quảng Ninh 30 Bảng 4.10 Kết phân tích mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu đột xuất Nghệ An 32 Bảng 4.11 Kết phân tích tác nhân gây bệnh AHPND mẫu tôm thu đột xuất Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) 34 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Diện tích, sản lượng suất tơm thẻ từ năm 2008 đến 2015 Hình 2.2 Đốm trắng xuất vỏ đầu tôm Hình 2.3 Tơm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy 10 Hình 4.1 Hình ảnh triển khai đề tài 25 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh WSSV mẫu tôm thu tăng cường Nghệ An 28 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Nghệ An (ngày 16/6/2015) 29 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) 30 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) 31 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu định kỳ Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) 31 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND mẫu tôm thu đột xuất Nghệ An 33 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất Nghệ An 33 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất Quảng Ninh 34 Hình 4.10 Hình ảnh tơm đợt thu mẫu đột xuất Nghệ An 39 Hình 4.11 Dấu hiệu bệnh lý xuất gan tụy 39 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Huy Thưởng Tên Luận văn: “Ứng dụng sinh học phân tử giám sát chủ động bệnh đốm trắng bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm thẻ chân trắng” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hoạt động giám sát tôm nuôi nước lợ tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng, Quỳnh Lưu, Nghệ An phường Hải Hòa, Móng Cái, Quảng Ninh giúp chủ động tầm sốt mầm bệnh gây bệnh AHPND, WSSV tơm Đề tài phát sớm tác nhân gây bệnh AHPND, WSSV đưa khuyến cáo, cảnh báo góp phần giảm thiểu tỷ lệ tôm chết ngăn ngừa bùng phát dịch bệnh Ngoài ra, đề tài thực số đợt giám sát tăng cường, đột xuất vùng ni tơm tập trung phía Bắc tơm ni có dấu hiệu chết bất thường Việc thực hoạt động giám sát vùng tôm nuôi Quảng Ninh, Nghệ An có ý nghĩa việc chủ động nắm bắt tình hình vùng ni kịp thời phát xuất dịch bệnh tơm, góp phần xác định tác nhân gây bệnh làm sở để địa phương công bố dịch Kết giám sát kịp thời chuyển tải tới hộ nuôi, quan quản lý địa phương hình thức điện thoại trao đổi trực tiếp, email báo cáo Nhiệm vụ thể vai trò việc tăng cường kết nối phối hợp quan nghiên cứu, quan quản lý đạo sản xuất với địa phương sở/hộ nuôi viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Le Huy Thuong Thesis title: “Application of molecular biology technology to monitor diseases by white spot syndrome virus and pathogenic hepato pancreatic acute necrosis in the white shrimp” Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Disease monitoring in white-leg shrimp cultured in Quynh Bang, Quynh Luu, Nghe An and Hai Hoa, Mong Cai, Quang Ninh has helped to control WSSV and AHPND in shrimp actively These studies early found out WSSV and pathogens caused AHPND in shrimp and make warnings, and also give technical recommendation to local authorities and shrimp farmers in order to reduce the deaths of shrimp and prevent disease outbreaks Moreover, this study also collected shrimp samples in shrimp farms when cultured shrimp showed clinical signs and analyse pathogens caused for WSD and AHPND These results have played important roles in control of disease outbreak in shrimp as well as in reduction of mortalities caused by WSD and AHPND Moreover, based on these results, the provical authority, such as Quang Ninh province, could make officially announcement on AHPND outbreak in shrimp These results, together with some technical advices have also sent to local authorities and shrimp framers via email, telephome and documents Finally, the studies also play a role in stimulating the coorperation among research institutions, local authorities and shrimp farmers ix - Ao ni bị bệnh có tơm chết ít, nên giảm 70-100% lượng thức ăn, xử lý nước ao Vicato (5-10 ppm); sau đó, bón lại chế phẩm vi sinh để tiếp tục ni, đồng thời tăng cường quạt khí - Những ao ni tơm chết nhiều (80-100%), nên vớt hết tôm chết đem tiêu hủy, sử dụng Chlorine (30 ppm) phun xuống toàn ao; giữ nguyên nước ao sau 7-10 ngày tháo nước ngoài, tránh để bệnh dịch lây lan xung quanh Mực nước ao tôm xử lý Chlorine nên thấp ao xung quanh để ngăn ngừa nước mang mầm bệnh rò rỉ sang ao khác Sau tiêu hủy ao tôm bệnh cần tháo cạn nước, vét bùn đáy lật hết bạt lót đáy ao (nếu có) rải vôi phun thuốc khử trùng bạt, đáy ao, bờ ao - Khi phát tôm bị dịch bệnh người nuôi phải cách ly không sử dụng chung dụng cụ với ao khác không tiếp xúc trực tiếp từ ao bệnh sang ao khác, không thải nước thải mang mầm bệnh trực tiếp bên - Phơi nắng đáy ao 5-7 ngày, sau lấy nước vào ao thả cá rô phi (3-4 com/m2) ni 1,5-2 tháng tháo nước cải tạo ao, lót bạt ni tơm vụ 4.1.3.3 Khuyến cáo ao bị bệnh AHPND - Đối với ao ni phát tơm có dấu hiệu bị bệnh cần báo cho cán thú y để lấy mẫu xét nghiệm, nhằm xác định xác bệnh có biện pháp xử lý - Quản lý chặt chẽ yếu tố môi trường nước ao nuôi như: pH (kiểm tra 02 lần/ngày, vào lúc sáng 14 chiều); độ kiềm (định kỳ 7-10 ngày kiểm tra/lần); NH3, ơxy hòa tan, độ muối (định kỳ ngày kiểm tra/lần) cần điều chỉnh ngưỡng thích hợp - Khi phát tơm bị dịch bệnh người nuôi phải cách ly không sử dụng chung dụng cụ với ao khác không tiếp xúc trực tiếp từ ao bệnh sang ao khác, không thải nước thải mang mầm bệnh trực tiếp bên 4.2 THẢO LUẬN 4.2.1.Thảo luận bệnh WSSV Thực tế suốt thời gian giám sát chủ động bệnh Nghệ An Quảng Ninh không phát thấy tượng tôm ao giám sát xuất dịch bệnh đốm trắng (Đặng Thị Lụa cs., 2015) 37 Hình 4.10 Hình ảnh tơm đợt thu mẫu đột xuất Nghệ An (khơng có biểu đốm trắng thân) Kết âm tính, chứng tỏ khơng có mầm bệnh mẫu tơm thu từ ao nuôi chọn giám sát hay nói cách khác khả xuất bệnh ao tôm giám sát thấp Kết tạm đến số kết luận sau: nhà cung cấp giống kiểm soát mầm bệnh ngày từ sản xuất tốt hơn, kĩ lưỡng hơn; môi trường nước ao chọn giám sát chuẩn bị tốt loại bỏ mầm bệnh WSSV trước thả tôm; nguồn thức ăn cho tôm đảm bảo; kỹ thuật nuôi tôm bà ý nhận thức người ni tơm quy trình ni tơm thẻ chân trắng hướng đến mục tiêu ổn định phát triển bền vững, lâu dài 4.2.2.Thảo luận bệnh AHPND Một số mẫu tôm thu Quảng Ninh quan sát mắt thường thấy có dấu hiệu bị bệnh hoại tử gan tuỵ cấp bao gồm: gan tụy teo sưng to, có màu sắc nhợt nhạt trắng, lớp màng bao bên gan tụy có màu trắng, xuất đốm vệt đen, sờ cảm thấy gan tụy dai khó vỡ, ruột rỗng khơng có thức ăn 38 Hình 4.11 Dấu hiệu bệnh lý xuất gan tụy Tại Quảng Ninh, UBND tỉnh phải công bố dịch AHPND ngày 1/6/2015 Trong hộ bị thiệt hại nặng nề chí bị trắng hai hộ nằm diện giám sát thường xuyên đến thời điểm thu hoạch thu sản lượng định Cụ thể, hộ ông Mạch Văn Trường thu hoạch 1.500 kg/2500m2 (160 con/kg), hộ ông Lê Văn Diễn thu hoạch 100 kg/2000m2 (60 con/kg) Tại Nghệ An dịch bệnh diễn phức tạp, bệnh AHPND xuất hiện, hộ nuôi, tỉ lệ tôm chết lũy tiến cao Trong hộ giám sát thường xun có ơng Hồ Sỹ Vinh phát thấy mầm bệnh AHPND Do phát sớm, chủ hộ có biện pháp phòng chữa trị kịp thời nên dịch bệnh không lây lan, tơm có tượng ngừng chết nhận thấy tơm có sức ăn phát triển chậm (sau 67 ngày nuôi, tôm đạt cỡ 230 con/kg) Ngày 25/6/2015, chủ hộ định thu hoạch sớm, sản lượng đạt 500kg/2000m2 Như việc ứng dụng phương pháp PCR giám sát chủ động mầm bệnh AHPND tôm nuôi tập trung giúp cho quan chức sớm có biện pháp cảnh báo, đạo kịp thời đến hộ chăn nuôi nhằm làm giảm thiểu tổn thất từ góp phần phát triển bền vững nghề nuôi tôm nước ta 39 Tuy nhiên tỷ lệ mẫu phát có mầm bệnh AHPND phản ánh tình hình dịch bệnh xảy Quảng Ninh Nghệ An Theo kết phân tích mầm bệnh đề tài Ngay sau phát thấy mầm bệnh, quan chức đưa khuyến cáo tới hộ chăn ni Thì mẫu phân tích hộ lần sau khơng phát thấy mầm bệnh giảm số lượng mẫu bị nhiễm, chứng tỏ mầm bệnh bị tiêu diệt Nguyên nhân có dấu hiệu bệnh, hộ ni cảnh báo sử dụng kháng sinh áp dụng biệt pháp khuyến cáo mẫu tơm thu lần sau không phát thấy mầm bệnh AHPND Đề tài tìm hiểu kết số cơng trình nghiên cứu Việt Nam giới đạt việc phát sớm bệnh AHPND, nhằm giải thích thêm tơm chết có biểu bệnh AHPND PCR cặp mồi AP3 âm tính: Dựa thơng tin nghiên cứu bệnh AHPND tôm, nhà nghiên cứu cho tồn chủng vi khuẩn khác (khơng phải có chủng Vibrio parahaemolyticu gây bệnh AHPND) gây bệnh EMS tơm, điều lý cặp mồi AP1, AP2 AP3 phát vi khuẩn gây bệnh EMS tôm Theo TS Phan Thị Vân cs (2014) có hai chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND tôm nuôi Việt Nam, có chủng Vibrio parahaemolyticus phát kit PCR EMS-2, IQ2000 AP3 Sirikharin et al (2014) Theo GS Kwai-Lin Thong, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus khơng phải lồi vi khuẩn Vibrio gây bệnh EMS Bà cho biết, cặp mồi AP1, AP2, AP3 cặp mồi dùng kit PCR EMS-2, IQ2000 có trình tự tương đồng cao có liên quan mật thiết với lồi vi khuẩnVibrio có tên Vibrio sinaloensis (vi khuẩn phân lập từ tôm bệnh bang Sinaloa, Mexico) dựa tồn trình tự gen Theo TS Indrani Karunasagar (2013) cho biết, “Vibrio parahaemolyticus có liên quan đến tỷ lệ gây chết tơm Ấn Độ khơng có đặc điểm chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND” Khi phân tích PCR mẫu tơm nhiễm EMS, bà cho biết chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cho kết dương tính với EMS chạy 40 cặp mồi AP1, AP2 AP3 gen quy định độc tố tồn plasmid lây truyền Bà cho biết, chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS cho kết dương tính với PCR khơng có gen sản xuất độc tố biểu gen độc tố plasmid kiểm soát nhiều yếu tố Bà cơng bố chứng kiểu hình, kiểu gen phân tích gen cho thấy bệnh tơm xuất khu vực bờ biển phía đơng Ấn Độ vào cuối năm 2013 có nguyên nhân nhóm vi khuẩn Vibrio (Vibriosis) gây nên thay bệnh EMS Theo TS Vuddhakul (2014), vai trò vật liệu di truyền vi khuẩn lây truyền theo phương ngang ảnh hưởng lớn đến kết phân tích PCR Trong tổng số 129 mẫu vi khuẩn phân lập từ tơm có dấu hiệu lâm sàng bệnh EMS mẫu môi trường từ năm 2008 – 2014 miền nam Thái Lan cho thấy tất âm tính với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS chạy hai cặp mồi AP2 AP3, tất 33 mẫu Vibrio parahaemolyticus phân lập gần từ tôm bệnh EMS khu vực nghiên cứu cho kết dương tính với hai cặp mồi AP2 AP3 Từ kết nghiên cứu này, Tiến sĩ Varaporn Vuddhakul cho tác nhân gây bệnh EMS có nguồn gốc từ (clone) Vibrio parahaemolyticus diện khu vực trước đây, sau phát triển thành chủng Vibrio parahaemolyticus Theo GS Flegel (2015) không giống bệnh virus, ví dụ bệnh virus đốm trắng WSSV tơm, vi khuẩn gây bệnh EMS khơng kiểm sốt hồn tồn cách loại bỏ vật chủ trung gian mang mầm bệnh Ông cho biết biết tác nhân gây bệnh trực tiếp EMS độc tố Pir mã hóa từ plasmid, yếu tố di truyền có tính di động cao (dễ lan truyền) GS Flegel khuyến cáo hệ thống nuôi tơm khép kín với biện pháp an tồn sinh học nâng cao cần thực để giải lây lan EMS hệ thống nuôi tôm toàn cầu 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đề tài áp dụng phương pháp PCR việc phân tích tầm sốt mầm bệnh WSSV AHPND tôm nuôi vùng nuôi tập trung thuộc Quảng Ninh, Nghệ An đạt số kết sau: - Không phát thấy mầm bệnh WSSV ao chọn giám sát định kỳ - Đã phát thấy mầm bệnh mẫu thu tăng cường, đột xuất cụ thể Nghệ An 1/10 hộ (5/40 mẫu), Quảng Ninh 0/4 hộ (0/16 mẫu) - Đã phát mầm bệnh AHPND số ao nuôi chọn giám sát cụ thể Nghệ An 1/6 hộ (5/255 mẫu), Quảng Ninh 2/9 hộ (11/367 mẫu), - Đã phát thấy mầm bệnh AHPND số mẫu thu tăng cường, đột xuất cụ thể Nghệ An 3/6 hộ (9/30 mẫu), Quảng Ninh 2/4 hộ (7/16 mẫu) - Đã chủ động phối hợp với Chi cục NTTS Quảng Ninh Chi cục NTTS Nghệ An đưa khuyến cáo giảm thiểu tỷ lệ tôm chết WSSV, AHPND ngăn ngừa bùng phát dịch bệnh - Cung cấp sở khoa học giúp Quảng Ninh công bố dịch bệnh AHPND - Đã góp phần vào việc tăng cường phối hợp quan quản lý, đạo sản xuất, quan chuyên môn với địa phương người nuôi làm giảm thiểu tôm chết, giảm thiểu lượng thuốc sử dụng ni tơm từ hình thành, phát triển vùng nuôi tôm bền vững 5.2 KIẾN NGHỊ Căn vào kết thực hiện, đề tài, chúng tơi có số đề xuất sau: * Kiến nghị quan quản lý - Cần tiếp tục trì nhiệm vụ giám sát chủ động vùng nuôi tập trung đối tượng nuôi chủ lực tơm tượng tơm chết nhiễm WSSV, AHPND diễn năm * Kiến nghị, đề xuất mặt nghiên cứu khoa học 42 - Bổ sung thêm tiêu phân lập xác đinh vi khuẩn gây bệnh AHPND nhóm Vibrio tổng số có mặt mơi trường nước phương pháp PCR nhằm xác định nguy rủi ro gây bệnh AHPND cho tôm nuôi từ môi trường - Xem xét tăng số mẫu phân tích tác nhân gây bệnh đợt thu mẫu để nâng cao ý nghĩa khoa học 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Quang Tề (2003) Bệnh tơm ni biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Trần Việt Mỹ (2009) Cẩm nang nuôi tôm chân trắng Chi cục khuyến nơng Thành Phố Hồ Chí Minh Trần Việt Tiên Đặng Thị Hoàng Oanh (2009) Phát triển quy trình mPCR phát đồng thời white spot syndrome virus, infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng gen β-actin làm nội chuẩn Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Thủy Sản Toàn Quốc năm tr 197 – 201 Đặng Thị Lụa, Nguyễn Viết Khuê, Phạm Thế Việt, Phạm Thị Yến Đào Xuân Trường (2015) Giám sát chủ động vùng nuôi tôm nước lợ ngao nuôi tập trung số tỉnh phía Bắc Báo cáo tổng kết nhiệm vụ giám sát năm 2015 Phan Thị Vân, Đặng Thị Lụa, Nguyễn Viết Khuê, Bùi Ngọc Thanh, Phạm Thế Việt, Phạm Thị Yến, Đào Xuân Trường, Nguyễn Thị Mai Phương Nguyễn Thị Thu Hường (2014) Nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy tơm phía Bắc Báo cáo tổng kết nhiệm vụ Cấp Bộ Tiếng Anh: Chu-Fang Lol, Jiann-Horng Leu, Ching-Hui Ho, Chau-Huei Chen, Shao-En Peng, You-Tzung Chen, Chih-Ming chou, Pei-Yan Yeh, Hsin-Yiu chou, Chung-Hsiung wang, Guang-Hsiung KOU (1996) Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction Diseases of aquatic organisms 25(1/2) pp 133-141 Escobedo Bonilla C.M., V Alday-Sanz, M Wille, P Sorgeloos and M B Pensaert (2008) A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus Journal of Fish Diseases 31 pp - 18 Flegel T.W., S Sriurairtana, C Wongteerasupaya, V Boonsaeng, S Panyim And B Withyachumnarnkul (1995) Progress in characterization and control of yellow-head virus of Penaeus monodon pp 76-83 In: C.L Browdy and J.S Hopkins, editors Swimming Through Troubled Water, Proceedings of the Special Session on Shrimp Farming, Aquaculture '95 World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA Flegel T.W., R Sirikharin, S Taengchaiyaphum, P Sanguanrut, T.D Chi, R Mavichak, P Proespraiwong, B Nuangsaeng, S Thitamadee, T W Flegel, K Sritunyalucksana (2015) Characterization and PCR Detection Of Binary, Pir-Like 44 Toxins from Vibrio parahaemolyticus Isolates that Cause Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in Shrimp 10 Fao (2011) Report of the FAO workshop to review the application of cites criterion annex a B to commercially-exploited aquatic species Rome pp 19-21 April 2011.Cited;Availablefrom: http://epub.sub.unihamburg.de/epub/volltexte/2013/16698/ 11 Indrani Karunasagar (2013) Bacteriophage application as a management strategy in shrimp hatcheries Commun Agric Appl Biol Vol 78(4) pp 204-5 12 Inouye Kiyoshi, Kazuo Momoyama, Midori Hiraoka, Heiji Nakano, Hiroshi Koube, Norihisa Oseko (1994) Mass Mortalities of Cultured Kuruma Shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993: Electron Microscopic Evidence of the Causative Virus Fish Pathol.Fish Pathology Vol 29(2) pp 149-158 13 OIE (2009) Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2009 14 Kwai L., S.M Choo, W Y Wee, and K P Yap (2014) An AP1, & PCR Positive non - Vibrio parahaemolitycus bacteria with AHPND histopathology Paper presented at the The 9th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture (DAA 9), Ho Chi Minh city, Vietnam 15 Lightner D.V (1996).A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp World Aquaculture Society: Baton Rouge, La 16 Lightner D.V (2013) Documentation of a unique strain of Vibrio parahaemolitycus as the agent of Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (ANPHD) affecting Penaeid shrimp with note on the putative toxins Paper presented at the The 9th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture (DAA 9), Ho Chi Minh city, Vietnam, Ho Chi Minh city, Vietnam 17 Nadala E C B., L M Tapay, P.C Loh (1998) Characterization of a non-occluded baculovirus-like agent pathogenic to penaeid shrimp Diseases of Aquatic Organisms 33 pp 221-229 18 Ratchanok Sirikharin, Kallaya Sritunyalucksana, Sirintip Dangtip, Piyachat Sanguanrut, Ratchanok Sirikharin1, Suparat Taengchaiyaphum ,Siripong Thitamadee, Rapeepat Mavichak, Porranee Proespraiwong (2014) A new and improved PCR method for detection of AHPND bacteria 19 Vuddhakul V., M Yingkajorn, P Mitraparp-Arthorn, S Nuanualsuwan, R Poomwised, N Kongchuay, N Khamhaeng (2014) Prevalence and quantification of pathogenic Vibrio parahaemolyticus during shrimp culture in Thailand Dis Aquat Organ Vol 112(2) pp 103-11 45 20 Schryver D.P., T Defoirdt and P Sorgeloos (2014) Early mortality syndrome outbreaks: a microbial management issue in shrimp farming PLoS Pathog, 10(4), e1003919 21 Supamattaya K.B (1996) Study of histopathology and cytopathological changes in black tiger shrimp (Peneaus monodon) caused by yellow-head virus and red color and white spot disease virus 22 Wyban S (1991) Intensive shrimp production technology: the Oceanic Institute shrimp manual 23 Wongteerasupaya C., S Wongwisansri, V Boonsaeng, S Panyim, P Pratanpipat, G L Nash, B.Withyachumnarnkul T W Flegel (1996) DNA fragment of Penaeus monodon baculovirus PmNOBII gives positive in situ hybridization with white-spot viral infections in six penaeid shrimp species Aquaculture 143(1) pp 23 46 PHỤ LỤC Hình Mẫu tơm bệnh cố định cồn 95% Hình Mẫu sau làm khô cồn đưa vào ống 1.5ml nghiền chày vơ trùng 47 Hình Máy sấy Hình Máy votex 48 Hình Máy ly tâm lạnh Hình Buồng thao tác hóa chất 49 Hình Máy luân nhiệt (PCR) Hình Bàn điện di sản phẩm PCR 50 Hình Buồng đọc UV có kết nối với máy tính 51 ... hiệu bệnh lý xuất gan tụy 39 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Huy Thưởng Tên Luận văn: Ứng dụng sinh học phân tử giám sát chủ động bệnh đốm trắng bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm thẻ chân. .. nuôi trồng thủy sản Trong khuôn khổ nhiệm vụ trên, tiến hành nghiên cứu đề tài Ứng dụng sinh học phân tử giám sát chủ động bệnh đốm trắng bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm thẻ chân trắng với mục tiêu... bùng phát bệnh 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trong khuôn khổ đề tài luận văn tốt nghiệp cao học, ứng dụng phương pháp PCR giám sát chủ động bệnh đốm trắng bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm thẻ chân trắng, hai