Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của photorhabdus SPP và xenorhabdus SPP từ heterorhabditis indica và steinernema guangdongense

Tuy nhiên, các loài tuyến trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt vi khuẩn cộng sinh trong ruột chúng, nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng, gồm Phot

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA PHOTORHABDUS SPP VÀ XENORHABDUS SPP TỪ HETERORHABDITIS INDICA VÀ

MỤC LỤC

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU……… 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 8

1.2 Mục đích của nghiên cứu 9

1.3 Nhiệm vụ của nghiên cứu 9

1.4 Các kết quả đạt được của đề tài 9

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 11

2.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 11

2.1.1 Khái niệm EPN 11

2.1.2 Vai trò và ưu thế của EPN 11

2.2 Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng 12

2.2.1 Phân loại 12

2.3 Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus 14

2.3.1 Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae: 14

2.3.2 Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus 15

2.3.3 Một số đặc điểm phân biệt cơ bản 16

2.3.4 Một số yếu tố độc lực 25

2.4 Mối quan hệ cộng sinh 34

2.4.1 Vai trò của tuyến trùng 34

2.4.2 Vai trò của vi khuẩn cộng sinh 35

2.4.3 Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 35

2.5 Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt 38

2.5.1 Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt 39

2.5.2 Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt 39

2.5.3 Các loài côn trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt 40

2.6 Tình hình nghiên cứu Photorhabdus và Xenorhabdus trên thế giới và Việt Nam 41

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 42

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 45

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not

defined

3.1 Thời gian và địa điểm Error! Bookmark not defined

3.1.1 Thời gian Error! Bookmark not defined 3.1.2 Địa điểm Error! Bookmark not defined

3.2 Vật liệu Error! Bookmark not defined

3.2.1 Nguồn tuyến trùng EPN Error! Bookmark not defined 3.2.2 Nguồn vi sinh vật Error! Bookmark not defined 3.2.3 Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng Error! Bookmark not defined

3.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

3.3.1 Phương pháp phân lập Error! Bookmark not defined 3.3.2 Hình thái Error! Bookmark not defined 3.3.3 Sinh lý Error! Bookmark not defined 3.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Error! Bookmark not defined 3.3.5 Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined 3.3.6 Hoạt tính sinh học Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Kết quả phân lập hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined 4.2 Hình thái khuẩn lạc Error! Bookmark not defined

4.2.1 Quan sát khuẩn lạc Error! Bookmark not defined 4.2.1 Nhuộm Gram (quan sát vi thể) Error! Bookmark not defined 4.2.3 Nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined

4.3 Thử nghiệm sinh lý Error! Bookmark not defined.

4.3.1 Di động Error! Bookmark not defined

4.4 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Error! Bookmark not defined 4.5 Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined

4.5.1 Kết quả thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined 4.5.2 Lên men lactose Error! Bookmark not defined 4.5.3 Indole Error! Bookmark not defined 4.5.4 Khử nitrate Error! Bookmark not defined 4.5.5 Phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined

4.5.6 Sinh hơi H 2 S Error! Bookmark not defined 4.5.7 Thử nghiệm phân giải lipase Error! Bookmark not defined 4.5.8 Thử nghiệm phân giải protease Error! Bookmark not defined

4.6 Khả năng đối kháng với vi sinh vật gây hại của hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined

4.6.1 Kết quả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined 4.6.2 Kết quả đối kháng với nấm gây bệnh Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị… 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

 BSL: Bướm sáp lớn

 LB: Luria-Bertani

 LPS: Lipopolysaccharide

 EPN: Entomopathogenic Nematodes

 HBHL: Hydroxybutanoyl homoserine lactone

 IJs: Infective Juveniles

 NBTA: Nutrient bromothymol blue agar

 PDA: Potato glucose agar

 QS: Quorum Sensing

 TSA: Tryptone Soya Agar

 VKCS: Vi khuẩn cộng sinh

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng 13

Bảng 2.2 Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus 15

Bảng 2.3 Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus 16

Bảng 2.4 Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus / Photorhabdus 18

Bảng 2.6 Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus Error! Bookmark not defined Bảng 2.7 Đặc điểm của một số loài Photorhabdus 23

Bảng 2.8 Đặc điểm của một số loài Xenorhabdus 24

Bảng 2.9 Các chất kháng sinh trong Photorhabdus 30

Bảng 2.10 Các chất kháng sinh trong Xenorhabdus 32

Bảng 2.11 Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh 38

Bảng 2.12 Các chế phẩm EPN tại Việt Nam 45

Bảng 3.1 Thành phần thuốc nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Thành phần thuốc thử trong thí nghiệm khả năng phân giải nitrate Error! Bookmark not defined

Bảng 3.3 Thành phần thuốc thử protease Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Quy ước đường kính vòng phân giải Error! Bookmark not defined

Bảng 4.2 Khả năng phân giải protein của P1 và X1trên môi trường agar gelatin và chicken

offal Error! Bookmark not defined

Bảng 4.3 Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn khảo sát với Salmonella,E Coli, B

subtilis Error! Bookmark not defined

Bảng 4.4 Khả năng đối kháng của chủng P1 và X1 với Salmonella, E Coli, B subtilis,

sau lần cấy chuyền thứ 7 Error! Bookmark not defined

Bảng 4.5 Kết quả đối kháng nấm Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ nhất Error!

Bookmark not defined

Bảng 4.6 Kết quả đối kháng Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ bảy Error!

Bookmark not defined

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng 14

Hình 2.2 Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus 16

Hình 2.3 Vai trò của pha I 19

Hình 2.4 Vai trò của pha II 19

Hình 2.5 Giả định về khả năng gây độc của X.nematophila 25

Hình 2.6 Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) 28

Hình 2.7 Các hướng ứng dụng của vi khuẩn cộng sinh 42

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Error! Bookmark not defined

Hình 3.2 Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica Error! Bookmark not

defined.

Hình 3.3 Phân lập Xenorhabdus từ Steinernema guangdongense Error! Bookmark not

defined.

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc quan sát qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.7 Hình thái tiên mao Error! Bookmark not defined Hình 4.8 Hình thái vi khuẩn khi nhuộm gram Error! Bookmark not defined Hình 4.9 Hiện tượng thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined Hình 4.10 Hiện tượng thử nghiệm di động trên đĩa thạch Error! Bookmark not defined Hình 4.11 Hiện tượng thử nghiệm di động trong ống nghiệm Error! Bookmark not

defined.

Hình 4.12 Hiện tượng thử nghiệm lên men lactose Error! Bookmark not defined Hình 4.13 Hiện tượng thử nghiệm indole Error! Bookmark not defined Hình 4.14 Hiện tượng thử nghiệm khử nitrate Error! Bookmark not defined Hình 4.15 Hiện tượng thử nghiệm phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined

Hình 4.16 Hiện tượng thử nghiệm sinh hơi H2S Error! Bookmark not defined

Hình 4.17 Hiện tượng phân giải lipase trên tween 20 Error! Bookmark not defined Hình 4.18 Hiện tượng phân giải lipase trên chicken offal Error! Bookmark not defined Hình 4.19 Hiện tượng phân giải gelatin của P1 Error! Bookmark not defined

Hình 4.20 Hiện tượng phân giải gelatin của X1 Error! Bookmark not defined Hình 4.21 Hiện tượng phân giải gelatin của P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.22 Hiện tượng phân giải gelatin của X1 Error! Bookmark not defined

Hình 4.23 Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.24.Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với X1 Error! Bookmark not defined Hình 4.25.Thử nghiệm hoạt tính kháng E coli với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.26 Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.27 Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.29.Thử nghiệm hoạt tính kháng E coli với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.30 Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.31 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.32 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.33 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.34 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.35 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.36 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.37 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.38 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.39 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU

oOo

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh

mẽ cả về số lượng và chất lượng, trong đó một số mặt hàng nông sản như cà phê, lúa gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trường quốc tế Nhu cầu tăng sản lượng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang được đặt ra,

đi đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn

Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu như tất cả các nước nông nghiệp người nông dân ít được trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo tính bền vững Vì vậy ở không ít nơi người nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết được tác hại nhưng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lượng, thu lợi nhuận Chính việc sử dụng mà không tuân thủ các quy định về liều lượng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn Không những vậy, thế giới đang phải đối mặt với vấn đề nhức nhối là tồn dư quá mức của các chất hóa học có thể gây hại cho sức khỏe con người trong các sản phẩm nông nghiệp Vì vậy xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho con người, đồng thời tính an toàn môi trường cao

Trong các biện pháp sinh học được sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký

sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang

được các nước trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý Tuy nhiên, các loài tuyến trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt vi khuẩn cộng sinh trong ruột chúng, nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng, gồm

Photorhabdus trong Heterorhabditis và Xenorhabdus trong Steinernema Với vai

trò đặc biệt, hai loài vi khuẩn trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến trùng – vi khuẩn Đây được coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ

mà nó cộng sinh Mặt khác có thể thấy được khả năng kháng mạnh với các loài vi

khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều này mở ra những ứng dụng rất lớn Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số

nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus, ở

các tỉnh thành miền Nam chưa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn cộng sinh này Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm

Heterorhabditis indica và Steinernem guangdongense, trên thế giới Heterorhabditis indica được ứng dụng rộng rãi vì những tác dụng mang lại trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và Steinernema guangdongense là một loài tuyến trùng mới chưa có bất kỳ

nghiên cứu về loài vi khuẩn cộng sinh với nó Vì những lợi ích rất quan trọng của loài vi khuẩn này và yêu cầu mở rộng kiến thức khoa học mà người tiến hành đề tài

đã chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp là : “Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học

của Photorhabdus spp và Xenorhabdus spp từ Heterorhabditis indica và Steinernema guangdongense ”

1.2 Mục đích của nghiên cứu

Phân lập các chủng vi khuẩn thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có

khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây hại cho gia súc và nông nghiệp

Khi thành công đề tài sẽ đánh dấu cho triển vọng về việc sử dụng vi khuẩn

Xenorhabdus và Photohabdus trong hoạt động sản xuất nông nghiệp đáp ứng được

yêu cầu có thể sản xuất quy mô lớn, nhanh chóng, hiệu quả cao

1.3 Nhiệm vụ của nghiên cứu

- Phân lập các chủng thuộc hai chi vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus

- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với ba loài vi

khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella và loài nấm Phytophthora tại

hai thời điểm cấy chuyền là sau lần đầu tiên và lần thứ 7 cấy chuyền

1.4 Các kết quả đạt được của đề tài

- Phân lập được hai chủng vi khuẩn P1 và X1 thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus

- Kết quả khả năng đối kháng cho thấy sự thể hiện khả năng đối kháng của P1 và X1 với các vi khuẩn, nấm gây hại Mức đối kháng của mỗi chủng với mỗi loài thử nghiệm là khác nhau và sau hai thời điểm cấy chuyền là khác nhau

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN

oOo

2.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)

2.1.1 Khái niệm EPN

EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để

chỉ các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis,

chúng vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng

Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp được hình thành trong tự nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống

Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng sinh với vi khuẩn Photorhabdus Sở dĩ được gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và

tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản Đây là một hiện tượng cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

2.1.2 Vai trò và ưu thế của EPN

Vai trò của EPN được thấy trước tiên như là các thiên địch tự nhiên có tác dụng điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại Thực tế cho thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu như không

bùng phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

EPN đang nhận được sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có những ưu thế sau :

a Phương pháp sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học đã được xác nhận là

an toàn với người, động vật và thực vật

b EPN có khả năng ký sinh và gây hại trên một diện rộng đối với các loài sâu hại và côn trùng

c Các loài sâu hại và côn trùng không có khả năng kháng lại tổ hợp này

d Có khả năng sản xuất sinh khối lớn trong điều kiện in vitro và in vivo

e Áp dụng thực tiễn dễ dàng bởi biện pháp và thiết bị phun thuốc chuẩn đang được sử dụng

f Có khả năng kết hợp với nhiều loại thuốc hóa học để tăng hiệu quả sử dụng

g Có khả năng chủ động đi tìm vật chủ và giết chết chúng sau 48h

h Tồn tại bền bỉ trong đất và nhân nhanh khi gặp sâu hại nên chỉ cần phun chế phẩm EPN cho cả một quá trình lâu dài

i Dễ dàng tuyển chọn các chủng đạt yêu cầu theo nhu cầu sử dụng

2.2 Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng

Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã được đề cập:

- Họ Steinernematidae với hai giống Steinernema và Neosteinernema

- Họ Heterorhabditidae với chỉ một giống Heterorhabditis

Steinernema đã được Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này đã được sử dụng trước đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,

trước năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana

Hiện nay có khoảng 56 loài đã được mô tả Neosteinernema được Nguyễn và Smart

mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối

Heterorhabditis được Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài Đây được

đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này (Nguyễn Bá Khương)

Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng 5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lượng vật chủ

Bảng 2.1 Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng

Giống Steinernema Neosteinernema Heterorhabditis

2.2.2 Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis

Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJs) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng

sẽ phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tương của côn trùng tạo ra hiện tượng ngộ độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ Vi khuẩn

sẽ phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh dưỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1 Phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng như hình 2.1

Hình 2.1 Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng

a Chu trình sống khi đầy đủ dinh dưỡng

Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn như hình 2.1 Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ thứ 2 Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản như ở thế

hệ 1

b Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng

Khi không có đủ nguồn dinh dưỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn như vòng nửa vòng cung phía dưới của hình 2.1 Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1

sẽ nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ

2.3 Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus

Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây

bệnh với côn trùng cũng như cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng Đây được đánh giá là hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và David Clarke, 2011)

Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột)

2.3.1 Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những

đặc điểm cơ bản sau:

a Nơi cư trú

Họ vi khuẩn đường ruột gồm những vi khuẩn thường trú trên cơ thể, ở ống tiêu hóa của người và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh

b Hình thái

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha bào Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số

vi khuẩn khác di động (E coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế bào Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella

Có thể có một số enzyme như urease, tryptophanase

Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

2.3.2 Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus

Bảng 2.2 Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus

Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy

mối quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1

Hình 2.2 Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

2.3.3 Một số đặc điểm phân biệt cơ bản

Đây là hai chi có sự tương tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên

có thể phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản được nhắc đến trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus

1 Trình tự 16S rRNA Tại vị trí 208 – 213

TGAAAG

Tại vị trí 208 – 211 TTCG

2 Đặc điểm hình thái

Tế bào có hình que, kích thước vào khoảng (0,5 - 2 ×

1 – 10 µm)

Tế bào có hình que và kích thước là (0,3 - 2 × 2 –

10 µm)

3 Điều kiện nuôi cấy

Phát triển tối ưu ở 280C, một vài chủng phát triển ở

37 - 380C

Điều kiện phát triển tốt nhất là 280C hoặc nhỏ hơn, một vài chủng phát triển ở 40C

5 Loài vật chủ cộng

sinh Heterorhabditis Steinernema

Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng loài và chủng cụ thể

a Đặc điểm sinh lý nổi bật

Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá

trình lên men và hô hấp trong tế bào

Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tượng biến đổi pha, đây được coi

là một hiện tượng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này

 Hiện tượng biến đổi pha:

Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn

về một số điểm như hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn Nguyên nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng

nguyên ở pha thứ cấp Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ

cấp) là dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể xuất hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trưởng

 Đặc điểm của hai pha:

Đặc điểm trước tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu môi trường để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhưng ngược lại pha thứ cấp lại không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trưng như pha I Một đặc điểm rất quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhưng hầu như không có ở pha II Có thể thấy được một số các đặc điểm khác nhau cơ bản

ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus /

Phẳng, trong mờ, cạnh đều

Hình thái khuẩn lạc trên

MacConkey

Các khuẩn lạc hút nước, có màu đỏ trung tính, đỏ, đỏ hồng

Không xốp, màu đỏ, trung tính, trắng, vàng

Hình thái khuẩn lạc trên

NBTA

Dạng xốp, xanh dương, oliu hoặc xanh lá

Xung quanh khuẩn lạc có vùng trong, một phần agar

bị biến màu

Không có dạng xốp, màu

đỏ hoặc nâu sẫm

Không tạo thành vùng trong suốt bao quanh

Sắc tố tạo thành trong môi

Phụ thuộc chủng và môi trường Thường có màu vàng thẫm, da cam Màu thay đổi không mạnh khi thêm NaOH do nồng độ sắc

tố thấp

Hình dạng và hình thái tế

bào

Tế bào dạng que, kích thước nỏ đến trung bình (dài 3 - 5 , rộng 1,5 –

2 ) Cơ thể có thể vùi hình oval hoặc hình vuông

Tế bào tương đối dài, kích thước nhỏ đến trung bình (6-7 , rộng 1 - 1,5 )

Cơ thể ít có thể vùi

Phát huỳnh quang ở

Photorhabdus

Hoạt tính kháng khuẩn Dương tính Âm tính

Sinh trưởng của tuyến

trùng trong nhân nuôi vi

khuẩn

Tuyến trùng sinh trưởng tốt, tăng nhanh kích thước,

số lượng thế hệ sau và khả năng sống sót

Nhân giống tuyến trùng khó khăn, sinh trưởng đình trệ, chết nhiều

 Vai trò của hai pha:

Pha I (pha sơ cấp):

Hình 2.3 Vai trò của pha I

Đây là pha được coi là đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh đối với côn trùng gây hại và cung cấp dinh dưỡng để tuyến trùng phát triển, sinh sản Pha I có rất nhiều enzyme như protease, lipase, lecithinase, các enzyme này đóng vai trò trong việc phá vỡ các đại phân tử trong cơ thể côn trùng để cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của chính nó và tuyến trùng Mặt khác, có rất nhiều các hợp chất kháng sinh đã được tìm thấy ở pha này, chúng có nhiệm vụ tấn công côn trùng và bảo vệ xác côn trùng khỏi sự xâm nhập của các loài vi sinh vật cạnh tranh chất dinh dưỡng ở xác côn trùng

Hình 2.4 Vai trò của pha II

Tế bào vi khuẩn cộng sinh

Tạo các chất kháng

sinh

Tạo các enzyme ngoại bào

Cung cấp dinh dưỡng

Bảo vệ xác côn trùng

Tế bào vi khuẩn cộng sinh

Biến đổi kháng nguyên

Tránh hàng rào miễn dịch vật chủ

b Đặc điểm hình thái nổi bật

* Khuẩn mao:

Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm Chúng có đường kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2 - 2,5 nm), số lượng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một tiểu đơn vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính Khuẩn mao

của vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus được đánh giá có vai trò trong gây độc

vì bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt động

* Tiên mao:

Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy

rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đưa vi khuẩn đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các nguồn dinh dưỡng

Trong hầu hết chủng X nematophila đã được kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể

hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có tiên mao và không thể di động Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa

tiên mao fliC và filD của X nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi

trong tế bào thứ cấp nhưng không được sao chép Sự sao chép của fliCD operon bị điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao) Việc không có tiên mao ở tế bào thứ cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD

c Đặc điểm sinh hóa

* Photorhabdus

Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus,

hầu hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae

Bảng 2.5 Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus

Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae

Acid hóa fructose, D - mannose, maltose,

ribose, N – acetylglucosamine

Hầu hết +

Nguồn cacbon và năng lượng từ fumarate,

glucosamine, L - glutamate, L - malate, L -

proline, Succinate, L – tyrosine

+

Bảng 2.6 Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus

d Đặc điểm một số loài đã được nghiên cứu

Bảng 2.7 Đặc điểm của một số loài Photorhabdus

Thử nghiệm P

luminescens

P

luminescens luminescens

P luminescens laumondii

P

luminescens akhustii