Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phương pháp thủy phân và lên men đông thời (ssf) với saccharomyces cerevisiae và pichia anomala

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM TẬN DỤNG BÃ VỎ CHUỐI SẢN XUẤT BIOETHANOL ĐỂ TIẾP TỤC THU NHẬN SẢN PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) VỚI Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS TRẦN THỊ TƯỞNG AN Sinh viên thực MSSV: 1311101021 : TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT Lớp: 13DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2017 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm cuối trƣờng Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, đƣợc vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hồn thành chƣơng trình học Tơi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn Ths Trần Thị Tƣởng An tiến hành Phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Những số liệu, hình ảnh hồn tồn trung thực chƣa đƣợc cơng bố Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 Sinh viên thực Trần Thị Ánh Nguyệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục động viên, chỗ dựa tinh thần vững cho con, ngƣời giúp đứng vững sau lần vấp ngã Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Trƣờng Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình truyền đạt cho em kiến thức quý giá từ ngày bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Trần Thị Tƣởng An trực tiếp hƣớng dẫn dìu dắt em suốt trình làm đồ án tốt nghiệp vừa qua Em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời giới thiệu em với cô Trần Thị Tƣởng An để tiến hành làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đình Quân tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Cảm ơn bạn Châu Nguyễn Quỳnh Nhƣ, Nguyễn Đăng Nguyên, Võ Mạnh Hùng, Văn Bảo Huy, Nguyễn Minh Thiện, Võ Thị Thảo Trang, Phạm Nhƣ Ngọc anh Nguyễn Anh Duy đồng hành, sát cánh giúp đỡ suốt ngày làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 SVTH: Trần Thị Ánh Nguyệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lƣợc Bioethanol 1.1.1 Khái niệm Bioethanol 1.1.2 Sản xuất Bioethanol 1.2 Nguyên liệu Lignocellulose 1.2.1 Cellulose 1.2.2 Hemicellulose 1.3 Qúa trình sản xuất Bioethanol từ lignocellulose 1.3.1 Quá trình tiền xử lý 10 1.3.2 Qúa trình thủy phân 12 1.3.3 Qúa trình lên men 15 1.4 Giới thiệu sơ lƣợc nguyên liệu vỏ chuối 22 1.4.1 Chuối 22 1.4.2 Thànhphần hóa học chuối 22 1.4.3 Diện tích sản lượng trồng chuối nước ta 23 1.5 Tình hình nguyên cứu bioethanol Việt Nam giới 25 1.5.1 Tại Việt Nam 25 1.5.2 Trên giới 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Địa điểm, thời gian đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2 Nguyên vật liệu 26 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.1 Nguyên liệu vỏ chuối 26 2.2.2 Enzyme 26 2.2.3 Nấm men 26 2.2.4 Dụng cụ thiết bị 26 2.2.5 Môi trường nuôi cấy hóa chất sử dụng 28 2.3 Bố trí thí nghiệm 30 2.3.1 Sơ đồ quy trình 30 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 31 2.4 Phƣơng pháp phân tích 33 2.4.1 Phương pháp hóa lý 33 2.4.2 Phƣơng pháp vi sinh 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết khảo sát đặc điểm chủng nấm men sử dụng đề tài 43 3.1.1 Saccharomyces cerevisiae 43 3.1.2 Pichia anomala 44 3.2 Phân tích thành phần vỏ chuối bã nguyên liệu sau lên men lần 46 3.3 Quá trình thủy phân lên men đồng thời 47 3.3.1 Khảo sátquá trình SSF lần theo thời gian 47 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme bổ sung 52 3.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ nấm men bổ sung 55 3.3.4 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến trình lên men 58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1 Kết luận 61 4.2 Đề nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT: Số thứ tự SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation SSF: Simultaneous Saccharification Fermentation SSCF: Simultaneous Saccharification and Cofermentation Máy UV-VIS: Ultraviolet–visible spectroscopy HL: Hàm lƣợng SDA: Sabouraud Dextrose Agar SDB: Sabouraud Dextrose Broth iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự tác động phƣơng pháp tiền xử lý khác lên cấu trúc lignocellulose 11 Bảng 1.2 Đặc điểm loại nấm men vi khuẩn đƣợc xem xét để sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose 19 Bảng 1.3 Diện tích gieo trồng chuối phân theo vùng (Đơn vị: ha) 23 Bảng 1.4 Sản lƣợng trồng chuối phân theo vùng (Đơn vị: tấn) 24 Bảng 1.5 Thành phần dinh dƣỡng loại chuối 100g chuối chín 24 Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng 28 Bảng 3.1 Thành phần vỏ chuối khô trƣớc lên men bã chuối sau lên men lần 46 Bảng 3.2.Tổng hợp kết nghiên cứu thu đƣợc theo thời gian 48 Bảng 3.3 Tổng hợp kết nghiên cứu tỷ lệ enzyme bổ sung khác 48h .52 Bảng 3.4 Tổng hợp kết nghiên cứu tỷ lệ nấm men bổ sung khác 48h 55 Bảng 3.5 Tổng hợp kết nghiên cứu nồng độ pH khác 58 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Thành phần lignocellulose Hình 1.2 Tỉ lệ thành phần có lignocellulose .5 Hình 1.3 Cấu trúc lignocellulose Hình 1.4 Cơng thức hóa học cellulose Hình 1.5 Các đơn vị lignin Hình 1.6 Quy trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol .9 Hình 1.7 Sự tạo thành phức hợp enzyme – chất chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm .13 Hình 1.8 Sơ đồ bƣớc thủy phân cellulose cellulase .15 Hình 1.9 Qúa trình đƣờng phân 16 Hình 1.10 Quá trình pyruvate chuyển hóa thành ethanol 17 Hình 1.11 S cerevisiae P anomala .20 Hình 1.12 Quả chuối sứ 22 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Hình 2.2 Mẫu sau đun phƣơng pháp Miller .37 Hình 2.3 Mẫu sau đun phƣơng pháp Kiursher – Hoff .38 Hình 2.4 Mẫu sau chuẩn độ acid .39 Hình 2.5 Ngun liệu sau đƣợc trung hòa NaOH 10N .40 Hình 2.6 S cerevisiae P.anomala đƣợc nhân giống môi trƣờng SDB 41 Hình 2.7 Cấy trang 42 Hình 3.1 Đặc điểm đại thể (a), vi thể (b) S.cerevisiae .43 Hình 3.2 Đƣờng cong sinh trƣởng S cerevisiae (mơitrƣờng SDB) 44 Hình 3.3 Đặc điểm đại thể (a) vi thể (b) P anomala 45 Hình 3.4 Đƣờng cong sinh trƣởng P anomala (môi trƣờng SDB) 46 Hình 3.5 Vỏ chuối khơ trƣớc lên men bã chuối sau lên men lần .47 Hình 3.6 Sự biến đổi HL đƣờng khửtheo thời gian 49 Hình 3.7 Sự biến đổi HL cồn theo thời gian 49 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8 Sự biến đổi HLcellulose theo thời gian .50 Hình 3.9 Ảnh hƣởng thời gian đến phát triển tế bào .50 Hình 3.10 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53 Hình 3.11 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53 Hình 3.12 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 54 Hình 3.13 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung .56 Hình 3.14 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 56 Hình 3.15 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 57 Hình 3.16 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào nồng độ pH khác .58 Hình 3.17 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào nồng độ pH khác .59 Hình 3.18 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào nồng độ pH khác 59 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong bối cảnh nay, giới đứng trƣớc nguy khủng hoảng lƣợng trầm trọng nguồn lƣợng hóa thạch có hạn trái đất dần đến cạn kiệt Từ lâu dầu mỏ ln giữ vai trò quan trọng chiến lƣợc phát triển kinh tế quốc gia, dầu mỏ khí đốt chiếm 68 – 80% nguồn lƣợng giới Theo dự báo nhà khoa học giới nguồn lƣợng bị cạn kiệt vòng 40 – 50 năm nữa[15] Những nguồn lƣợng dần đƣợc giới khoa học ngƣời quan tâm hơn, nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật hƣớng tạo nguồn nhiên liệu thay phần cho nguồn nhiên liệu hóa thạch cạn kiệt, đảm bảo đƣợc an ninh lƣợng cho quốc gia Nhiên liệu sinh học nhiên liệu có nguồn gốc từ sinh vật, thân thiện với mơi trƣờng ngun liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học có hàm lƣợng lƣu huỳnh thấp, khơng chứa chất độc hại hợp chất thơm, mặt khác thải nhiên liệu sinh học vào đất tốc độ phân hủy sinh học nhanh gấp lần so với nhiên liệu dầu mỏ[16] Nhiên liệu sinh học gây hiệu ứng nhà kính, đặc biệt nhiên liệu có khả tái sinh gần nhƣ vô tận Bioethanol đƣợc sản xuất phƣơng pháp lên men chƣng cất từ loại ngũ cốc chứa tinh bột (bắp) đƣờng (mía) Ngồi ra, ethanol đƣợc sản xuất từ lignocellulose, từ phụ phẩm có chứa hợp chất cellulose cao.Lignocellulose loại biomass phổ biến giới Chính vậy, sản xuất ethanol từ biomass cụ thể lignocellulose từ phế phẩm nơng nghiệp giải pháp thích hợp bối cảnh giá nhiên liệu tăng cao, ô nhiễm môi trƣờng ngày trầm trọng vấn đề an ninh lƣợng thực… lại đƣợc ý tiếp tục nghiên cứu hoàn thiên giới[2] Hàng năm, sản xuất nông nghiệp Việt Nam tạo lƣợng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu lignocellulose từ mùa vụ Phế phụ phẩm nông nghiệp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong gian đoạn đầu trình lên men phải cho dịch đƣờng tiếp xúc với oxy Lúc nấm men cần oxy để tích lũy lƣợng sinh khối cần thiết cho trình lên men Tiếp theo, để chuyển hóa đƣờng thành ethanol, nấm men phải đƣợc phát triển điều kiện yếm khí hồn tồn Vì mơi trƣờng này, hơ hấp nấm men bị ức chế bắt đầu phải tìm lƣợng cần thiết đƣờng lên men Để đáp ứng lƣợng cần thiết nấm men cần phân hủy lƣợng đƣờng lớn đƣờng chuyển hóa thành ethanol CO2 Đó nguyên nhân muốn có ethanol nhiều khơng đƣợc thống khí mơi trƣờng Nếu có oxy giai đoạn rƣợu tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme bổ sung Thực khảo sát lƣợng enzyme cho vào lên q trình SSF lần Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần lấy giá trị trung bình Kết trình bày đồ thị bảng sau Bảng 3.3 Tổng hợp kết nghiên cứu tỷ lệ enzyme bổ sung khác 48h Tỷ lệ enzyme HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose HL cồn (%) bổ sung (%) khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) 0,1 2,87 3,4 29,48 1,4 0,3 5,31 3,0 23,53 1,4 0,5 7,49 3,0 15,86 1,6 0,7 7,63 3,0 15,22 1,6 0,9 7,94 3,0 13,32 1,6 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HL đƣờng khử (mg/ml) 7.49 7.63 0.5 0.7 7.94 5.31 2.87 0.1 0.3 0.9 Tỷ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.10 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung HL cellulose (mg/ml) 35 30 29.48 23.53 25 20 15.86 15.22 15 13.32 10 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Tỉ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.11 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.65 1.6 1.6 1.6 0.5 0.7 0.9 HL cồn (%) 1.6 1.55 1.5 1.45 1.4 1.4 0.1 0.3 1.4 1.35 1.3 Tỷ lệ enzyme bổ sung (%) Hình 3.12 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung Dựa vào kết thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử tỉ lệ thuận với % enzyme cho vào Hàm lƣợng đƣờng khử thấp 0,1% 2,87 mg/ml cao 0,9% 7,94 mg/ml Khi lƣợng enzyme tăng từ 0,1% đến 0,9% hàm lƣợng cellulose giảm dần từ 29,48 mg/ml xuống 13,32 mg/ml Thủy phân lên men đồng thời bao gồm hai trình diễn song song, thủy phân cellulose thành glucose lên men glucose thành ethanol Phản ứng thủy phân phản ứng dị thể rắn/ lỏng, phản ứng lên men phản ứng đồng thể Khi sử dụng nồng độ enzyme nhỏ (0,1% 0,3%) nồng độ cồn sinh thấp (1,4%) dùng lƣợng enzyme nhỏ khả hấp thụ lên bề mặt sơ sợi dẫn đến khả xâm nhập vào cấu trúc cellulose trở nên khó khăn Khi sử dụng nồng độ enzyme 0,5% nồng độ cồn sinh tăng cao (1,6%) Khi tăng đến nồng độ enzyme 0,7% 0,9% nồng độ cồn sinh khơng thay đổi (1,6%) nồng độ cao xảy trình cạnh tranh hấp thụ lên bề mặt sơ sợi dẫn đến nồng độ cồn thu đƣợc không đổi 54 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Enzyme ảnh hƣởng trực tiếp đến trình thủy phân Khi tỷ lệ enzyme cho vào tăng có nhiều enzyme lúc cơng vào chất nên lƣợng đƣờng sinh tăng Khi enzyme công vào celulose, cellulose có cấu trúc xốp vơ định hình dễ bị thủy phân trƣớc Khi phần cellulose tốc độ phản ứng thủy phân giảm dần, khả công vào cấu trúc lại cellulose trở nên khó khăn Vì giai đoạn lƣợng enzyme bổ sung vào tăng lên không giúp cải thiện tốc độ phản ứng nhƣ tạo thành nhiều glucose Việc cho thấy ứng với lƣợng chất định có lƣợng enzyme định để hiệu suất đạt cƣc đại Mặt khác, chi phí để mua enzyme cao nên cần đƣợc cân nhắc Vì thí nghiệm tỉ lệ enzyme bổ sung thích hợp 0,5% 3.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ nấm men bổ sung Giống nấm men phải đƣợc nuôi cấy để đạt đến mật độ tế bào 109 cfu/ml (tƣơng ứng với thời điểm 18h đến 20h đƣờng cong tăng trƣởng) Thực khảo sát tỉ lệ nấm men bổ sung vào trình SSF lần Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần lấy giá trị trung bình Kết trình bày đồ thị bảng sau Bảng 3.4 Tổng hợp kết nghiên cứu tỷ lệ nấm men bổ sung khác 48h Tỷ lệ nấm HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose men bổ sung khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) 5,35 3,0 28,12 1,3 3,91 2,9 27,47 1,4 3,86 3,0 24,51 1,5 3,58 3,0 13,07 1,5 1,75 3,0 10,11 1,5 HL cồn (%) (%) 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HL đƣờng khử (mg/ml) 5.35 3.91 3.86 3.58 1.75 1 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.13 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung HL cellulose (mg/ml) 30 28.12 27.47 24.51 25 20 15 13.07 10.11 10 5 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.14 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.55 1.5 1.5 1.5 HL cồn (%) 1.5 1.45 1.4 1.4 1.35 1.3 1.3 1.25 1.2 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Hình 3.15 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung Tỉ lệ nấm men bổ sung vào dịch lên men nhau, cụ thể nhƣ tỉ lệ 1% loại bổ sung 1% Hàm lƣợng đƣờng khử giảm dần theo tỉ lệ nấm men bổ sung vào, tỷ lệ nấm men 1% hàm lƣợng đƣờng khử 5,35 mg/ml tỷ lệ 9% 1,75 mg/ml Hàm lƣợng cellulose đạt cao tỷ lệ nấm men bổ sung 1% 28,12 mg/ml giảm dần đến tỷ lệ 9% 10,11 mg/ml Hàm lƣợng cồn tăng dần từ tỷ lệ 1% đến 5% (từ 1,3% đến 1,5%) không thay đổi tỷ lệ 7% 9% Đối với tỷ lệ nấm men bổ sung 1% 3%, hàm lƣợng nấm men bổ sung vào nên không đủ để lên men hết lƣợng đƣờng tạo Đối với tỷ lệ nấm men 5% trở đi, hàm lƣợng nấm men tƣơng đối cao nên hiệu lên men tăng cao so với tỷ lệ 1% 3% Nấm men nhân tố tạo trình lên men, chuyển hóa đƣờng thành ethanol khí carbonic Trên thực tế, tỷ lệ nấm men bổ sung tăng hiệu suất lên men tăng dần Khi hàm lƣợng nấm men vƣợt ngƣỡng giá trị cần thêm vào dịch lên men hiệu suất chuyển hóa ethanol khơng tăng Khi mật độ nấm men cao, nấm men có xu hƣớng cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng để sinh trƣởng phát 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP triển thay lên men ethanol Vì dựa kết thí nghiệm ta chọn tỉ lệ bổ sung nấm men 5% thỏa mãn với yêu cầu thí nghiệm 3.3.4 Ảnh hưởng pH mơi trường ban đầu đến trình lên men Thực khảo sát giá trị pH môi trƣờng ban đầu chuẩn bị cho q trình SSF lần Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần lấy giá trị trung bình Kết trình bày đồ thị bảng sau Bảng 3.5 Tổng hợp kết nghiên cứu nồng độ pH khác Nồng độ pH HL đƣờng HL đƣờng HL cellulose khử (mg/ml) tổng (ºBx) (mg/ml) 4,0 11,39 2,0 20,07 1,0 4,5 7,96 2,6 25,31 1,5 5,0 4,70 3,0 18,59 1,6 5,5 2,50 3,6 11,05 1,4 6,0 1,40 3,6 7,96 1,3 HL đƣờng khử (mg/ml) 12 HL cồn (%) 11.39 10 7.96 4.7 2.5 1.4 4.5 5.5 Nồng độ pH Hình 3.16 Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào nồng độ pH khác 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HL cellulose (mg/ml) 30 25.31 25 20.07 18.59 20 15 11.05 7.96 10 4.5 5.5 Nồng độ pH Hình 3.17 Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào nồng độ pH khác 1.8 1.6 1.5 1.6 1.4 HL cồn (%) 1.4 1.2 1.3 1 0.8 0.6 0.4 0.2 4.5 5.5 Nồng độ pH Hình 3.18 Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào nồng độ pH khác Qua kết thí nghiệm cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử cao nồng độ pH 4,0 11,39 mg/ml thấp pH 6,0 1,40 mg/ml Tại pH 4,0 hàm lƣợng cellulose 20,07 mg/ml tăng lên pH 4,5 ( 25,31 mg/ml), sau bắt đầu giảm dần pH 6,0 7,96 mg/ml Hàm lƣợng cồn pH 4,0 1,0%, tăng dần đến pH 5,0 (1,6%) sau giảm dần đến pH 6,0 1,3% 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nồng độ ion H+ canh trƣờng ảnh hƣởng lớn đến hoạt động nấm men Chúng có khả thay đổi điện tích tế bào, làm tăng giảm mật độ thẩm thấu chất dinh dƣỡng nhƣ chiều hƣớng trình lên men Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt trạng thái ion định, trạng thái phụ thuộc vào pH canh trƣờng Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ƣu để tạo ethanol 4,5 – 5,0 Nếu pH thấp khoảng 3,0 – 4,0 nấm men hoạt động đƣợc vi khuẩn bị ức chế, pH cao tạo sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn sản phẩm phụ trình lên men tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp Theo kết thí nghiệm cho thấy pH 5,0 enzyme hoạt động có hiệu sinh đƣợc nhiều ethanol Khoảng pH hoạt động enzyme có ý nghĩa với sản xuất cơng nghiệp quy mơ công nghiệp, việc giữ pH giá trị không đổi khó khăn Vì việc đƣa khoảng pH hoạt động giúp trình vận hành trở nên đơn giản đạt hiệu trình cao 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Thông qua đồ án có số kết luận nhƣ sau: - Xác định đƣợc thành phần vỏ chuối gồm: độ ẩm 7,5%, độ tro 9,4%, lignin 22,3%, hàm lƣợng đƣờng khử 142,6 mg/g, hàm lƣợng cellulose 367,8 mg/g - Xác định đƣợc thành phần nguyên liệu sau lên men lần gồm: độ ẩm 42,0%, lignin 0,15%, hàm lƣợng đƣờng khử 59,7 mg/g, hàm lƣợng cellulose 38,5 mg/g - Khảo sát đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng S cerevisiae, thời điểm thích hợp để lên men sau 18h nhân giống với mật độ tế bào đạt 8,71×108cfu/ml - Khảo sát đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng P anomala, thời điểm thích hợp để lên men sau 20h nhân giống với mật độ tế bào đạt 1,05×1011cfu/ml - Q trình tiền xử lý với thông số gồm: tác nhân acid acetic 2,75% (v/v), tỉ lệ nguyên liệu / dung dịch 1:20, thời gian 48h - Quá trình thủy phân lên men đồng thời với thông số tối ƣu gồm: o Thời gian lên men 48h o Tỷ lệ enzyme bổ sung 0,5% (v/v) o Tỷ lệ nấm men bổ sung 5% (v/v) cho loại o pH môi trƣờng ban đầu 5,0 o Lƣợng ethanol thu đƣợc 1,6% 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP So với đề tài trƣớc rút ngắn đƣợc thời gian lên men từ 72h xuống 48h, tỷ lệ enzyme bổ sung giảm từ 0,7% (v/v) xuống 0,5% (v/v), tỷ lệ nấm men bổ sung giảm từ 9% (v/v) 5% (v/v) cho loại Kết cho thấy tái sử dụng bã chất vỏ chuối để lên men thu nhận ethanol Tuy nhiên kết chƣa đƣợc khả quan lƣợng ethanol sinh thấp 4.2 Đề nghị Kết hợp sử dụng nhiều chủng nấm men khác có khả sử dụng nguồn đƣờng carbon carbon hiệu Khảo sát thêm ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình lên men Bổ sung thêm chất dinh dƣỡng để cải thiện hàm lƣợng ethanol tạo thành Xây dựng quy trình sản xuất quy mô công nghiệp 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bích, N.T.N., Kỹ thuật cellulose giấy 2003, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Hồng Minh Nam (2009): Nghiên cứu cơng nghệ thiết bị liên tục xử lý rơm rạ nước để lên men etanol ĐH Bách Khoa- Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Huỳnh Ngọc Vĩ, 2008 Nghiên cứu sản xuất ethanol từ bã khoai mì, Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Kĩ thuật Hóa học, đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hằng Nga, Nghiên cứu khả sản xuất bioethanol sinh học từ phụ phế phẩm nông nghiệp, Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM, Việt Nam, 2009 Võ Thị Kiều Thanh ,2013 Nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển, nghiên cứu khoa học, Viện sinh học Nhiệt Đới, TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI A Sluiter, B.H., D Hyman, C Payne, R Ruiz, C Scarlata, J Sluiter, D Templeton, and J Wolfe, Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Samples Laboratory Analytical Procedure (LAP), 2008 Chandel AK, Chan EC, Rudravaram R, Narasu ML, Rao LV, Ravinda (2007), “Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal”, Biotechnol Mol Biol Rev, pp 14-32 63 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Tatlor&Francis, 1996 P 119-285 E.Wyman, C., Handbook on Bioethanol: Product and Ulitization 1996 p 119 – 285 10 Kim, T.H., Kim, J.S., Sunwoo, C., Lee, Y.Y., Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia Bioresour Technol, 2003: p 39–47 11 Palonen, H., Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose VTT Publications 520, 2004 ISSN 1455-0849 12 Taherzsadeh MJ, Karimi K (2007), “Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review”, Bioresources, pp 707738 13 Walker, G.M., Bioethanol: Science and technology of fuel alcohol 2010 14 Zhu JY, P.X., Woody biomass pretreatment for cellulosic ethanol production: technology and energy consumption evaluation Bioresour Technology, 2010 101: p 4992–5002 TÀI LIỆU TỪ TRANG WEB 15 Chuyên đề: chuối, http://www.rauhoaquavietnam.vn/default.aspx?ID=46&LangID=1&tabID=5 &NewID=2202 16 Nguyễn Văn Chính, Nhiên liệu sinh học – nguồn lƣợng tái tạo tƣơng lai, http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/So-32015/1749/ 64 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Cách dựng đƣờng chuẩn cellulose - Dung dịch cellulose chuẩn (20 mg/ml): cân xác g cellulose hòa tan 50 ml nƣớc cất - Hút lần lƣợt 1, 2, 3, 4, 5, 6, ml dung dịch cellulose vào bình định mức 100 ml, them nƣớc cất đến vạch định mức Các dung dịch pha có nồng độ lần lƣợt 0,2; 0,3; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mg/ml - Cho ml thuốc thử Anthrone vào ống nghiệm chứa 0,5 ml dung dịch - Mẫu trắng: cho ml thuốc thử Anthrone vào ống nghiệm chứa ml nƣớc cất - Đun cách thủy phút Làm lạnh nhanh đo OD bƣớc song 610 nm - Từ giá trị OD đo đƣợc, vẽ đồ thị đƣờng chuẩn Cách pha Anthrone Cân 0,2g anthrone hòa tan 100 ml H2SO4 98% Dung dịch sau đƣợc pha chứa chai thủy tinh nâu để điều kiện lạnh – 6°C Hàm lƣợng cellulose (mg/mL) trƣớc sử dụng 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.3455x + 0.0069 R² = 0.992 1.843 1.597 1.376 1.157 0.857 0.552 0.201 0.2 0.4 0.6 0.8 OD 1 1.2 1.4 1.6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC B: Đồ thị tƣơng quan mật độ quang OD-mật độ tế bào Saccharomyces cerevisiae 8.5 8.4 8.3 y = 1.6486x + 7.5527 R² = 0.9824 log(cfu/ml) 8.2 8.1 7.9 7.8 7.7 7.6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD Pichia anomala 10 y = 4.234x + 7.272 R² = 0.9627 log(cfu/ml) 9.5 8.5 7.5 0.1 0.2 0.3 0.4 OD 0.5 ... tục thu nhận sản phẩm phƣơng pháp thủy phân lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala nhằm tìm khả tái sử dụng bã chất vỏ chuối để tiếp tục lên men bioethanol Mục đích... cao Để tiết kiệm đƣợc chi phí việc tái sử dụng lại nguồn bã nguyên liệu cần thiết Chính ý nghĩa thực tế trên, đề tài Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản. .. Việt Nam Vỏ chuối nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên sử dụng để lên men tạo bioethanol hiệu quả, tận dụng đƣợc nguồn vỏ phế phẩm Hiện nay, lƣợng vỏ chuối phế thải sau bóc vỏ từ nhà