Tối ưu sản lượng lipase pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận plackett burman và rsm ccd, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - BÙI HỒNG QUÂN Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TP HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đức Lượng Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng …năm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHỊNG ĐÀO TẠO SĐH ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp Hồ Chí Minh, ngày………tháng…….năm……… NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Bùi Hồng Quân Ngày, tháng, năm sinh: 14/09/1980 Phái: Nam Nơi sinh: Nam Định Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106680 I- TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thực theo mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman RSM-CCD để thu sản lượng lipase có hoạt tính cao ứng dụng sản xuất bột giặt Nội dung nghiên cứu bao gồm: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men P.anomala Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm phương pháp bề mặt đáp ứng để xác định giá trị tối ưu ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại Thu nhận sinh khối nấm men Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy kết tủa cồn lạnh Nghiên cứu vài đặc điểm lipase P.anomala Bổ sung lipase thu vào số bột giặt thị trường III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH Nội dung đề cương luận văn thạc sỹ Hội đồng chuyên ngành thông qua Tháng 01 năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH TRƯỞNG KHOA QL CHUYÊN NGÀNH Xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Nguyễn Đức Lượng người đưa phương hướng, mục tiêu hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em suốt trình học tập thực luận văn Xin gửi lời tri ân Cha mẹ gia đình ni dưỡng chỗ dựa cho suốt đời Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS Nguyễn Tiến Thắng, Cô TS Nguyễn Thúy Hương thầy cô khác truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm dành cho em giúp đỡ quý báu trình học tập nghiên cứu môn Công nghệ sinh học Xin gửi lời cảm ơn đến TS Quyền Đình Thi, TS Ching Tsing Hou có trao đổi, góp ý quý báu giúp tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn Cô môn Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện làm việc tốt cho tơi q trình thực luận văn Xin chân thành cảm ơn Ông Nguyễn Văn Thái, giám đốc Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II bạn đồng nghiệp trung tâm tạo điều kiện cho thực số thí nghiệm trung tâm Xin cảm ơn người bạn học tập, trao đổi, động viên có trợ giúp cần thiết, lúc cho Bùi Hồng Quân Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman RSM-CCD để thu sản lượng lipase có hoạt tính cao ứng dụng sản xuất bột giặt Thực phương pháp kiểm tra theo Kurtzman Fell (1999); Dũng Lương (2006), xác định đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men P.anomala Chủng nấm men có khả lên men đường sucrose, glucose, khơng có khả lên men lactose, đồng hoá nhiều nguồn cacbon (sucrose, maltose, tinh bột, glycerol, D-manitol, citrate, lipid) đồng hoá nitrate Nấm men phát triển tối ưu pH 9,0; nhiệt độ 25oC; giai đoạn phát triển cần nhu cầu ôxy cao Nấm men Pichia anomala tối ưu hoá trình ni cấy nhằm thu sản lượng lipase cực đại P.anomala có khả sinh tổng hợp lipase pH tối ưu 9,0 Chúng sử dụng thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman để kiểm tra mức độ ảnh hưởng yếu tố lý hoá khác lên sản lượng lipase Trong đó, chiết nấm men, tỷ lệ giống dầu ăn ba yếu tố có tác động mạnh Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)- phương án cấu trúc có tâm (CCD) thực tìm giá trị tối ưu ba yếu tố chiết nấm men (3,0%), tỷ lệ giống (2,37%; 108 tế bào/mL) dầu ăn (4,19%) cho sản lượng lipase cực đại theo mơ hình 18,8078 (U/mL) Mơ hình áp dụng vào thực tế với kết 100mL nuôi cấy lắc 18,95 (U/mL) 3,0L fermentor tự động 22,52(U/mL) Đã thu nhận 9,5g sinh khối nấm men ướt /100mL dịch nuôi cấy Sau lên men fermentor, thu nhận 4,32g tủa protein thô (chứa enzym) từ 2L dịch nuôi cấy kết tủa cồn lạnh Đồng thời, nghiên cứu vài đặc điểm lipase P.anomala: pH hoạt động thích hợp 9,0; nhiệt độ hoạt động thích hợ 25oC, ion kim loại khơng gia tăng hoạt tính mà làm giảm hoạt tính lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA muối mật làm giảm hoạt tính lipase Với lipase thô thu được, bổ sung vào bột giặt Omo, Surf (Sản phẩm Unilever Việt Nam), Only (Công ty CP Bột giặt Lix) Kết hoạt tính lipase giảm mạnh sau trộn Omo (35%), Surf (41%), Only (62%) Sau 24 hoạt tính bị hồn tồn Từ khố: Pichia anomala, Lipase, Plackett –Burman, RSM-CCD, fermentor The design experiments follow Plackett – Burman matrix and Central Composite Designs - Response surface methodology to optimal lipase yield by Pichia anomala and research properties of lipase Summary The aim of the present research is design experiments following PlackettBurman matrix and RSM-CCD to highest level lipase yield and apply to detergent power We tested yeast following Kurtzman and Fell (1999); Dung and Luong (2006) to determined property phisical and biochemical of the strain The strain could fermentation sucrose, glucose; couldn’t fermentation lactose; could assimilate many carbon sources (sucrose, maltose, starch soluble, glycerol, Dmanitol, citrate, lipid) and N source nitrate The yeast strain could growth at optimum pH pH 9.0; at 25oC The growth stage needed oxygen at high level Yeast Pichia anomala was optimized culture process for maximum lipase production The pH optimum for this secretion is 9.0; this lipase of great promise can act very well at alkaline pH (pH>9) and be applied in detergent industry We use the design of optimum multifactorial experiments Plackett – Burman to estimate level effect of physical and chemical factors on lipase yield As the result, Yeast (%), inoculum’s size (%) and vegetable oil (%) were identified as significant factors After screening, these factors were subsequently optimized using the response surface methodology (RSM) - Central Composite Designs (CCD) These optimal levels were found out yeast extract (3.0%), inoculum’s size (2.37%; 108 cells mL-1) and vegetable oil (4.19%) in which the lipase yield is highest The regression equations (model) obtained and predicted maximum lipase yield 18.8078 (U/mL) We also verify model in shake- flasks (100mL) as well as automatic fermentor (3.0L) Lipase production yields were recorded from supernatant is 18.95 (U/mL) and 22.52 (U/mL), respectively We also take in 9.5g yeast biomass from 100mL supernatant culture Two liter supernatant culture after fermentation was precipitated by cool ethanol and result 4.32g crude protein Simultaneous, we studied some properties of lipase P.anomala: optimum acitive pH 9.0; optimum active temperature 25oC, metals ionic not enhance activity that decrease activity of lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA and bile salt also decrease lipase activity Crude lipase was mix with soap powder as Omo, Surf (Products of Unilever Viet Nam), Only (Lix Joint stock Company) Result as lipase activity strongly drop as soon as mixture Omo (35%), Surf (41%), Only (62%) After 24h, activity lost all Key words: Pichia anomala, lipase, Plackett – Burman, Response surface methodology (RSM)- Central composite designs (CCD), fermentor Trang Mục lục Mục lục Danh mục hình Danh mục đồ thị .4 Danh mục bảng Chương Đặt vấn đề .6 Chương Tổng quan nghiên cứu liên quan .8 2.1 Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala .8 2.2 Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men 12 2.2.1 Nguồn gốc ứng dụng lipase nấm men 12 2.2.2 Tinh protein thuộc tính hố sinh .16 2.2.2.1 Lipase từ nấm men Pichia 16 2.2.2.2 Lipase từ nấm men khác 17 2.2.3 Tạo dòng gen .24 2.2.3.1 Nấm men Pichia .24 2.2.3.2 Các nấm men khác 24 2.3 Nghiên cứu lipase vi sinh vật khác 29 2.4 Ứng dụng lipase vi sinh vật .33 2.4.1 Ứng dụng lipase công nghiệp thực phẩm .34 2.4.2 Ứng dụng lipase công nghiệp tẩy rửa .35 2.4.3 Ứng dụng lipase công nghiệp thuộc da, dệt, giấy 35 2.4.4 Ứng dụng lipase quản lý môi trường 36 2.4.5 Ứng dụng lipase cơng nghiệp hóa chất 36 2.4.6 Ứng dụng lipase hóa sinh dược y tế 37 2.4.7 Ứng dụng lipase nông dược .38 2.4.8 Ứng dụng lipase mỹ phẩm công nghiệp nước hoa 39 2.4.9 Ứng dụng lipase sản xuất biodiesel 39 Chương 42 Vật liệu phương pháp .42 3.1 Chủng vi sinh vật 42 Trang 3.2 Thiết bị - Hoá chất môi trường 42 3.3 Phương pháp xác định lipase 42 3.3.1 Cơ sở lý thuyết 42 3.3.2 Định tính lipase P.anomala phương pháp đục lỗ 45 3.3.3 Định lượng hoạt tính lipase phương pháp chuẩn độ liên tục 46 3.4 Xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá chủng nấm men P.anomala 47 3.4.1 Cơ sở lý thuyết 47 3.4.2 Bố trí thí nghiệm 48 3.5 Sàng lọc yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman .51 3.5.1 Cơ sở lý thuyết 51 3.5.2 Bố trí thí nghiệm 55 3.6 Tối ưu giá trị ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng 57 3.6.1 Cơ sở lý thuyết 57 3.6.2 Bố trí thí nghiệm 59 3.7 Thử nghiệm mơ hình tối ưu điều kiện ni cấy lắc 100mL fermentor 3,0L 61 3.8 Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy kết tủa cồn lạnh 61 3.9 Nghiên cứu vài đặc điểm lipase P.anomala 61 3.9.1 pH hoạt động tối ưu 61 3.9.2 Nhiệt độ hoạt động tối ưu 62 3.9.3 Khả bền với nhiệt enzym 63 3.9.4 Ảnh hưởng ion kim loại chất kìm hãm 63 3.10 Bổ sung lipase vào bột giặt 64 3.10.1 Cơ sở lý thuyết 64 3.10.2 Bố trí thí nghiệm 67 Chương 70 Kết bàn luận 70 4.1 Kết xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá chúng nấm men P.anomala số yếu tố ảnh hưởng 70 4.1.1 Kết đặc điểm sinh lý, sinh hoá P.anomala .70 Trang 4.1.2 Kết ảnh hưởng giá trị pH khác lên khả phát triển P.anomala 73 4.1.3 Kết ảnh hưởng nhiệt độ lên khảnăng phát triển P.anomala 74 4.2 Kết sàng lọc yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman 76 4.3 Kết tối ưu giá trị ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương pháp bề mặt đáp ứng 78 4.4 Thử nghiệm mơ hình tối ưu điều kiện nuôi cấy lắc 100mL fermentor 3,0L 80 4.5 Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy kết tủa cồn lạnh 82 4.6 Nghiên cứu vài đặc điểm lipase P.anomala .83 4.6.1 Kết xác định giá trị pH thích hợp cho hoạt động enzym .83 4.6.2 Kết xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzym 84 4.6.3 Kết xác định độ bền enzym với nhiệt độ 86 4.6.4 Kết xác định ảnh hưởng số ion kim loại, EDTA, muối mật lên hoạt tính enzym .87 4.7 Kết bổ sung lipase vào bột giặt 88 Chương 90 Kết luận kiến nghị 90 5.1 Kết luận 90 5.2 Kiến nghị 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC pL PHỤ LỤC pL PHỤ LỤC pL PHỤ LỤC pL PHỤ LỤC pL Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Mơ hình hố thiết kế có tâm tổng qt cho hai yếu tố ba dạng CCD 58 Hình 4.1 Hình dạng tế bào, cách thức nảy chồi P.anomala 70 Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc P.anomala môi trường Sabouraund 2% glucose sau 48 nuôi cấy 71 Hình 4.3 Khả phân giải lipid môi trường chiết nấm men – nhũ tương dầu ăn 72 Hình 4.4 Khả phát triển P.anomala Sabouraund 2% glucose pH 8,9,10 74 Hình 4.5 Kết nhiệt độ hoạt động tối ưu enzym thạch đĩa 85 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đường cong tăng trưởng P.anomala Sabouraund 2% glucose 73 Đồ thị 4.2 Kết ảnh hưởng giá trị pH khác lên khả phát triển P.anomala 73 Đồ thị 4.3 Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống dầu ăn 80 Đồ thị 4.4 Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống chiết nấm men 80 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase 13 Bảng 2.2 Tính đặc hiệu chất lipase số dòng Pichia 16 Bảng 2.3 Lipase tự lipase cố định dùng sản xuất biodiesel 41 Bảng 3.1 Tóm tắt số phương pháp xác định hoạt tính lipase 43 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tween kết hợp với chất nhiễm sắc hệ thống chất khác xác định hoạt tính lipase 46 Bảng 3.3 Các tiêu kiểm tra sinh hoá P.anomala 49 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp 50 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị nhiệt độ phát triển thích hợp 50 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp 51 Bảng 3.7 Các mức 11 yếu tố thiết kế Plackett-Burman 55 Bảng 3.8 Mã hố thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 57 Bảng 3.9 Giá trị Các điểm α thiết kế CCD 59 Trang 111 • Yoshioka K and Hashimoto N.(1981) Ester formation by alcohol acetyltransferase from brewer’s yeast Agric Biol Chem 45:2183–2190 • Yu J., Zhang J., Zhao A., Ma X.F.(2008) Study of glucose ester synthesis by immobilized lipase from Candida sp Catalysis Communications 9:1369–1374 • Zagorc T., Maraz A., Cadez N., Jemec K.P., Peter G., Resnik M., Nemanic J and Raspor P.(2001) Indigenous wine killer yeasts and their application as a starter culture in wine fermentation Fd Microbiol 18:441–451 • Zhang W., Jia C.S., Wang Y.J., Kim J.M., Jiang P.P, Zhang M.M.(2009) Identification and Maillard reaction activities of dilauryl mannose isomers formed during lipase-catalyzed condensation Fd Chem 112:421–427 • Zhao W., Wang J., Deng R and Wang Y.(2008) Scale up fermentation of recombinant Candida rugosa lipase expressed in Pichia pastoris using GAP promoter J Ind Microbiol Technol 35:189-195 • Zuyi L and Ward O.P.(1993) Stability of microbial lipase in alcoholysis of fish oil during repeated enzyme use Biotechnol Lett 15:393–398 • Xia Li, Xu T., Ma X., Guo K., Kai L., Zhao Y., Jia X., Ma Y (2008) Optimization of culture conditions for production of cis-epoxysuccinic acid hydrolase using response surface methodology Biores Technol 99:5391–5396 • Xin J.Y., Zhang L., Chen L.L., Zheng Y., Wu X.M., Xia C.G.(2009) Lipase-catalyzed synthesis of ferulyl oleins in solvent-free medium Fd Chem 112:640–645 • Xiong C., Jinhua W., Dongsheng L (2007) Optimization of solid-state medium for the production of inulinase by Kluyveromyces S120 using response surface methodology Biochemical Eng J 34:179–184 • Xu F., Tao W., Cheng L., Guo L (2006) Strain improvement and optimization of the media of taxol-producing fungus Fusarium maire Biochemical Eng J 31:67–73 Sách tham khảo tiếng việt • Báo cáo khoa học(1999) Kỷ yếu hội nghị khoa học công nghệ sinh học tồn quốc, NXB KHKT, Hà Nội • Nguyễn Hữu Chấn(1983) Enzzym xúc tác sinh học, NXB Y học, Hà Nội • Đặng Thị Thu cs.(2004) Cơng nghệ Enzym, NXB KHKT, Hà Nội • Lê Ngọc Tú cs.(1982) Enzym vi sinh vật tập 1,2, NXB KHKT, Hà Nội • Lê Ngọc Tú cs.(2002) Hố sinh công nghiệp, NXB KHKT, Hà Nội Trang pL1 Phụ lục Theo C.R Kurtzman 42 Pichia E.C Hansen emend Kurtzman Part Vb Descriptions of teleomorphic ascomycetous genera and species p.287-289 In Cletus P Kurtzman and Jack W Fell (1999) The Yeasts, A Taxonomic Study Fourth ed., ELSEVIER SCIENCE B.V., Amsterdam, The Netherlands, 1075pages Đặc điểm phân loại Pichia anomala Pichia anomala (E.C Hansen) Kurtzman (1984) Anamorph: Candida pelliculosa Redaelli Tên đồng nghĩa: • Saccharomyces anomalus E.C Hansen (1891) • Willia anomala E.C Hansen (1904) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow (1919) • Endomyces anomalus (E.C Hansen) Zender (1925) • Saccharomyces sphaericus von Năgeli (1879) • Hansenula sphaerica (von Năgeli) H & P Sydow (1919) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var sphaerica (von Nageli) Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Saccharomyces acetaethylicus Beijerinck (1892) • Monilia javanica Went & Prinsen Geerligs (1894) • Willia javanica Groenewege (1921) • Hansenula javanica (Groenewege) Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Endoblastoderma puluerulentum Fischer & Brebeck (1894) • Mycoderma cereuisiae Desmazieres var puluerulentum Beijerinck (được trích dẫn Barnett cs 1990) • Mycoderma pulverulenta (Beijerinck) Nannizzi (1934) • Willia Odessa Weber (1922) • Endomyces odessa (Weber) Zender (1925) • Hansenula odessa (Weber) Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Willia schneggii Weber (1922) • Endomyces schneggii (Weber) Zender (1925) • Hansenula schneggii (Weber) Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var schneggii (Weber) Wickerham (1970) • Willia productiua Berkhout (1923) • Hansenula productiva Beijerinck ex Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var productiva Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Monilia productiva nom nud (cited by Wickerham 1970) • Endomyces margaritae Zender (1925) • Willia margaritae (Zender) Guilliermond (1928) • Candida pelliculosa Redaelli (1925) • Mycocandida pelliculosa (Redaelli) Guerra (1935) • Candida javanica (Went & Prinsen Geerligs) Berkhout (1923) Trang pL2 • Willia bispora Mattlet (1926) • Hansenula bispora (Mattlet) Nannizzi (1934) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var longa Dekker (StellingDekker 1931) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var robusta Dekker (Stelling-Dekker 1931) • Hansenula nivea CastelH (1933) • Hansenula panis CastelH (1933) • Saccharomyces aceris-sacchari Fabian & Hall (1933) • Hansenula anomala (E.C Hansen) H & P Sydow var heteromorpha Bedford (1942) nom nud • Hansenula miso (và dạng a, (3, (3 var 1) Mogi (1942) nom nud.(khơng rõ bút danh) • Hansenula octospora Mogi (1942) nom, nud (khơng rõ bút danh) • Hansenula miso var octosporus S Goto & Yokotsuka (1962) nom nud (không rõ bút danh) • Candida pelliculosa Redaelli var cylindrica Diddens & Lodder (1942) • Candida beverwijkii Novak & Vitez (1964) • Hansenula ukrainica Kvasnikov, Nagomaya & Shchelokova (1979) Phát triển môi trường thạch malt 5%: Sau ngày 25oC, tế bào có dạng hình elip kéo dài, (1,9-4,1)x(2,1-6,1) [đứng riêng lẻ, cặp tụ thành đám Khi phát triển có mùi bơ có màu nâu nhạt Phát triển bề mặt môi trường lỏng: Một vài dịng sản sinh lớp hình thành bề mặt môi trường từ trơn mỏng đến dày nhăn nheo Hình thái học chủng ni cấy bề mặt thạch agar: Sau ngày 25°C, phát triển bề mặt lamel dày, kéo dài phân nhánh thành khuẩn ty giả, vài dịng khơng hình thành khuẩn ty giả Khơng có lồi hình thành khuẩn ty thật Khi phát triển điền kiện hiếu khí có màu từ trắng đến trắng nâu nhìn chung có màu bơ Một vài dịng trơn láng bóng số khác đục trắng phấn Rìa khuẩn lạc tạo nên thùy đơi thể mép khuẩn ty giả Các chủng thường sản sinh mùi thơm dễ chịu Sự hình thành nang bào tử: R anomala heterothallic, dạng bào tử lưỡng bội thường phân lập từ tự nhiên Các tế bào lưỡng bội trực tiếp biến thành nang hình thành đến bốn nang bào tử dạng mũ Các nang bào tử quan sát môi trường thạch malt, thạch V8 nước chiết carrot khử trùng từ 310 ngày 25°C Co- Q: 7, CBS 5759, dòng khác (Yamada cs., 1973) Mol % G+C: 35,9-36,6, CBS 5759, AJ 4167 (Tm: Nakase Komagata 1971); 36,8 dòng CBS 605 (Tm: Stenderup Bak 1968); 35,8-37,4 dòng CBS 5759 dòng khác (BD: Kurtzman 1984) Các chủng gốc nghiên cứu: Các chủng nhiễm tạp từ công nghiệp lên men thực vật quy mô pilot (12); ragi, Java (10); đất (9); nhựa gum phần lớn Prunus (9); kho bảo quản ngũ cốc (6); bể ủ giốngc ăn gia súc (4); hồ suối (3); động vật máu nóng (3); nhựa (2); phân mọt (2); nấm lên men (2); chất thải (2); trái (1); từ cá thu thập nghiên cứu khác (58) Các dạng lai bổ trợ: NRRL Y-366-8 (CBS 1984) NRRL Y-2153-4 (CBS 1982) Trang pL3 Loại dòng: CBS 5759 (NRRL Y-366), nhận từ Fabian, U.S.A., gọi Willia anomala Saito Ghi chú: Wickerham (1970) tách Hansenula anomala var schneggii khỏi H anomala var anomala có khả lên men succrose H anomala var anomala, không phát triển môi trường thẩm thấu Thêm nữa, giống schneggii khơng đồng hố raffinose Có lẽ bật giống schneggii sản sinh tế bào hình trụ kéo dài rõ rệt giống anomala khơng Tuy nhiên, đặc tính giới tính khơng rõ ràng giống khác Giao phối dòng giống schneggii yếu, hỗi hợp có chứa dịng giống mạnh Kurtzman (1984) so sánh H anomala var anomala and H anomala var schneggii từ việc kéo dài nDNA bắt cặp Hai giống thể có trình tự bổ sung base lên đến 94% Do đó, việc xem xét tương đồng dòng mức phân tử, thứ bậc giống khơng trì Trong so sánh nDNA khác, Hansenula ukrainica P anomala (Kurtzman 1992) Lên men Glucose + Lactose Galactose V Raffinose w/Succrose + Trehalose Maltose V Đồng hoá Glucose + N-acetyl Dglucosamine Galactose V Methanol L-sorbose Ethanol + Succrose + Glycerol + Maltose + Erythritol + Cellobiose + Ribitol V Trehalose + Galactitol Lactose D- Mannitol + Melibiose D-Glucitol + Raffinose + Α methyl d glucoside + Melezitose + Salicin + Inulin D gluconate V Tinh bột tan + DL lactate + D- xylose V Succinate + L-arabinose V Citrate + D-arabinose Inositol D-Ribose V Hexadecane L-Rhamnose Nitrate + D-glucosamine Khơng có vitamin + Một số khả đồng hoá khác đặc điểm khác 2- keto- D- gluconate Tổng hợp tinh bột 5- keto - D- gluconate Tan chảy Gelatin o Saccharate Phát triển 37 C V 10% NaCl/ 5% glucose V Trang pL4 Phụ lục Fungi ,Yeasts and Yeast Genetic Stock ATCC® Number: Organism: 16763™ Order this Item Price: $225.00 Pichia anomala (Hansen) Kurtzman, teleomorph deposited as Hansenula schneggii (Weber) Dekker, teleomorph Alternate State: Candida pelliculosa Redaelli, anamorph Designations: NRRL Y-993 [CBS 113, IFO 0806, JCM 3589] Depositors: NRRL Biosafety Level: Growth Conditions: Permits/Forms: Type Strain: yes(type strain of Willia schneggii) Shipped: freeze-dried ATCC medium 200: YM agar or YM broth Temperature: 24.0°C In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location Related Products Applications: produces lipases active at pH 5.5 and 7.5 [58554] Subcollection: Yeasts References: 20328: Weber U Beitrag zur Kenntnis der esterbildenden Hefen Biochem Z 129: 208-216, 1922 58554: Hou CT pH dependence and thermostability of lipases from cultures from the ARS Culture Collection J Ind Microbiol 13: 242-248, 1994 Trang pL5 Phụ lục Các lipase sản xuất nhiều nấm men khác Hou (1994) nghiên cứu 143 loài nấm men có khả sinh enzym lipase (trong tổng số 479 nấm men kiểm tra) mức độ chịu pH mức độ chiọu nhiệt Trong nghiên cứu này, Hou xác định Bốn chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động pH 7,5 mà không hoạt động pH 5,5: P.alni Y-11625, P.membranaefaciens Y-1513, P.meyerae Y-12777, S.crataegensis YB-192 Hai mươi ba (23) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động pH 5,5 mà không hoạt động pH 7,5: C.ancudensis Y-17327; C.antarctica Y-7954; C.atmospherica Y-5979; C.bombi Y-17081; C.buffonii Y-17082; C.cacaoi Y-7302; C.chilensis Y-17141; C.geochares Y-17073; C.lipolytica Y-2178; C.magnoliae Y2024, Y-2333, YB-4226, Y-7621, Y-7622; C.maritima Y-7899; C.salmanticensis Y17090; C.savonica Y-17077; P.glucozyma YB-2185; P.musicola Y:7006; P.petersonii YB-3808; P.silvicolaY-1678; P.sydowiorum Y-7130; S.fibuligera Y-12677 Chín mươi (90) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động pH 5,5 7,5: C.apicola Y-2481, Y-5391; C.azyma Y-17067; C.boleticola Y-17080; C.bombicola Y-17069; C.dendrica Y-7775; C.entomaea Y-7785; C.entomophila Y-7783; C.ernobii Y-12941; C.freyschussi Y-7898; C.fusiformata Y-17173; C.heUenica Y-17319, Y-6591; C.humicola Y-1266, Y-12944; C.homilentorna Y-10941; C.insectamans Y-7786; C.kruisii Y-17086; C.lipolytica Y-6795; C.lusitaniae Y-7940; C.magnoliae Y-680; C.maltosa Y-5704; C.melinii Y-1514, Y-1782, Y-2326; C.methylica Y-17325; C.mucilagina Y-11823; C.naeodendra Y-10942; C.nodaensis Y-2484; C.norvegica Y6700; C.oregonensis Y-5850; C.parapsilosis Y-7629, Y-7659; C.philyla Y-7776; C.quereitrusa Y-5392; C.quercuum Y-12942; C.santamariae Y-6656; C.silvanorum Y7782; C.silvicola Y-6052, YB-2846; C.silvicultrix Y-7789; Candida spp Y-490, YB2064, YB-599; C.tanzawaensis Y-17324; G.candidum Y-552; P.abadieae Y-7499; P.americana Y-2156, YB-2444; P.anomala Y-366, Y-993; P.bimundalis Y-5343, YB2805; P.bispora Y-1482, Y-11610; P.eanadensis Y-1888, Y-2340; P.dryadoides Y10990; P.euphorbiophila Y-12742, Y-12743; P.fabianii Y-1871, Y-1873; P.hampshirensis YB-4128; P.holstii Y-2155, Y-7914; P.insitovora Y-12698; P.lynferdii Y-7723; P.mexicana Y-11818, Y-11819; P.minuta Y-10948; P.mississippiensis Y-11748, YB-1294; P.muscicola Y-7005; P.nakazawae Y-7904; P.rabaulensis Y-11533; P.silvicola YB-3086; P.toletana YB-4247; P.veronae Y-7818; P.xylosa Y-12929, Y-12939, Y-5987,YB-3884, YB-3887; S.crataegensis Y-5902; S.lipolytica YB-423; Trichosporon spp Y-1489, YB-4547; Wickerhamiella domercqiae Y-6698; Y.lipolytica Y-1095; Z.fermentati Y-17056 Hai mươi sáu (26) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động pH 9,0 60oC: C.fennica Y-7505; C.rugopelliculosa Y-17079; C.sake YB-1132; C.silvicola YB-2846, Y-6052; C.sorbophila Y-7921; C.utilis Y-7586; Issatchenkia orientalis Y-7550; P.abadieae Y7499; P.alni Y-11627; P.fabianii Y-1873, Y-1871; P.guilliermondii Y-2075; P.hampshirensis YB-4128; P.inositovora Y-12698; P.mississippiensis YB-1294; P.nakazawae Y-7904; P.rabaulensis Y-11533; P.silvicola YB-3086; P.xylosa Y12939; S.lipolytica YB-423; Torulaspora globosa Y-1982; Williopsis pratensis Y12696; Z.bailii Y-7260, Y-7258; Z.rouxii Y-998 Năm 1997, Hou xác định số đặc điểm số nấm men Trang pL6 Phụ lục Pichia anomala Trang pL7 Phụ lục Một số hình ảnh trình thực luận văn Hình vi thể nấm men môi trường dầu ăn nguồn cacbon Hình vi thể nấm men môi trường Sabouraund 2% glucose Ống giữ giống P.anomala cấy ngày 13/11/2008 Trang pL8 Hình phân giải lipid lipase P.anomala đĩa thạch YE-dầu ăn 3% Hình phân giải lipid lipase P.anomala đĩa thạch YE-dầu ăn 3% Hình fermentor trình lên men hình điều khiển Trang pL9 Hình fermentor trình lên men Hình tủa enzym thơ Hình máy chuẩn độ điện 702 SM Tritrino VariopH Hình nấm men P.anomala nuôi dầu DO dầu ăn Trang pL10 Máy chuẩn độ điện 702 SM Tritrino Hình nấm men P.anomala nuôi dầu DO Gum arabic Chuẩn bị đổ mơi trường Trang pL11 Hình định tính/bán định lượng lipase phương pháp đục lỗ Hình đồng hố dầu ăn máy Sonicator 3000 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Bùi Hồng Quân THÔNG TIN LIÊN LẠC ĐT (nhà) : +848.38639403 Địa chỉ: 284/73/22 Lý Thường Kiệt, F14, ĐTDD : +84122.2041490 Q10, Tp HCM E-Mail : buihongquan2000@yahoo.com THÔNG TIN CÁ NHÂN Quốc tịch Việt Nam Ngày sinh 14/09/1980 Nơi sinh Phái Nam Định Nam QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Từ 09/2006 đến Học thạc sỹ Cơng nghệ sinh học khố 2006 Đại học Bách khoa Tp.HCM nay: Tháng 07/2007 Viện vệ sinh y tế công cộng – Tp HCM Chứng nhận Sử dụng phần mềm SPSS dự án Xây dựng kiểm sốt chất lượng nơng sản thực phẩm (TOR-CIDA) Viện vệ sinh y tế công cộng tổ chức Tháng 04/2007- Viện nghiên cứu công nghiệp thực phẩm lên men quốc gia Trung Quốc 06/2007 (CNRIFFI) – Bắc Kinh Chứng nhận Huấn luyện kỹ thuật kiểm sốt an tồn thực phẩm Tháng 06/2006 Trung tâm tiêu chuẩn đo lượng chất lượng (QUATEST 3) Chứng nhận Xây dựng áp dụng hệ thống quản lý phòng thí nghiệm theo ISO/IEC 17025:2005 Tháng 09/2005 Đại học Sư phạm Tp HCM Chứng chỉ, Phương pháp giảng dạy bậc đại học triết học sau đại học Tháng 12/2005 Cơng ty Nam Khoa- Tp Hồ Chí Minh Huấn luyện thực hành PCR Tháng 04/2004- Công ty Nam Khoa – Tp.HCM Thực tập tốt nghiệp Khảo sát tỷ lệ đề kháng thuốc Hemophilus influenzae” Hướng dẫn KH: TS.BS Phạm Hùng Vân 08/2004 Từ 09/2000 – Đại học Mở Bán Công Tp.HCM Bằng tốt nghiệp đại học cử nhân khoa học 08/2004 Cơng nghệ sinh học Q TRÌNH CƠNG TÁC Từ 04/2008 Thực luận văn thạc sỹ Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh đến Đề tài: “Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett –Burman RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được” Hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Từ 03/2005 Làm việc Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II: 521/1 Hoàng Văn Thụ, Quận Tân Bình, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 03/2008: Cơng tác chun mơn: Làm việc phịng vi sinh trung tâm Tham gia xây dựng quy chuẩn/quy trình Cục thú y – Bộ Nơng nghiệp Phát triển nông thôn: “Quy chuẩn quản lý chất thải sở chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật”; “Quy trình kiểm tra giám sát an tồn vệ sinh thực phẩm trứng vịt muối tiêu thụ nước xuất khẩu” (Đang thực hiện) Tham gia thực đề tài nghiên cứu Cục thú y: xây dựng mơ hình xử lý nước thải, chất thải sở giết mổ chăn nuôi, Xây dựng quy trình hướng dẫn cơng việc dựa quy trình ISO, AOAC FDA cho phép thử thực phòng vi sinh để áp dụng xây dựng theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 Xây dựng soạn thạo quy trình kiểm tra probiotic dùng chăn ni, thuỷ sản, trồng trọt xử lý môi trường Trưởng ban soạn thảo quy chuẩn vệ sinh thú y đối vơi sở buôn bán trứng gia cầm tươi sống Viết kế hoạch thu thập mẫu mật ong để kiểm tra kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật trước xuất sang châu Âu Viết báo cáo Bảo vệ môi trường cho phát triển chăn nuôi bền vững Viết báo cáo dự án xây dựng kiểm sốt chất lượng nơng sản thực phẩm (TOR) CIDA tài trợ: tổng quan, thu thập phân tích mẫu nghiên cứu, xử lý, phân tích số liệu đề xuất giải pháp phù hợp 10 Thực seminar: Sản xuất thuốc trừ sâu BT; Sản xuất cồn nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp; Lipase vi khuẩn; Sản xuất sinh khối Saccharomyces cerevisiae; Sản xuất insulin tái tổ hợp; Kỹ thuật sản xuất protein tái tổi hợp; Di truyền vi sinh vật 11 Giảng dạy thực hành vi sinh vật Đại học Mở Bán Công Tp Hồ Chí Minh Cơng tác đồn thể 12 Chủ tịch cơng đồn Cơ sở trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II 13 Tham gia công tác xã hội Đắc Nông, Gia Lai vào mùa hè 2005, 2006, 2007 công tác hiến máu nhân đạo Từ tháng Học đại học Đại học Mở bán Cơng Tp Hồ Chí Minh - 97 Võ Văn Tần, 09/2000 – Quận 3, Tp Hồ Chí Minh 03/2005: Tham gia thi ý tưởng mơ hình khoa học The SIM Đoàn trường tổ chức với đề tài (Ba đề tài đoạt giải: 01 giải nhì, 02 giải khuyến khích): Xây dựng quy trình sản xuất mạch máu nhân tạo từ BC; Biến đổi sinh học cellulose; Giải pháp nâng cao hiệu học tập cho sinh viên ngành công nghệ sinh học; Sản xuất chitosan phương pháp sử dụng enzym từ vi sinh vật Sáng lập câu lạc học thuật nghiên cứu khoa học (sau đổi tên thành Câu lạc chuỗi xoắn kép)– khoa Công nghệ sinh học Thực seminar sản xuất BC Tham gia thi thi học thuật: + Vườn ươm Menden lần (2002) lần (2003) trường Đại học khoa học tự nhiên Tp HCM + Cuộc thi Nhà Công nghệ sinh học trẻ tuổi lần năm 2004 ĐH Mở Bán Công Tp.HCM Nghiên cứu thiết kế mơ hình sản xuất chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi, thuỷ sản, nông nghiệp xử lý môi trường hường dẫn giảng viên khoa Thực tập tốt nghiệp Công ty Nam Khoa về: “Khảo sát tỷ lệ đề kháng thuốc Hemophilus influenzae” Hướng dẫn khoa học: TS.BS Phạm Hùng Vân MỘT SỐ THÀNH TÍCH ĐẠT ĐƯỢC TRONG Q TRÌNH HỌC TẬP VÀ CÔNG TÁC Từ 03/2005 Chiến sỹ thi đua Cục thú y 2007 đến Giấy khen thành tích xây dựng tổ chức cơng đồn sở Cơng đồn Khối Bộ NN&PTNT năm 2007 Giấy chứng nhận danh hiệu Thanh niên tiên tiến Đoàn khối Bộ NN&PTNT năm 2006 Và số giải thưởng khác q trình cơng tác Từ 09/2000 Bằng khen trưởng Bộ Giáo Dục Đào Tạo, "Giải thưởng sinh viên đến nghiên cứu khoa học" năm 2004 Giấy khen Hiệu trưởng Đại học Mở Bán Cơng Tp Hồ Chí Minh 03/2005 thành tích học tập năm 2000, 2004 tồn khố học Giấy khen Đồn trường Đại học Mở Bán Cơng Tp Hồ Chí Minh, đạt 03 giải thưởng sinh viên nghiên cứu khoa học cấp trường (01 giải nhì, 02 giải khuyến khích) thi "Ý tưởng mơ hình khoa học – The SIM" THƠNG TIN THAM KHẢO Người tham khảo Phan Hữu Nghĩa Quan hệ Đại học Mở Tp HCM Huỳnh Tấn Phúc (P.GĐ) TT KT VS TY TW II Điện thoại E-Mail 0908862088 nghiadungdung@viettel.com (Texas,USA) 0918630017 htphuc@hcm.vnn.vn Tôi cam đoan thông tin thật hồn tồn xác ========= ... TÀI: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett ? ?Burman RSM- CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thực theo mục tiêu nghiên cứu: Thiết. .. Plackett ? ?Burman RSM- CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett- Burman RSM- CCD để thu sản lượng lipase có hoạt tính cao ứng dụng sản. .. hoạt tính lipase, chúng tơi dùng chủng nấm men để thực đề tài: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett ? ?Burman RSM- CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu Mục