Xác định salbutamol, clenbuterol và ractopamine trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm từ thịt

và Phát triển nông thôn để thanh, kiểm tra nhằm phát hiện các cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi, các cơ sở chăn nuôi sử dụng chất cấm; phối hợp với Bộ Y tế, Bộ Tài chính, Tổng cục hải qua

ĐẠIHỌCQUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN

-

VũQuốc Hưng

XÁCĐỊNHSALBUTAMOL, CLENBUTEROL VÀ RACTOPAMINE

TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI, NƯỚC TIỂU LỢN

VÀ SẢN PHẨM THỊT

LUẬNVĂNTHẠCSĨKHOAHỌC

ĐẠIHỌCQUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN

-

VũQuốc Hưng

XÁCĐỊNHSALBUTAMOL, CLENBUTEROL VÀ RACTOPAMINE

TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI, NƯỚC TIỂU LỢN

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và động viên tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại đây

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, lãnh đạo cùng các cán bộ của Phòng giám định Hóa pháp lý - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công

an, các học viên và sinh viên trong bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã ủng hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong cả quá trình học tập và hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Vũ Quốc Hưng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

i MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1.Giới thiệu về hoocmon tăng trưởng β2-agonist 4

1.1.1 β2-agonist là gì? 4

1.1.2 Tác dụng của β2-agonist 4

1.1.3 Phân loại β2-agonist 4

1.2 Giới thiệu về Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 5

1.2.1 Thông tin chung 5

1.2.1.1 Salbutamol 5

1.2.1.2.Clenbuterol 5

1.2.1.3 Ractopamine 6

1.2.2 Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 6 1.2.2.1 Tác dụng làm giãn phế quản. 6

1.2.2.2 Tác dụng làm tăng tỷ lệ nạc/mỡ. 8

1.2.3.Tác hại của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine đối với sức khỏe con người 8

1.2.4 Tình hình sử dụng Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 9

1.2.5 Các phương pháp xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 12 1.2.5.1 Trong nước 12

1.2.5.2 Thế giới 13

1.3 Phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) 18

1.3.1 Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) 18

1.3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 18

1.3.1.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao 19

1.3.1.3 Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) 20

1.3.1.4 Bộ phân tích khối 22

1.3.2.Quy trình định tính và định lượng β2-agonists (Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine) 24

1.3.2.1 Chiết chất phân tích ra khỏi mẫu 24

1.3.2.2 Làm sạch dịch chiết và làm giàu chất phân tích. 24

1.3.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction: SPE) 25

1.3.3.1 Hoạt hóa cột 25

1.3.3.2 Nạp mẫu vào cột 26

1.3.3.3 Rửa cột 26

1.3.3.4 Rửa giải 26

1.3.3.5 Làm giàu chất phân tích 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 27

2.2 Hóa chất và dụng cụ dung trong nghiên cứu 27

2.2.1 Hóa chất và dung dịch thử 27

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 28

2.2.3 Chất chuẩn và nội chuẩn 29

2.3 Xây dựng phương pháp xác định Clenbuterol, Salbutamol và

Ractopamine bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ, tối ưu hóa các thông số kỹ

thuật của hệ thống LC-MS/MS. 30

2.3.1.Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng chế độ Full scan) 30

2.3.2 Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring) 31

2.3.3 Khảo sát nhiệt độ ống mao quản 31

2.3.4 Khảo sát chương trình dung môi 32

2.3.5 Khảo sát khoảng tuyến tính của clen, sal, rac trong xây dựng đường chuẩn 32

2.1.Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 32

2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại Sal, Clen, Rac và nội chuẩn đồng vị trên cột SCX 32

2.4.2 Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn Sal, Clen và Rac 33

2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích 34

2.4.4 Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu 35

2.4.5 Xác định hiệu suất thu hồi 35

2.5 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (LOD, LOQ) 36

2.6 Phương pháp lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn và mẫu TACN 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine bằng LC-MS/MS 38

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS) 38

3.1.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện của nguồn và khí (Source and gas Optimization) 39

3.1.2 Lựa chọn cột tách 40

3.1.3 Khảo sát chương trình gradient 41

3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động 44

3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic trong pha động 46

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu phân tích các β2-agonist 47

3.2.1 Quy trình xử lý nên mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi 47

3.2.1.1 Chọn cột chiết SPE 47

3.2.1.2 Khảo sát pH chiết 48

3.2.1.3 Khảo sát điều kiện rửa giải 49

3.2.2 Quy trình xử lý mẫu trên nền mẫu nước tiểu 53

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 55

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 55

3.3.1.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 55

3.3.1.2 Đường chuẩn các β2-agonist có nội chuẩn (sử dụng để phân tích mẫu thực) 56

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 58

3.3.3 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 61

3.3.3.1 Tiến hành thực nghiệm trên mẫu thịt 61

3.3.3.2 Tiến hành thực nghiệm trên mẫu TACN 63

3.3.3.3 Tiến hành thực nghiệm trên mẫu nước tiểu 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 72

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73

TÀILIỆUTHAMKHẢO 74

PHỤ LỤC 80

Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động 80

Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu 83

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Quy định mẫu được coi dương tính với nhóm β2–agonist 10

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 39

Bảng 3.2: Các thông số tối ưu cho nguồn và khí 40

Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ acid formic tới diện tích peak β2-agonist 46

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết 48

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của tỉ lệ MeOH: NH4OH 25% tới quá trình chiết 50

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thể tích rửa giải 51

Bảng 3.7: Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đường chuẩn có chứa IS 56

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các β2-agonist trong nền mẫu thịt 59

Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các β2-agonist trong nền mẫu TACN 59

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các β2-agonist trong nền mẫu nước tiểu lợn 60

Bảng 3.11: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền mẫu thịt 61

Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền mẫu thịt 62

Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamine trên nền mẫu thịt 63

Bảng 3.14: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền TACN 64

Bảng 3.15: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền TACN 64

Bảng 3.16: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamin trên nền TACN 65

Bảng 3.17: Độ lặp lại và độ thu hồi của Salbutamol trên nền nước tiểu lợn 66

Bảng 3.18: Độ lặp lại và độ thu hồi của Clenbuterol trên nền nước tiểu lợn 66 Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi của Ractopamin trên nền nước tiểu lợn 67 Bảng 3.20: Kết quả mẫu sản phẩm thịt 68

Bảng 3.21: Kết quả thực tế mẫu nước tiểu lợn 69

Bảng 3.22: Kết quả mẫu thức ăn chăn nuôi 70

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 20

Hình 1.2: Bộ phân tích khối một tứ cực 22

Hình 1.3: Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực 23

Hình 1.4: Nguyên tắc hoạt động của cột SPE (SCX) 26

Hình 3.1: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chương trình gradient 1 41

Hình 3.2: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chương trình gradient 2 42

Hình 3.3: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chương trình gradient 3 42

Hình 3.4: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chương trình gradient 4 43

Hình 3.5: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chương trình gradient 5 43

Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 44

Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 45

Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,4 ml/phút 45

Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 45

Hình 3.10: Sắc đồ các β2-agonist tại nồng độ acid formic 0,1% 47

Hình 3.11: Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Sal 55

trong khoảng 0,05-500 ng/ml 55

Hình 3.12: Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Clen 55

trong khoảng 0,05- 500ng/ml 55

Hình 3.13: Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Rac 56

trong khoảng 0,05- 500ng/ml 56

Hình 3.14: Đường chuẩn Sal (R2 = 0,9997) 57

Hình 3.15: Đường chuẩn Clen (R2 = 1,0000) 58

Hình 3.16: Đường chuẩn Rac (R2 = 1,0000) 58

Hình 3.17: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu thịt 59

Hình 3.18: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu TACN 60 Hình 3.19: Sắc đồ LOD của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu nước tiểu lợn 60

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết

ACN Acetonitrile

CE Collision energy Năng lượng va chạm

EI Electron Ionization Ion hóa bằng dòng electron

ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử

EU European Union Châu Âu

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học cơ bản

và ứng dụng

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng

MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa

PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc 2

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

U.S NRP United States National Residue

Ultral performance liquid

chromatography tandem mass

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm càng ngày càng được chú trọng nhiều hơn so với trước kia An toàn thực phẩm ngày nay không chỉ đơn thuần là các vấn đề về thực phẩm nhiễm bẩn, ôi thiu, thiếu vệ sinh

mà còn ở chỗ thực phẩm có chứa những độc chất gây hại cho con người Chất cấm trong chăn nuôi không phải là vấn đề mới, từ năm 2006, cơ quan chức năng đã phát hiện tồn dư chất cấm trong thịt gia súc, gia cầm và trong chăn nuôi, nhất là trong thịt lợn Tuy nhiên, việc sử dụng chất cấm trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi và chăn nuôi thời gian qua có diễn biến phức tạp cả về tính chất, mức độ và trên quy mô diện rộng Các loại chất cấm thường được sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi, trong chăn nuôi chủ yếu là các chất thuộc nhóm beta – agonist (Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamin) Các chất này khi cho ăn sẽ làm cho lợn tăng trọng nhanh, nở mông, nở đùi, tăng tỉ lệ thịt nạc, tăng lợi nhuận cho người chăn nuôi và chất tạo màu (VAT Yellow), tạo màu sắc đẹp cho thực phẩm nên được các đối tượng thường xuyên sử dụng Thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng đang là vấn đề được người tiêu dùng quan tâm bởi qua điều tra, khảo sát của các cơ quan chức năng, hầu hết các trại nuôi gà có sử dụng kháng sinh đều cao hơn quy chuẩn; ngoài ra, một số loại kháng sinh ngoài quy chuẩn cũng được sử dụng và có hàm lượng cao hơn quy định Riêng trong 10 tháng đầu năm 2015, tại các khu vực tỉnh, thành phố phía Nam, cơ quan chức năng đã lấy mẫu kiểm tra và phát hiện nhiều mẫu nước tiểu lợn dương tính với Salbutamol, tập trung ở các tỉnh, thành phố như: Đồng Nai phát hiện 109/654 mẫu (chiếm 16,7%); TP Hồ Chí Minh phát hiện 95/516 mẫu (chiếm 18,4%); Tiền Giang phát hiện 35/525 mẫu (chiếm 6,7%)… Nồng độ chất Salbutamol trong các mẫu nước tiểu vật nuôi rất cao, đa số trên 200ppb, có mẫu lên tới 665ppb

Trước tình hình trên, với vai trò nòng cốt của ngành Công an trong phòng chống tội phạm, vi phạm pháp luật về môi trường, lực lượng Cảnh sát PCTP vể môi trường đã tập trung tham mưu chỉ đạo và triển khai đồng bộ các biện pháp công tác phòng chống; trong đó đã tích cực phối hợp với các ban, ngành của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn để thanh, kiểm tra nhằm phát hiện các cơ sở sản xuất thức

ăn chăn nuôi, các cơ sở chăn nuôi sử dụng chất cấm; phối hợp với Bộ Y tế, Bộ Tài chính, Tổng cục hải quan đẩy mạnh công tác kiểm tra, kiểm soát các hóa chất nhập khẩu được sử dụng trong ngành y tế nhưng là chất cấm trong chăn nuôi Trong tháng 11/2015, lực lượng Cảnh sát PCTP về môi trường Công an các đơn vị, địa phương đã tiến hành kiểm tra 40 cơ sở chăn nuôi; 14 cơ sở thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y; 06 cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; 04 cửa hàng thịt; 03 cơ sở giết mổ Qua kiểm tra, phát hiện 04 cơ sở chăn nuối có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi (Salbutamol); 01 cửa hàng thuốc thú y có dấu hiệu buôn bán chất cấm trong chăn nuôi Phối hợp với các cơ quan chức năng tiến hành xử phạt 40 triệu đồng với 03 cơ

sở sản xuất thức ăn chăn có hành vi sử dụng chất cấm trong chăn nuôi Riêng Cục Cảnh sát PCTP về môi trường đã phối hợp với các ngành chức năng (Thanh tra Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, cục quản lý dược – Bộ y tế) kiểm tra 15 công

ty, cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi; làm việc với 10 doanh nghiệp nhập khẩu hóa chất y tế có vi phạm bán hóa chất (Salbutamol) không đúng đối tượng Quá trình thanh tra, kiểm tra, ngoài việc phát hiện sai phạm của các cchemơ sở sản xuất thức

ăn chăn nuôi, cơ sở chăn nuôi trong việc sử dụng chất cấm, các sai phạm của các công ty nhập khẩu, kinh doanh hóa chất y tế lén lút bán chất tạo nạc cho các đối tượng sử dụng trong chăn nuôi, còn phát hiện được nhiều phương thức, thủ đoạn đối phó rất tinh vi, xảo quyệt nhằm trốn tránh sự phát hiện của cơ quan chức năng như

để riêng chất cấm với thức ăn không phối trộn tại xưởng mà sử dụng trực tiếp tại cơ

sở chăn nuôi… Từ tình hình thực tế trên, Cục Cảnh sát PCTP về môi trường đã tham mưu, kiến nghị với Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn bổ sung 05 loại chất Vàng Ô vào danh mục cấm nhập khẩu, kinh doanh và sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam

Với mức độ gây hại như vậy, việc xác định dư lượng Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt, nước tiểu của gia súc, gia cầm là rất cần thiết Trong bản luận văn này, chúng tôi đã triển khai nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong

mẫu thức ăn chăn nuôi và trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt của lợn bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Phương pháp này có độ nhạy và độ chính xác cao, dễ áp dụng và có thể trở thành công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm

1.1.2 Tác dụng của β 2 -agonist

Beta-agonist được phân làm hai nhóm theo đặc tính chữa bệnh như sau: Nhóm β1-agonist: gồm các chất như dobutamine, isoproterenol, samoterol và epinephrine có tác dụng kích thích tim, được dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp tính

Nhóm β2-agonist: gồm các chất như salbutanol, clenbuterol, cinaterol, fenoterol, formoterol, terbutaline, denopamine, isoxsuprine, ractopamine,… có tác dụng làm giãn cơ, được dùng để điều trị hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính

1.1.3 Phân loại β 2 -agonist

Đối với động vật khi sử dụng β2-agonist dẫn tới sự chuyển hướng số lượng lớn các chất dinh dưỡng từ mô mỡ về cơ, làm tăng sự tổng hợp protein thay vì mỡ,

do để nó có tác dụng làm tăng lượng thịt nạc và làm giảm lượng mỡ của cơ thể động vật

Tác dụng phụ khi sử dụng β2-agonist: gây cảm giác lo lắng, hồi hộp, tim đập nhanh, giảm hàm lượng kali trong máu, tăng huyết áp, run cơ, đau đầu, buồn nôn Các β2-agonist chia làm 2 loại:

- Các β2-agonist tác dụng ngắn: Salbutamol, Terbutalin, Fenoterol

- Các β2-agonist tác dụng dài: Clenbuterol, Formoterol, Salmeterol

Sự phân chia này dựa trên thời gian tác dụng của mỗi loại Đối với Salbutamol, Terbutaline và Fenoterosau khi đưa vào cơ thể tác dụng rất nhanh, chỉ trong vài phút và kéo dài khoảng 4 đến 6 giờ Đối với Clenbuterol, Formoterol và Salmeterol thời gian tác dụng kéo dài đến xấp xỉ 12 giờ [1] Thời gian hoạt động lâu dài của loại thứ hai là do các phân tử này ban đầu khuếch tán vào màng plasma của

tế bào phổi, và sau đã được giải phóng chậm trở lại bên ngoài tế bào nơi mà chúng

cã thể kết hợp với β2-adrenoceptors

Tháng 11/1995 FDA (Mỹ) đưa ra một tư vấn sức khoẻ, báo động cho công chúng: sử dụng các β2-agonist tác dụng dài có thể dẫn tới các triệu chứng xấu và trong vài trường hợp gây tử vong

1.2.1 Thông tin chung

- Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của salbutamol

- Khối lượng phân tử: 239,311 g/mol

- Thời gian bán huỷ: 3,8 - 6 giờ

- Công thức cấu tạo hai đồng phân quang học của Clenbuterol



- Khối lượng phân tử: 277,19 g/mol

- Thời gian bán huỷ: 36 – 39 giờ

- Khối lượng phân tử: 301,39 g/mol

- Công thức cấu tạo của Ractopamine

1.2.2 Tính chất và tác dụng của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine

1.2.2.1 Tác dụng làm giãn phế quản

• Salbutamol

Salbutamol [1-(4-(RS)-hydroxy- 3- hydroxymethylphenyl)- 2-(t-butylamino) ethanol] là chất chủ vận thụ thể adrenergic β2 (β2-adrenoceptor agonist) có tác dụng trên cơ trơn và cơ xương, gồm có: giãn phế quản, giãn cơ tử cung và run Tác dụng giãn cơ trơn tùy thuộc vào liều dùng và được cho rằng xảy ra thông qua hệ thống adenyl cyclase - AMP vòng, với việc thuốc gắn vào thụ thể β2-adrenergic tại màng

tế bào gây ra sự biến đổi ATP thành AMP vòng làm hoạt hóa protein kinase Điều này dẫn đến sự phosphoryl hóa các protein và cuối cùng làm gia tăng canxi nội bào

loại liên kết; calci nội bào ion hóa bị giảm bớt gây ức chế liên kết actin-myosin, do

đó làm giãn cơ trơn

Thuốc chủ vận β2 như salbutamol cũng có tác dụng chống dị ứng bằng cách tác dụng lên dưỡng bào làm ức chế sự phóng thích các hóa chất trung gian gây co thắt phế quản như histamin, yếu tố hóa ứng động bạch cầu đa nhân trung tính (NCF)

và prostaglandin D2

Salbutamol làm giãn phế quản ở cả người bình thường lẫn bệnh nhân suyễn hay bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) sau khi uống Salbutamol còn làm gia tăng sự thanh thải tiêm mao nhầy (đã được chứng minh ở bệnh nhân COPD lẫn ở người bình thường)

Salbutamol kích thích các thụ thể β2 gây ra các tác dụng chuyển hóa lan rộng: tăng lượng acid béo tự do, insulin, lactat và đường; giảm nồng độ kali trong huyết thanh

Salbutamol có lẽ là chất có hiệu lực và an toàn nhất trong số các thuốc giãn phế quản loại giống giao cảm

• Clenbuterol

Clenbuterol[(RS)-1-(4-Amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tert-butylamino)

ethan-1-ol] là một chất thuộc nhóm β2–agonist, có tác dụng làm giảm cơ trơn phế quản, ổn định màng tế bào mast nên giảm tiết chất trung gian và kích thích cơ vân (gây run), tăng sự vận chuyển dịch nhày nhờ các lông trên đường hô hấp Thường dùng trong các cơn hen suyễn cấp Đối với hầu hết các trường hợp, nhóm β2–agonist là thuốc làm giãn phế quản hiệu quả nhất hiện nay

• Ractopamine

Ractopamine [4-((S)-1-hydroxy-2-((R)-4-(4-hydroxyphenyl)butan-2ylamino)

ethyl) phenol] là một chất thuộc nhóm β2–agonist, được dùng như là thức ăn bổ sung kích thích tăng trưởng và tăng tỷ lệ thịt nạc ở lợn vỗ béo Cơ chế tác động của ractopamine vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chúng hoạt động thông qua sự chuyển hóa AMP và kết quả là phá vỡ các mô mỡ và tích lũy protein cho các mô cơ

Ractopamine thường được sử dụng dưới dạng ractopamine hydrochloride và được xem như là nhân tố phân phối lại vật chất trong cơ thể

1.2.2.2 Tác dụng làm tăng tỷ lệ nạc/mỡ

Trên cơ thể động vật, β2–agonist điều tiết sự sinh trưởng: thúc đẩy phát triển

cơ bắp và tác dụng phân giải lipid, điều khiển các chất dinh dưỡng hướng tới mô cơ, tăng sinh quá trình tổng hợp protein để tích luỹ nạc và giảm sinh tổng hợp mỡ, giảm tích luỹ mỡ trong cơ thể; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn Nhờ tính chất này các chất nhóm β2–agonist bị sử dụng trái phép trong chăn nuôi, chỉ cần một lượng nhỏ

β2–agonist trộn vào thức ăn hàng ngày làm cho lợn lớn rất nhanh, mỗi ngày có thể tăng từ 1,5 tới 2 kg, xương vai xương đùi nhỏ lại, các bắp thịt to lên và trở thành lợn siêu nạc nhanh chóng

Về dược động học, salbutamol được hấp thụ đến 80% qua đường tiêu hóa và chuyển hóa đáng kể trước khi vào máu Sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là dưới dạng muối sulphat, được hình thành trong niêm mạc ruột và tồn tại dạng không hoạt động Khoảng 10% thuốc tồn tại trong máu ở dưới dạng gắn với protein Nghiên cứu đã chỉ ra rằng 58-78% lượng thuốc có gắn phóng xạ được đào thải qua nước tiểu trong vòng 24 giờ và 65-84% trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, trong đó 34-47% thuốc tồn tại ở dạng liên hợp và khoảng 50% tồn tại dạng tự do Lượng salbutamol tích luỹ trong gan ít hơn trong cơ, nó có thể thải dần qua nước tiểu và một ít qua đường phân Tuy nhiên, đây là một chất bền nhiệt, hầu như không thay đổi, không mất đi trong quá trình nấu ở nhiệt độ trên 100oC

1.2.3 Tác hại của Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine đối với sức khỏe con người

Salbutamol, clenbuterol, ractopamine đều là những chất tăng trọng Các chất này được sử dụng trong chăn nuôi với mục đích làm tăng năng suất sản xuất thịt; trong thể thao, chúng được sử dụng bất hợp pháp để làm tăng quá trình đồng hóa và được sử dụng như các loại doping Nhưng hậu quả ảnh hưởng đến sức khoẻ người dùng là rất nghiêm trọng Các nhà khoa học cảnh báo, sử dụng thường xuyên thực phẩm chứa hocmon nói chung, đặc biệt là hocmon hoá học tổng hợp sự gây những

tác hại rất lớn cho con người Bình thường cơ thể con người tự tổng hợp được những hocmon cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển Khi những loại hocmon này được đưa vào cơ thể quá thường xuyên qua đường ăn uống thì khả năng vốn có trên dần bị ức chế, đến lúc bị phá hỏng [2] Salbutamol, clenbuterol, ractopamine là chất rất dễ tồn dư trong thịt và thường tạo thành hiện tượng trúng độc mãn tính và trúng độc cấp tính: rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù

nề, liệt cơ, tăng huyết áp khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm còn tồn dư salbutamol, clenbuterol, ractopamine

1.2.4 Tình hình sử dụng Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine

Từ những năm 80, các chất salbutamol, clenbuterol và ractopamine đã được

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn, bò thịt, gà thịt nhằm kích thích sinh trưởng, tăng

tỉ lệ thịt nạc, giảm chi phí thức ăn

Ở Việt Nam, vấn đề “báo động tồn dư hoá chất cấm trong thịt gia súc, gia cầm” đã được báo chí nói đến nhiều năm 1999 Các hoá chất cấm trong thịt gia súc, gia cầm chủ yếu là các loại chất kích thích tăng trưởng họ β2–agonist Các dẫn xuất thuộc nhóm β2–agonist thường dùng có salbutamol, mabuterol, clenbuterol Ractopamin, cimaterol, phenoterol và nhiều chất tương tự khác Năm 2002 nước

ta đã cấm sử dụng những loại chất kích thích này vì nó có khả năng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ người tiêu dùng Tuy nhiên, do lợi nhuận to lớn mà nó mang lại, người chăn nuôi đã lạm dụng những loại chất này trộn vào thức ăn cho vật nuôi Gần đây, việc sử dụng thức ăn có nhiễm chất kích thích được phát hiện tại thành phố Hồ Chí Minh (2006-2007) Trong 86 mẫu lợn được giết mổ tại đây có gần 20% mẫu có chứa các hợp chất β2–agonist Ngoài ra người ta cũng phát hiện tại đây có thận bò, ngựa có hàm lượng salbutamol cao gấp 3 lần so với tiêu chuẩn quốc tế

Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho biết, kết quả phân tích cho thấy tình trạng sử dụng hoocmon kích thích tăng trưởng họ β2–agonist (Clebuterol, Salbutamol, Ractopamin ) trên thức ăn chăn nuôi ở phía Nam đáng báo động Đây là những chất gây nguy hại cho sức khoẻ con người nằm trong danh mục cấm của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn nhưng vì lợi nhuận có doanh

nghiệp đã bất chấp, sử dụng hoocmon để phối trộn vào thức ăn chăn nuôi Viện cũng khẳng định, từ tháng 6-11/2006, Viện nhận 428 mẫu thức ăn chăn nuôi do Cục Chăn nuôi và 12 tỉnh, thành gửi về, chủ yếu là thức ăn hỗn hợp, thức ăn đậm đặc, nguyên liệu chế biến Số mẫu trên chia làm 2 giai đoạn phân tích bằng phương pháp định tính và định lượng Kết quả phân tích β2–agonist trong thức ăn chăn nuôi như sau: Có 47/428 mẫu dương tính (chiếm 10,98%) Hầu hết các mẫu dương tính với

β2–agonist là thức ăn cho lợn - chiếm 96,5%, chỉ có 3,5% là thức ăn dùng cho gà Theo kết quả phân tích mẫu của Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, 2 loại hoocmon cấm như Clenbuterol, Salbutamol thường được sử dụng phổ biến Hàm lượng Clenbuterol trung bình trong thức ăn chăn nuôi là khá cao 124,82 ppb Mẫu thấp nhất chứa 1,54 ppb còn mẫu cao nhất chứa tới 319,49ppb Có tới 34,5% số mẫu dương tính có hàm lượng trên 235 ppb Đối với Salbutamol dù thấp hơn Clenbuterol nhưng trung bình cũng ở mức 57,71 ppb và dao động từ 21,90 - 87,51 ppb

Theo Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT ngày 15 tháng 02 năm 2016 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quy định mẫu được coi là dương tính khi có kết quả phân tích định lượng cao hơn hoặc bằng một trong các giá trị (tính bằng ppb) nêu tại bảng dưới đây:

Bảng 1.1: Quy định mẫu được coi dương tính với nhóm β2–agonist

1 Thức ăn chăn nuôi 10,0 10,0 10,0

cấm trong các cơ sở chăn nuôi nông hộ, thì năm 2015 đã phát hiện trong cả các cơ

sở sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y và trong các cơ sở chăn nuôi trang trại lớn,…điển hình là khu vực các tỉnh phía Nam trong 10 tháng đầu năm 2015: Đồng Nai đã phát hiện 109/654 mẫu nước tiểu lợn dương tính với chất salbutamol (chiếm 16,7%), TP HCM 95/516 mẫu (chiếm 18,4 %),Đăk Nông 3/54 mẫu (chiếm 5,6 %), Tây Ninh 5/9 mẫu (chiếm 55,5 %), Tiền Giang 35/525 mẫu (chiếm 6,7 %) và Vĩnh Long 6/68 mẫu (chiếm 8,8 %)…Nồng độ salbutamol trong các mẫu nước tiểu vật nuôi rất cao, đa số là trên 200 ppb, có mẫu lên tới 665 ppb

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thông báo kết quả triển khai các tháng cao điểm về kiểm soát tại tổng số cơ sở kiểm tra là 1733 cơ sở, trong đó có 51

cơ sở có vi phạm về chất cấm (chiếm 2,9%), trong đó:

 Tổng số mẫu thức ăn chăn nuôi đã lấy: 1008 mẫu, 13 mẫu vi phạm chất cấm (chiếm 1,3%)

 Tổng số mẫu nước tiểu lợn đã lấy: 3503 mẫu, 212 mẫu vi phạm chất cấm (chiếm6,05%)

 Tổng số mẫu thịt, phủ tạng đã lấy: 398 mẫu, 12 mẫu vi phạm chất cấm (chiếm 3,0%)

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thời gian qua, việc sử dụng chất cấm trong chăn nuôi và chế biến thức ăn gia súc có biểu hiện giảm, nhưng vẫn diễn ra khá phức tạp Đầu năm 2016, cơ quan chức năng đã kiểm tra 40 công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi ở khu vực phía Bắc thì có đến 18 công ty vi phạm Cục Thú

y lấy 1.457 mẫu kiểm tra thì có tới 10% mẫu có chứa chất cấm, trong khi lấy 1.026 mẫu nước tiểu thì có đến 67 mẫu có phát hiện chất salbutamol

Theo Cục Cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường (C49), Bộ Công an, trong năm 2015, các doanh nghiệp được Bộ Y tế cấp phép nhập khẩu hơn 9 tấn chất salbutamol nhưng có đến hơn 6 tấn không được sử dụng vào sản xuất Dược mà được tuồn ra ngoài thị trường, số này cũng không loại trừ việc sử dụng vào chăn nuôi lợn (heo)

Bộ luật hình sự sửa đổi năm 2015, tại Điều 317 quy định “các cá nhân, tổ

chức sử dụng các hóa chất, phụ gia bị cấm trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

sẽ bị phạt hành chính từ 50 - 200 triệu, phạt tù từ 1 - 5 năm, trường hợp nặng có thể

bị phạt tù 20 năm”, như vậy, các hành vi sử dụng chất tạo nạc cấm trong chăn nuôi

có thể bị xử lý hình sự thay vì chỉ xử lý hành chính như trước Với việc nâng cao khung hình phạt, cùng với các biện pháp quản lý chặt chẽ quy trình nhập khẩu và sử dụng các chất thuộc nhóm β2–agonist, dự báo tình trạng sử dụng chất tạo nạc cấm trong thời gian tới sẽ được kiểm soát

Như vậy, để đáp ứng yêu cầu đấu tranh phòng chống tội phạm trong lĩnh vực

an toàn thực phẩm đã đặt ra yêu cầu cần giám định đối với lực lượng Kỹ thuật hình

sự CAND, cụ thể là Phòng giám định Hoá pháp lý, Viện Khoa học hình sự, 02 Đội giám định Hóa pháp lý thuộc Phân Viện Khoa học hình sự tại Tp Hồ Chí Minh và

Tp Đà Nẵng và các Phòng Kỹ thuật hình sự Công an cấp tỉnh Các lực lượng này cần phải chuẩn bị các điều kiện cần thiết để có thể triển khai giám định định lượng các chất cấm này khi có yêu cầu từ các cơ quan tiến hành tố tụng

Trong điều kiện hiện nay và với các trang thiết bị, hóa chất, chất chuẩn hiện

có Viện Khoa học hình sự có thể đáp ứng được điều kiện cần để giám định một số chất cấm này trong một số đối tượng mẫu cụ thể Tuy nhiên, để có thể đảm bảo kết quả được chính xác, khách quan, phù hợp với các phương pháp phân tích hiện đang

sử dụng trên thế giới, cũng như các phương pháp mà các phòng thí nghiệm đạt chuẩn hiện tại ở Việt Nam thì cần thiết phải có một nghiên cứu khoa học để xây dựng phương pháp phân tích phù hợp, đảm bảo kết quả có độ chính xác, độ chụm tốt, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đáp ứng yêu cầu đặt ra theo quy định hiện hành

1.2.5 Các phương pháp xác định Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine 1.2.5.1 Trong nước

Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng đã ban hành TCVN

11294-2016 [15] xác định dư lượng B2-Agonist (clenbuterol, salbutamol và ractopamin) trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần Các chất

nhóm B2-Agonist có trong mẫu sản phẩm thịt được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitrile và isopropanol Sử dụng các muối natri clorua, natri sulfat và magie sulfat để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết Dịch chiết được bay hơi dung môi đến khô, phần cặn được hòa tan bằng dung dịch nước chứa 10% axetonitril, sau

đó làm sạch bằng n-hexan Phần dịch chiết sau khi làm sạch được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần để xác định clenbuterol, salbutamol và ractopamin Giới hạn định lượng của phương pháp là clenbuterol 0,1mg/kg, salbutamol 2,5mg/kg và ractopamin là 5mg/kg

1.2.5.2 Thế giới

 Phương pháp sắc ký lỏng bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Các tác giả P.V.Colthup, F.A.A.Dallas, D.A.Saynor, P.F.Carey, L.F.Skidmore, L.E.Martin và K.Wilson [RE1] đã xác định được Salbutamol trong huyết tương người bằng cách chiết Salbutamol ra khỏi mẫu bằng phương pháp SPE sau đó chuyến Salbutamol về dạng có màu xanh bằng phản ứng với dimethyl-p-phenylanediamine Chất nhuộm màu được tách bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

và được định lượng bởi độ hấp thụ ở bước sóng 650 nm Phương pháp này cho độ nhạy cao, giới hạn phát hiện tương đối thấp: 20ng/ml trong nước tiểu và 1ng/ml trong huyết tương

 Phương pháp ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp hấp thụ miễn dịch có gắn enzyme (ELISA –Enzyme Linked Immunosorbent Assay) đã được ứng dụng để xác định beta-agonistdựa trên nguyên

lý kháng nguyên –kháng thể Phương pháp ELISA có độ nhạy cao, thao tác tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh nhưng có nhược điểm là kém chính xác trong cácnền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc vào hóa chất của nhà sản xuất Phương pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol có rất nhiều dạng, dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphat) vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng

nguyên và thông qua cường độ màu sẽ biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml)

Meyer và các cộng sự đã xác định được salbutamol và clenbuterol có trong mẫu nước tiểu bằng cách sử dụng enzym immunoassay (EIA) và HPLC [RE2] Mẫu nước tiểu được làm sạch qua cột chiết SPE C18 silicagel (100 mg), dùng HPLC tách lấy phân đoạn salbutamol và clenbuterol rồi dùng EIA để phân tích Phương pháp EIA này sử dụng hoóc môn đánh dấu, được điều chế bằng cách đun Sal và monocloractic trong môi trường kiềm để hình thành salbutamol–4–carbonxylmethyl ether (CME), được nối với coenzim biocytin qua liên kết peptit Thêm vào mẫu glubomin miễn dịch G của cừu (hoặc thỏ) và ủ cho đến khi phản ứng đạt trạng thái cân bằng Thêm vào đó dung dịch streptavidin –perosidase và ủ cho tới khi có màu, dựa vào màu sắc có thể tính được nồng độ salbutamol trong mẫu Nhóm tác giả khẳng định, HPLC là phương pháp hữu hiệu để phân tích các beta-agonist nhưng để sàng lọc thì sử dụng EIA sẽ nhanh, rẻ hơn và có thể phân tích hàng loạt mẫu

 Phương pháp điện di mao quản

Việc xác định các beta-agonistbằng phương phápđiện di mao quản chủ yếu

sử dụng các detector điện hóa như đo dòng, đo điện thế hay đo độ dẫn Việc sử dụngcác detector điện hóa hay UV –Vis cho giá trị LODcủa phương pháp đạt được

cỡ ppm, với độ nhạy này có thể xác định hàm lượng các beta-agonisttrong mẫu dược phẩm hay một số mẫu thức ăn chăn nuôi, nước tiểu, huyết thanh của người sử dụng dược phẩm Tuy nhiên với các mẫu nước tiểu, huyết thanh, thịt hay nội tạng động vật có dư lượng B2-agonistnhỏ cỡ ppb, việc phát hiện và định lượng được bằng các detector này sẽ khó Theo nghiên cứu của tác giả Anurukvorakun và cộng

sự [RE3] với phương pháp CE sử dụng detector MS cho giá trị LOD tốt nhất bằng 0,3 ppb nhưng hệ CE –MS có cấu tạo phức tạp, chi phí đầu tư cao nên không được dùng phổ biến Phương pháp điện di mao quản sửdụng detector độ dẫn C4D gần đây được sử dụng nhiều, tuy nhiên độ nhạy kém cũnglà một hạn chế chính của

phương pháp, để khắc phục hạn chế này cần nghiên cứu các phương pháp làm giàu chất phân tích Mặc dù vậy chưa có nghiên cứunào công bốcó sựkết hợp phương pháp điện di mao quản với mộtkỹ thuật làm giàu mẫu phântích nhưkỹ thuât chiết pha rắn Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Gao và cộng sự [RE4] đã khắc phục phần nào hạn chế độ nhạy của CE – C4D bằng kỹ thuật làm giàu trên cột (làm giàu online) Đây là một kỹ thuật làm giàu mới, nhằm “tập trung” vùng mẫu chứa chất phân tích trong mao quản, do đó làm tăng thể tích mẫu được bơm vào mao quản trong CE, kết quả đã nâng độ nhạy của phương pháp lên khoảng 30 –40 lần nhưng giá trị LOD mới đạt 0,02 mg/l Trong tương lai, đây là hướng nghiên cứu mới nhằm tăng độ nhạy của CE –C4D

 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ HPLC

Sắc ký lỏng khối phổ là sự ghép nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector khối phổ Sau khi ra khỏi cột sắc ký, dung dịch được hoá hơi và bị ion hoá thành các mảnh ion mang điện tích Giống như phương pháp GC-MS, các ion này được đưa sang bộ phận phân tích khối lượng và được định lượng và định tính

Các tác giả Jianli Zhang, Youxuan Xu, Xin Di, Moutian Wu đã sử dụng phương pháp này để định lượng Clenbuterol có trong nước tiểu người [RE5] Trong kỹ thuật này, Clenbuterol được tách ra khỏi nền mẫu bằng enzim b-glucuronidase sau đó làm sạch và làm giàu bằng cột chiết SPE Bond Elut-Certify Sau khi bay hơi dung môi, cặn được hoà trong 200 µl pha động (0,01M

CH3COONH4 (pH=3,5) – axetonitril 85:15) và bơm với lượng 5 µl vào máy ESI-MS Phương pháp này dùng máy HPLC với cột Zorbax SB-C18 (150mm x 2,1mm, 5 µm) Tốc độ dòng là 0,25 ml/phút, detector ESI-MS sử dụng bộ phân tích tứ cực, chạy chế độ SIM với ion dương Nhiệt độ calpillary là 3000C, thế capilary 3kV; thế phân mảnh khoảng 200 V và chọn mảnh ion m/z = 166 để khảo sát Bằng cách này tác giả Jianli Zhang đã xây dựng được đường chuẩn với khoảng tuyến tính khá lớn: 10,0 – 2000 ng/ml Theo phương pháp này độ thu hồi cũng khá

LS-cao: khoảng 71-75 %

Bằng phương pháp này, các tác giả Milagro Reig, Natalia Batlle, José Luis Navarro, Fidel Toldra đã xác định được Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine trong nước tiểu bò và thức ăn gia súc [RE6] Salbutamol, Clenbuterol, Ractopamine được tách ra khỏi nền mẫu ban đầu bằng axit clohidric, được làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE, đem thổi khô, sau đó được dẫn xuất với methyl boronic axit (MBA) tạo hợp chất Salbutamol dimethyl boronate bằng cách hoà cặn với 50 ml MBA 10mg/ml, lắc vortext, để phản ứng trong 15 phút ở 500C Phương pháp này sử dụng máy GC-MS với cột sắc ký HP-5MS (15m x 0,25µm x 0,25mm), pha động là khí Heli với tốc độ dòng là 1ml/phút, lượng mẫu nạp vào là 1 µl Chương trình nhiệt độ của lò: nhiệt ban đầu 1000C trong 2,5 phút; sau đó tăng 200C/phút tới 2600C, tăng tiếp 50C/ phút tới 2900C và giữ trong 10 phút Thế ion hoá được đặt là 70 eV, chạy

ở chế độ SIM (selected ion monitoring) và thu được các mảnh ion m/z : 188, 230,

272, 287 Giới hạn của phương pháp phụ thuộc vào bản chất mẫu và chế độ bắn phá Đối với nước tiểu bò, giới hạn phát hiện là 1 ng/ml; đối với mẫu thức ăn gia súc giới hạn phát hiện là 2,5 ng/ml

 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các β2-Agonist Sau khi qua cột tách , chất phân tích được hóa hơi , các hợp chất hữu cơ trung hoà

bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc

âm, các gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệ u thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các

ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Một phương pháp để xác định đồng thời dư lượng của 11 β2-agonist gồm clebuterol, salbutamol, ractopamine, terbutaline, salmeterol, propanolol, tulobuterol, cimaterol, mabuterol, mapenterol và zilpaterol trong thịt lợn đã được phát triển và đánh giá Chất phân tích được chiết bằng chiết lỏng–lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) và định lượng bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ ion hóa phun điện tử (LC-ESI-MS/MS) thực hiện ở chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring) ion dương Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ở mức pg/g cho tất cả β2-agonist trong thịt lợn Khoảng đường chuẩn của các hợp chất này dao động trong khoảng 0,25 ng/g đến 5 ng/g Độ thu hồi khoảng 82% đến 105% với giá trị RSD khoảng 1,6% và 8,4%

Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ đã xây dựng phương pháp sàng lọc và định lượng beta-agonist bằng HPLC/MS/MS Dư lượng của clenbuterol, salbutamol, cimaterol, zilpaterol, và ractopamine được chiết xuất từ võng mạc, gan, hoặc mô cơ bắp với một hỗn hợp của acetonitrilvà isopropanol Natri clorua, natri sunfat, và magnesium sulfate muối được sử dụng để kết tủa protein và làm mất nước Chiết xuất này được bốc hơi, hòa cắn trong nước, lọc và phân tích bởi HPLC / MS / MS Phương pháp nàyphù hợp choviệc kiểm trahoặcxác nhậnβ2-agonist trongmôvõng mạcbò(trừzilpaterol); trâu, bò,lợn,cừu, và ganthuộc về dê; vàbòvàcơ bắplợn Sàng lọcđược áp dụngtại nồng độ≥ 3ppbchoclenbuterol,salbutamol, cimaterol, vàractopamine; và≥ 6ppbchozilpaterol

Estrada-Montoya và cộng sự đã xây dựng phương pháp sàng lọc và khẳng định xác định dư lượng clenbuterol trong thịt bò trên thị trường vùng đông bắc Mexico [RE7] Nólà điều cần thiếttừcácđiểmy tế cộng đồng, các cơ quanđiều tiếtMexicothực hiệngiám sátChương trìnhgiám sátmàkhông chỉ sử dụngcác phương phápsàng lọcsơ bộđể xácđịnhclenbuterol, nhưng cũng sử dụngphương phápxác địnhnhưkỹ thuật MS-MS Vì vậy, mục đích của việcnàylà để theo dõisự hiện diện củaclenbuteroldư lượng trongcơthịtbòđược thu thập từcácthị trườngđịa phương

Từ50mẫu thịtbòđược phân tích bởicácthử nghiệmELISA, trong đó có: 6 mẫu(tỉ lệ 12%) phát hiện dư lượngclenbuterol trong khoảng3,06-6,12mg/kg, 13 mẫu(tỉ lệ 26%) 0,5-1,83mg/kg, 24 mẫu(tỉ lệ 48%) từ0,1-0,5mg/kgvàchỉ7 mẫu(tỉ lệ 14%) là dưới giới hạnphát hiện(LOD) là 0,1mg/kg.Kết quả cho thấyclenbuterolđã được sử dụngbất hợp phápnhưmộtpromotertăng trưởng ở bò

Các phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector UV, huỳnh quang); điện di (CE); sắc ký khí GC thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu Chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để xác định các B2-Agonist trong thịt gia súc, gia cầm Phương pháp có

độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao

1.3 Phương phápnghiên cứu sắc ký lỏng ghép khối phổ(LC-MS/MS)

1.3.1 Giớithiệuphươngphápphântíchsắckýlỏngghépkhốiphổ (LC-MS/MS)

1.3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động là chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn ở dạng hạt có kích thước xác định hoặc một chất lỏng đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) được sử dụng phổ biến để phân tích các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học, công nghiệp, nông nghiệp và phân tích thủy sản…

Những hợp chất có thể được phân tích bằng sắc ký lỏng tương đối nhiều như: amino acid, protein, nucleic acid, hydrocarbon, carbohydrate, kháng sinh, các hợp chất terpenoid , thuốc trừ sâu, chất hoạt động bề mặt, steroid,…

Dựa vào khả năng tách của cột sắc ký, trong HPLC, người ta chia ra nhiều loại: sắc

ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến Tùy theo độ phân cực của pha tĩnh và dung môi trong pha động, có hai loại sắc ký lỏng:

Sắc ký lỏng pha thường: Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của

dung môi pha động Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ tương tác mạnh với pha tĩnh

và được giữ lại lâu hơn, kỹ thuật này thường dùng để phân tích các chất có độ phân cực cao

Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký lỏng pha thường, pha tĩnh có độ

phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn Cơ chế là chất phân cực nhiều sẽ được giữ lại yếu hơn trên pha tĩnh, chất càng ít phân cực thì càng bị giữ mạnh hơn trên pha tĩnh Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa Dung môi sử dụng là các dung môi phân cực như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, nước và hỗn hợp của chúng Sắc ký lỏng pha đảo thường được sử dụng nhiều hơn

1.3.1.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý

số liệu (data processor) Khi hỗn hợp chất phân tích được tiêm vào cột, pha tĩnh tương tác với mỗi cấu tử và có tác dụng giữ cấu tử lại, pha động cũng tương tác và

có tác dụng lôi cấu tử ra khỏi cột Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các

chất với pha tĩnh và pha động, các hợp chất cần phân tích được tách ra khỏi nhau

và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi đầu dò cụ thể Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò: đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò huỳnh quang (FLD), đầu dò chỉ số khúc xạ (RID), đầu dò ELSD dựa trên cường độ phân tán của bức xạ laser sau khi chạm vào chất phân tích, đầu dò điện hóa (ECD), đầu dò khối phổ (MS) Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích các hợp chất cần nhận danh chính xác và đặc biệt trong phân tích vết

Hình 1.1: Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1.3 Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)

Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, đầu dò khối phổ có các bộ phận chính sau đây: bộ tạo ion, bộ phân tích khối và bộ dò ion Xin trình bày sau đây hai bộ phận

cơ bản nhất là bộ tạo ion và bộ phân tích khối phổ

Sự tạo ion trong sắc ký lỏng ghép khối phổ được thực hiện ở áp suất thường

Có hai cách tạo ion chính: ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric pressure chemical ionization) và ion hóa bằng cách phun điện tử ESI (Electrospray ionization) Hai kỹ thuật ion hóa này được xem là loại ion hóa “mềm” (soft ionization), ít phân mảnh hơn so với ion hóa điện tử (electron ionization) trong GC/MS

a) Kiểu ion hóa APCI

Nguyên tắc hoạt động: Phân tử chất phân tích và dung môi đi qua bộ phận

gia nhiệt khoảng 350oC sẽ bị hóa hơi và được khí nitơ đẩy vào vùng phóng điện Ở đây, các phân tử khí bị ion hóa bởi kim phóng điện theo hai cơ chế tạo ion dương hoặc tạo ion âm

• Tạo ion dương

N2 + e- → N2+ + 2e-

H2O + e- → H2O+ + 2e-

H2O + H2O.+ → H3O+ + OH

M + H3O+→ MH+ + H2O [ phản ứng giữa ion và phân tử]

b) Kiểu ion hóa ESI

Nguyên tắc hoạt động: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký

được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại có điện thế từ 3- 5 kV, sau đó được phun sương bằng khí N2 tạo thành những hạt sương nhuyễn, có mang điện tích, thoát ra từ đầu ống mao quản Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi Các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích và cuối cùng cho ra ion Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tích ion qua một hệ thống dẫn ion Dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài

So với kỹ thuật APCI thì kỹ thuật ESI ít tạo ra sự phân mảnh hơn ESI được

sử dụng nhiều hơn cho phân tử phân cực và có phân tử khối lớn

c) So sánh hai kỹ thuật APCI và ESI

Cả hai kỹ thuật đều thuộc loại ion hóa “mềm” nghĩa là ít tạo sự phân mảnh ion thành những ion nhỏ hơn và do đó, trong nhiều trường hợp, còn thấy được ion tạo thành từ phân tử ban đầu: ion dương [M+H]+ hay ion âm [M-H]- Hơn nữa, nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng có thể đơn giản hơn so với ion hóa “cứng” (hard ionization), giúp sự đoán nhận cấu trúc hóa học ban đầu dễ dàng hơn

Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hay dương tùy cấu trúc hóa học, tuy nhiên APCI có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn

Về nguyên tắc, APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực vừa,

có phân tử khối nhỏ, dưới 1000 amu ESI được sử dụng cho phân tử phân cực nhiều hơn và có khối lượng phân tử lớn

Với kỹ thuật ESI, có thể tạo ion đa điện tích trong trường hợp các phân tử

có phân tử khối lớn và có thể nhận nhiều proton (ion dương) hay mất nhiều proton (ion âm) Ngược lại kỹ thuật APCI chỉ có thể cho hoặc nhận một proton H+

Với ESI, tốc độ pha động 5µl-1ml/phút tùy kích cỡ cột sắc ký

Với APCI, tốc độ pha động thường khoảng 0,1-2ml/phút tùy theo kích cỡ cột sắc ký

1.3.1.4 Bộ phân tích khối

a) Bộ phân tích khối một tứ cực

Tứ cực gồm 4 thanh kim loại hình trụ hoặc hyperbol được đặt song song nhau (hãng Thermo Fisher hay Agilent), chịu tác dụng đồng thời của điện thế một chiều U và điện thế xoay chiều cao tần V, từng cặp đối diện được nối vào cùng một cực của điện thế

Tứ cực Hyperbol

Hình 1.2: Bộ phân tích khối một tứ cực

Nguyên tắc vận hành: Về nguyên tắc, có hai chế độ vận hành:

• SIM (Selected ion monitoring)

Ứng với một ion được chọn có trị số m/z, thì U và V phải có trị số xác định

(được tính bởi phần mềm của máy) để cho phép ion đi xuyên qua được tứ cực và

đến được bộ dò ghi nhận Những ion có trị số m/z lớn hay nhỏ hơn không xuyên qua

tứ cực được Do đó, tứ cực còn được xem như có vai trò lọc khối (mass filter) Độ phân giải có thể được điều chỉnh bởi cặp U, V (về thực tế, điều nầy có thể do người thao tác cài đặt sai số ∆m trên phân tử khối m của ion, ∆m càng nhỏ thì độ phân giải càngcao),tuynhiênkhităngđộphângiảithìđộnhạysẽgiảm

• FULL SCAN

Để thu được các ion trong một khoảng khối lượng xác định đã được cài đặt, thì phải thay đổi U và V liên tục nhưng vẫn giữ tỉ lệ U/V không đổi Độ phân giải phổ tùy thuộc tỉ lệ nầy

Lưu ý:

- Khi U = 0, chỉ còn điện thế xoay chiều cao tần V, tứ cực không còn đóng vai trò lọc khối nữa Tất cả ion đều đi qua tứ cực được, lúc bấy giờ tứ cực chỉ đóng vai trò chuyển ion Đặc tính nầy được áp dụng trong sự chuyển ion từ nguồn tạo ion đến bộ phân tích khối trong đầu dò khối phổ, tuy nhiên thay vì dùng tứ cực thì người ta dùng lục cực (hexapole) hay bát cực (octapole) có đặc tính chuyển ion tốt hơn

- Khối phổ một tứ cực vận hành theo chế độ Full Scan có độ nhạy không cao, trái lại với chế độ SIM, độ nhạy đạt khá cao, cho nên trong phân tích vết, phải luôn luôn sử dụng SIM để định lượng Ngoài ra, với đầu dò khối phổ một tứ cực, với những nền mẫu phức tạp, việc chuẩn bị mẫu phải được thực hiện rất kỹ lưỡng

để giảm bớt nhiễu nền, dù vậy độ nhạy và độ chọn lọc cũng kém hơn so với đầu dò khối phổ ba tứ cực

Hình 1.3: Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực

Với hệ thống ba tứ cực, chế độ vận hành rất phong phú, cho phép có nhiều

thông tin hữu ích trong phân tích, thí dụ có thể ghi Full Scan, SIM, Full Scan

MS/MS hay Product ion, SRM (Selected Reaction Monitoring) thể hiện trên sơ đồ của hình 1.3

c) Ưu thế của đầu đò khối phổ ba tứ cực

Thông qua hai lần phân mảnh ion, việc nhận danh chất phân tích trở nên đúng hơn

Sự khử nhiễu nền đạt cao hơn, khiến độ nhạy được tăng lên Trong phân tích

dư lượng, áp dụng chế độ MS/MS-SRM cho kết quả định lượng tốt hơn

Ngoài ra với độ nhạy khá cao của thiết bị LC-MS/MS hiện nay, có thể sử dụng ít mẫu trong chuẩn bị mẫu, vừa tốn ít hóa chất, vừa làm giảm đáng kể hiệu ứng nền trong tách chiết cũng như trong hiệu suất tạo ion tại bộ phận thu nhận tín hiệu khối phổ

1.3.2 Quy trình định tính và định lượng β 2 -agonists (Salbutamol, Clenbuterol và Ractopamine)

Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol, clenbuterol và ractopamine đều trải qua ba giai đoạn như sau:

• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)

• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích

• Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để xác nhận và định lượng chất phân tích

1.3.2.1 Chiết chất phân tích ra khỏi mẫu

Clenbuterol, salbutamol và ractopamine được chiết ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch methanol hay acetonitrile ở pH = 6 Có thể dùng đệm để ổn định môi trường chiết

1.3.2.2 Làm sạch dịch chiết và làm giàu chất phân tích

Giai đoạn này là giai đoạn quan trọng trong quá trình phân tích chất ở dạng vết vì cần phải giảm đến mức gần như tuyệt đối ảnh hưởng của các tạp chất đến quá trình phân tích chất cần khảo sát, tránh làm dơ cột sắc ký và đầu dò khối phổ

Trước đây thường áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng nhưng với cách này phải tốn kém nhiều dung môi, thời gian, chưa kể đến khả năng mất chất phân tích nhiều hơn trong tách chiết và gây ô nhiễm môi trường Do đó, hiện nay thường áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE: Solid Phase Extraction), sử dụng cột trao đổi cation SCX trong trường hợp clen và sal vốn có tính base Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là nhanh, tương đối ít tốn dung môi, dễ thao tác, có thể chuẩn bị nhiều mẫu cùng một lúc và có tỉ lệ thu hồi cao

1.3.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid Phase Extraction: SPE)

Chiết pha rắn là kỹ thuật rất tiện lợi dùng chuẩn bị mẫu trong sắc ký, kỹ thuật chiết pha rắn có thể loại bỏ các cấu tử gây nhiễu, cô lập có chọn lọc chất phân tích trong phân tích vết để đạt hiệu quả cao nhất Sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn mang đến nhiều thuận lợi như tiêu tốn ít lượng dung môi, tiết kiệm được thời gian phân tích và thiết bị thường dễ sử dụng

Có nhiều loại cột SPE dùng để chiết và làm sạch chất phân tích Cột SPE là những cột nhỏ bằng nhựa bền, có dung tích tùy thuộc vào khối lượng chất hấp phụ được nhồi vào cột và tùy thuộc vào thể tích dung dịch chứa chất phân tích đi qua cột Cột trao đổi cation SCX (Strata - SCX của hãng Phenomenex) có chứa nhựa trao đổi ion mang điện tích âm trên nền cố định và đối ion dương di động

Salbutamol và clenbuterol là những hợp chất mang điện tích dương ở pH acid nên các hợp chất này có thể được giữ tốt bởi cột trao đổi cation Nguyên tắc hoạt động của cột SPE-SCX gồm các bước sau:

1.3.3.1 Hoạt hóa cột

Đây là công việc cần thiết đảm bảo cho cột được cân bằng và tương tác tốt của chất hấp phụ với chất phân tích Mục đích là để loại trừ các chất bẩn có thể có

trong cột trước khi sử dụng, đồng thời chuẩn bị cột đạt được điều kiện tương hợp với dung dịch sắp đưa vào để tách chiết chất cần phân tích từ hỗn hợp

Hình 1.4: Nguyên tắc hoạt động của cột SPE (SCX)

1.3.3.4 Rửa giải

Thường dùng dung dịch 5% NH4OH trong MeOH để rửa giải (tốc độ chậm khoảng 1 ml/phút) Chất phân tích có mang nhóm chức amino được giải phóng và được dung môi tách ra khỏi cột Rửa với tốc độ chậm (1ml/phút)

1.3.3.5 Làm giàu chất phân tích

Dung dịch mẫu sau khi làm sạch bằng cột SPE thường được thổi khô bằng khí N2 hoặc dòng không khí, hoặc dùng máy cô quay chân không, để đuổi sạch dung môi Cặn còn lại được hòa tan chính xác bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp trước khi đưa vào máy phân tích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 3 chất nhóm β2-agonist

- Salbutamol

- Clenbuterol

- Ractopamine

Nền mẫu phân tích : Thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm thịt

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Tối ưu hóa điều kiện phân tích xác định 3 chất nhóm β2-agonist có trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

- Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích

- Thẩm định phương pháp:

• Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp

• Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

•Nước cất 2 lần khử ion;CH3OHloại HPLC;HCOOH loại HPLC

•H3PO4, p.a (pure analysis: độ tinh khiết dùng cho phân tích)

•K2HPO4, p.a (pure analysis: độ tinh khiết dùng cho phân tích)

- Dung dịch thử (dung dịch đệm)

• Chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa, 50ml, cho vào mỗi ống 20ml dung dịch

K2HPO40,1M (17,4g K2HPO4 cho vào bình định mức 1000ml, định mức tới vạch bằng H2O cất) Sau đó dùng NaOH 1M hoặc H3PO41M điều chỉnh pH của

dung dịch K2HPO40,1M trong từng ống ly tâm lần lượt về các trị số 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 bằng máy đo pH

- Dung dịch pha động

•Dungdịchmethanol(0,1%HCOOH)(theothểtíchv/v):thêm1mL HCOOH vào

1 lít methanol Siêu âm 15 phútđể loại bọt khí trước khi sử dụng

•Dung dịch H2O (0,1% HCOOH) (v/v): thêm 1 mL HCOOH vào 1 lít nước cất 2 lần khử ion Đánh siêu âm 15 phút để loại bọt khí trước khi sử dụng

- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 rpm với ống ly tâm 50 ml

và tối thiểu 13000 rpm với ống ly tâm 2 ml

- Máy lắc xoáy vortex

- Bộ chiết pha rắn SPE

- Bộ thổi khô dung môi bằng khí Nitơ

- Micropipet loại có thể tích điều chỉnh được: 10-100, 20-200, 100-1000 và loại 500-5000 µl

- Bình định mức các loại: 5 ml, 10 ml, 50 ml và 100 ml

- Ống ly tâm nhựa 50 ml có nắp kín

- Cácdụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm

2.2.3 Chất chuẩn và nội chuẩn

- Chất chuẩn và nội chuẩn gốc

• Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl)

Bảo quản:Bảo quản dung dịch nội chuẩn ở 40C, sử dụng trong 3 tháng

•Dung dịch nội chuẩn làm việc: Từ dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 1 mg/L,

tiến hành pha loãng trong nước cất để được các hỗn hợp nội chuẩn làm việc, có nồng độ chính xác (trong giới hạn khoảng 2 – 4 μg/L)

Bảo quản:Bảo quản các dung dịch nội chuẩn ở 40C, sử dụng trong 1 tuần

- Dung dịch chuẩn

•Dung dịch chuẩn gốc clenbuterol hydrochloride và salbutamol sulfate từ

hãng (100 mg/L): Cân 1,0 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 mL riêng biệt, định mức đến vạch bằng methanol, lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn

•DungdịchchuẩnhỗnhợpChuẩnhỗnhợp(1mg/L)gồmclen hydrochloride và

sal sulfate: Từ mỗi dung dịch gốc tương ứng, lấy 100 μL cho vào bình định mức 10