Nghiên cứu tạo sự kiện (event) ngô biến đổi gen chịu hạn đáp ứng về an toàn sinh học và có giá trị kinh tế

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI HỒNG QUANG Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ DỊNG NGƠ CHUYỂN GEN CHỊU HẠN THẾ HỆ T5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khố học : 2013 - 2017 Thái Nguyên, năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI HỒNG QUANG Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ DỊNG NGƠ CHUYỂN GEN CHỊU HẠN THẾ HỆ T5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K45 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2013 - 2017 Ngƣời hƣớng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Xuân Thắng Thái Nguyên, năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện quan, quý thầy cơ, bạn bè gia đình Trƣớc tiên, tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Xuân Thắng thầy TS Nguyễn Văn Duy ngƣời tận tình hƣớng dẫn tơi q trình thực đề tài hoàn thành luận văn, thầy cô, bác bảo vệ anh chị Viện Nghiên Cứu Ngơ Quốc Gia, hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi vật chất tinh thần cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun, có góp ý q báu kịp thời cho tơi trình thực đề tài Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời thân giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành đề tài Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2017 Sinh Viên Thái Hồng Quang ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 4.1 Kết đánh giá độ tinh nồng độ ADN tổng số dòng ngơ chuyển gen modiCspB nguồn V152 máy đo quang phổ 25 Bảng 4.2 Kết đánh giá độ tinh nồng độ ADN tổng số dòng ngơ chuyển gen modiCspB nguồn C436 máy đo quang phổ 25 Bảng 4.3 Kết PCR xác định có mặt gen CspB dòng V152 28 hệ T5 thông qua phản ứng PCR 28 Bảng 4.4 Kết PCR xác định có mặt gen modiCspB dòng C436 hệ T5 thơng qua phản ứng PCR 29 Bảng 4.5 Thời gian sinh trƣởng dòng ngơ chuyển gen dòng khơng chuyển gen tƣơng ứng vụ Xn 2017 31 Bảng 4.6 Chỉ tiêu hƣớng lá, tai lá, màu sắc cờ râu dòng ngơ chuyển gen không chuyển gen vụ Xuân 2017 32 Bảng 4.7 Một số đặc điểm hình thái dòng Vụ Xn 2017 33 Bảng 4.8 Khả chống chịu dòng 37 Bảng 4.9 Chiều dài bắp, đƣờng kính bắp, số hàng hạt số hạt/hàng nguồn vật liệu vụ Xuân 2017 38 Bảng 4.10 Tỷ lệ hạt/bắp, trọng lƣợng 1000 hạt suất dòng vụ Xuân 2017 40 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc biểu mang gen modiCspB Hình 4.1 Kết kiểm tra chất lƣợng ADN tổng số dòng ngơ chuyển gen modiCpsB nguồn V152 hệ T5 gel agarose 1% 26 Hình 4.2 Kết kiểm tra chất lƣợng ADN tổng số dòng ngơ chuyển gen modiCpsB nguồn C436 hệ T5 gel agarose 1% 26 Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% kiểm tra có mặt gen modiCspB dòng V152 chuyển gen hệ T5 27 Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% kiểm tra có mặt 29 Hình 4.5 Hình thái dòng C436 34 Hình 4.6 Hình thái dòng C436-modiCspB 34 Hình 4.7 Hình thái dòng V152 34 Hình 4.8 Hình thái dòng V152-modiCspB 34 Hình 4.9 Hình thái cờ dòng C436 35 Hình 4.10 Hình thái cờ dòng C436-modiCspB 35 Hình 4.11 Hình thái cờ dòng V152 36 Hình 4.12 Hình thái cờ dòng V152-modiCspB 36 Hình 4.13 Dạng bắp dòng C436 39 Hình 4.14 Dạng bắp dòng C436-modiCspB 39 Hình 4.15 Dạng bắp dòng V152 39 Hình 4.16 Dạng bắp dòng V152-modiCspB 39 iv DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt PCR Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) TNHH Trách nhiệm hữu hạn THN Thoát nƣớc ABA axit absisic TP – PR Thụ Phấn-Phun Râu THL Tổ hợp lai NSTT Năng suất thực thu P1000 hạt Khối lƣợng 1000 hạt TGST Thời gian sinh trƣởng TB Trung Bình CV% Độ lệch chuẩn BDG Biến Đổi Gen LSD Least-Significant Difference v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển trồng biến đổi gen chịu hạn 2.2 Sự kiện ngô chuyển gen modiCspB 2.3 Các phƣơng pháp đánh giá, phân tích chuyể n gen 2.4 Một số khái niệm liên quan đến tính ổn định trồng 11 2.4.1 Genotype môi trƣờng 11 2.4.2 Tƣơng tác genotype môi trƣờng 11 2.4.3 Tính ổn định 12 2.5 Tính chịu hạn thực vật 12 2.6 Các hình thức chịu hạn thực vật 13 2.7 Cơ sở di truyền tính chịu hạn 14 2.8 Ảnh hƣởng hạn ngô 15 vi 2.8.1 Hạn ảnh hƣởng đến đặc tính sinh lý ngô mức độ tế bào 15 2.8.2 Hạn ảnh hƣởng đến mức độ toàn ngô 16 2.8.3 Hạn ảnh hƣởng đến suất ngô giai đoạn sinh trƣởng khác 17 Phần ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 3.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ ngô 19 3.3.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 21 3.3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 2% 22 3.3.4 Phƣơng pháp đánh giá đặc điểm nơng học số dòng ngơ chuyển gen dòng tƣơng ứng khơng chuyển gen 22 3.4 Các phƣơng pháp xử lý số liệu 23 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết xác định có mặt gen chịu hạn modiCspB dòng ngơ chuyển gen hệ T5 thơng qua kỹ thuật PCR 24 4.1.1 Kết tách chiết kiểm tra ADN tổng số 24 4.1.2 Kết PCR xác định có mặt gen modiCspB hệ T5 dòng V152 27 4.1.3 Kết PCR xác định có mặt gen modiCspB hệ T5 dòng C436 28 4.2 Kết khảo sát, đánh giá tính ổn định dòng ngơ chuyển gen modiCspB hệ T5 thơng qua đặc điểm hình thái 30 vii 4.2.1 Thời gian sinh trƣởng dòng 31 4.2.2 Một số đặc điểm hình thái 32 4.2.3 Khả chống chịu 36 4.2.4 Các yếu tố cấu thành suất suất dòng 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngô ba ngũ cốc quan trọng giới (lúa mì, lúa nƣớc, ngô) đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng làm lƣơng th ực cho ngƣời, thức ăn cho chăn nuôi, nguyên liệu cho công nghiệp, đặc biệt nguyên liệu lý tƣởng cho nhiên liệu sinh học, ngơ mặt hàng nơng sản xuất có giá trị, ngơ đƣợc hầu hết nƣớc vùng lãnh thổ giới gieo trồng phát triển liên tục Ở Việt Nam, ngô là lƣơng thƣ̣c chính đƣ́ng thƣ́ hai sau lúa và là đối tƣợng chủ lực công xóa đói giảm nghèo, đặc biệt tỉnh vùng núi Năm 2012, diện tích gieo trồng ngơ nƣớc đạt gần 1,2 triệu với sản lƣợng 4,6 triệu tấn, suất đạt 40,09 tạ/ha Tuy nhiên hàng năm nƣớc ta phải nhập ngô với lƣợng lớn, 1,614 triệu năm 2012 với giá trị 500 triệu USD.[1] Từ số liệu cho ta thấy nhu cầu ngô lớn, điều kiện khắc nhiệt Việt Nam điển hình hạn hán có ảnh hƣởng nhiều đến suất nhƣ tính ổn định suất ngơ Và từ trƣớc đến có nhiều nỗ lực nghiên cứu chọn tạo giống để nâng cao suất tính ổn định suất thông qua chọn lọc truyền thống điều kiện khơ hạn Tuy nhiên, chọn lọc tính chịu hạn theo phƣơng pháp truyền thống thƣờng hiệu không cao tƣơng tác phức tạp kiểu gen môi trƣờng Bởi vậy, tạo giống ngô chịu hạn phƣơng pháp chuyển gen cần thiết hiệu Có hai phƣơng pháp chuyển gen đƣợc áp dụng phổ biến phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp súng bắn gen chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Trong đó, phƣơng pháp chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium có nhiều ƣu điểm nhƣ giá thành rẻ; tiện lợi; tần suất chuyển gen bền vững cao Tuy nhiên, thành công việc chuyển gen vào ngô thông qua 31 4.2.1 Thời gian sinh trưởng dòng Kết theo dõi thời gian sinh trƣởng dòng ngơ chuyển gen đƣợc trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Thời gian sinh trƣởng dòng ngơ chuyển gen dòng khơng chuyển gen tƣơng ứng vụ Xuân 2017 Thời gian sinh trƣởng tính Chênh lệch TGST từ gieo (ngày) TT Tên dòng TP-PR (ngày) (ngày) Tung phấn Phun râu C436-modiCspB 61 63 117 C436 62 64 119 V152-modiCspB 68 68 125 V152 68 68 127 Trung bình 64,75 65,75 122 Ghi chú: TP-PR: tung phấn – phun râu; TGST: Thời gian sinh trưởng Kết cho thấy có thời gian sinh trƣởng từ 117-127 ngày, dòng C436 chuyển gen modiCspB (C436-modiCspB) có thời gian sinh trƣởng trung bình ngắn (117 ngày), dòng có thời gian sinh trƣởng dài dòng V152 (127 ngày) Thời gian từ gieo đến tung phấn phun râu dòng V152-modiCspBvà V152 68 ngày Dòng C436-modiCspB có thời gian từ gieo đến tung phấn 61 ngày thời gian từ gieo đến phun râu 62 ngày Dòng C436 có thời gian từ gieo đến tung phấn 62 ngày thời gian từ gieo đến phun râu 64 ngày Việc theo dõi thời gian tung phấn, phun râu quan trọng, dòng có khoảng cách chênh lệch tung phấn-phun râu nhỏ có nhiều lƣợng hạt phấn chất lƣợng tốt tham gia vào trình thụ phấn, thụ tinh dẫn đến khả kết hạt cao Chênh lệch thời gian tung phấn, phun râu dòng ngơ cách từ 0-2 ngày Nhìn chung, qua kết theo dõi thời gian sinh trƣởng cho thấy dòng ngơ chuyển gen khơng có chênh lệch lớn thời điểm tung phấn, phun râu Đối với dòng V152 chuyển gen dòng V152 thƣờng có thời gian tung phấn phun râu trùng Dòng ngơ C436 chuyển gen 32 dòng thƣờng C436 có thời gian chênh lệch tung phấn phun ngày Tuy nhiên, chênh lệch tung phấn phun râu nằm khoảng cho phép để trình thụ phấn đạt hiệu 4.2.2 Một số đặc điểm hình thái Kết theo số đặc điểm hình thái dòng ngơ chuyển gen đƣợc trình bày bảng 4.6 bảng 4.7 dƣới đây: Bảng 4.6 Chỉ tiêu hƣớng lá, tai lá, màu sắc cờ râu dòng ngơ chuyển gen khơng chuyển gen vụ Xuân 2017 TT Tên dòng Màu sắc cờ Màu sắc râu Số Dạng hạt C436-modiCspB Vàng nhạt Trắng 17-18 Đá C436 Vàng nhạt Trắng 17-18 Đá V152-modiCspB Tím nhạt Hồng nhạt 16-17 Răng ngựa V152 Tím nhạt Hồng nhạt 16-17 Răng ngựa Về màu sắc cờ, râu: Ở ngơ, tính trạng hình thái nhƣ màu sắc cờ, râu đặc trƣng cho dòng, tính trạng hầu nhƣ khơng thay đổi dƣới điều kiện mơi trƣờng Đối với dòng chuyển gen tiêu khơng thay đổi so với dòng Dòng C436-modiCspB C436 có màu cờ vàng nhạt, râu màu trắng, dòng V152-modiCspB V152 có cờ màu tím nhạt râu màu hồng nhạt Về số lá: Đây đặc điểm tƣơng đối ổn định nguồn, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ nhƣ biện pháp canh tác Qua bảng 4.6 cho thấy: Dòng C436 có số thật 17-18 lá, dòng V152 dao động 16-17 Về dạng hạt: Đây tiêu đặc trƣng cho nguồn dòng Dòng C436 chuyển gen khơng chuyển gen có dạng hạt đá; Dòng V152 chuyển gen dòng khơng chuyển gen có dạng hạt 1/3 bắp ngựa 33 Bảng 4.7 Một số đặc điểm hình thái dòng Vụ Xuân 2017 Chiều cao TT Dòng Chiều cao (cm) CV % Chiều cao đóng bắp Chiều cao đóng CV% bắp (cm) Dài cờ Số nhánh cờ Chiều dài CV% Sô nhánh CV% C436modiCspB 163,6 5,6 79,8 6,1 32.2 8,1 11,5 7,8 C436 165,2 4,3 77,8 7,2 31,9 6,7 11,1 7,3 V152modiCspB 143,7 7,2 61 5,8 36,7 7,9 15,7 7,9 V152 148,7 61,4 37,8 15,9 6,4 Trung bình 155,3 69,9 34,6 13,5 Về chiều cao cây: Qua bảng 4.7 cho thấy nguồn dòng, chiều cao chiều cao đóng bắp dòng chuyển gen dòng khơng chuyển gen tƣơng ứng khơng có khác biệt Độ đồng dòng cao thể số CV%