Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (cymbidium SP )

Về mặt khoa học, luận án trình bày một số vấn đề liên quan đến phôi sinh dưỡng và hạt nhân tạo như: sự phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, sự phát sinh m

1

MỞ ĐẦU

Việt nam là đất nước thích hợp cho việc sinh trưởng của các loài lan nhiệt đới, cho hoa đa dạng Phần lớn các loại lan đều có trong danh sách của Hiệp hội Thương mại Quốc tế về Các loài Quý hiếm (Convention on International Trade of

Endangered Species - CITEs), trong đó có Cymbidium, loại địa lan cho hoa bền và

đẹp, có giá trị thương mại cao Tuy nhiên, nhiều loài lan đang có xu hướng tuyệt chủng do tốc độ khai thác cũng như nhu cầu tiêu thụ quá cao

Trong nhân giống các loài địa lan lại có một vấn đề gặp phải là hạt lan rất bé, phôi chưa phân hoá và không có phôi nhũ cũng như các enzyme để cung cấp, chuyển hoá chất dinh dưỡng cho hạt phát triển nên rất khó nảy mầm trong tự nhiên Ngoài ra, nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu địa lan hiện nay rất cao và nhu cầu trồng địa lan ngày càng gia tăng Vì vậy, vấn đề nhân giống và bảo tồn địa lan là cấp thiết

Nhân giống địa lan thường được thực hiện bằng con đường nuôi cấy mô thực vật với quá trình nhân giống cần liên tục và định kỳ vô mẫu lại ban đầu đã làm tăng chi phí cũng như hiệu quả đầu tư Sản xuất hạt nhân tạo với mầm hạt là phôi sinh dưỡng đã khắc phục được vấn đề này trong việc chủ động sản xuất hạt giống từ phôi sinh dưỡng và góp phần mở ra triển vọng mới trong công nghệ sinh học, nghiên cứu tế bào học thực vật với nhiều công trình trên các đối tượng thực vật như: nho, mía, lan hồ điệp Nghiên cứu hình thành và phát triển cây con từ hạt nhân tạo, bảo quản hạt nhân tạo địa lan là mục đích chính trong công tác nhân giống và bảo tồn chất lượng giống địa lan

Đề tài “Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (Cymbidium sp.)” được

thực hiện với mục tiêu:

1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây địa lan để tạo giống sạch bệnh và làm nguyên liệu cho các thí nghiệm hình thành phôi sinh dưỡng

2 Nghiên cứu phương pháp hình thành phôi sinh dưỡng của cây địa lan

3 Nghiên cứu phương pháp nhân phôi sinh dưỡng của cây địa lan

4 Nghiên cứu nguyên liệu phôi và loại vỏ bọc thích hợp để tạo hạt nhân tạo địa lan

2

5 Nghiên cứu khả năng sống sót và nảy mầm của hạt nhân tạo địa lan trong điều

kiện in vitro và ex vitro

6 Nghiên cứu các biện pháp bảo quản thích hợp đối với hạt nhân tạo địa lan

7 Nghiên cứu khả năng sống sót và nảy mầm của hạt nhân tạo địa lan trong điều

kiện in vitro và ex vitro sau khi hạt được bảo quản

Về mặt khoa học, luận án trình bày một số vấn đề liên quan đến phôi sinh dưỡng và hạt nhân tạo như: sự phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, sự phát sinh mô sẹo, sự hình thành phôi sinh dưỡng và PLB ở địa lan, các yếu tố trong hình thành và nhân phôi cũng như việc tạo và bảo quản hạt nhân tạo từ phôi địa lan mà lần đầu tiên được nghiên cứu một cách hệ thống

Về mặt thực tiễn, việc tạo và bảo quản hạt nhân tạo đưa ra hướng sản xuất mới: sản xuất chủ động hạt giống từ phôi sinh dưỡng với tiềm năng hạt giống mang tính đồng nhất và có thể tạo tiền đề ứng dụng trong sản xuất giống đồng loạt, góp phần trong công tác sản xuất giống và bảo tồn nguồn gene

Những điểm mới của luận án:

1 Nghiên cứu sự hình thành phôi sinh dưỡng địa lan từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng và từ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

2 Nghiên cứu sự hình thành PLB từ phôi sinh dưỡng với các biến đổi hình thái học

và sử dụng phôi sinh dưỡng làm vật liệu trong việc tạo hạt nhân tạo địa lan

3 Nghiên cứu một cách hệ thống sự hình thành và nuôi trồng hạt nhân tạo địa lan

Sự hình thành phôi sinh dưỡng, đặc biệt là sự hình thành phôi sinh dưỡng họ Lan (Orchidaceae) với các giai đoạn phát triển của phôi lan, rất được các nhà sinh học thực vật trên thế giới hết sức quan tâm và trong luận án này, việc nghiên cứu và chứng minh sự hình thành phôi sinh dưỡng và PLB phát triển từ phôi sinh dưỡng địa lan đã được thực hiện dưới các khía cạnh phát sinh hình thái nhằm ứng dụng có hiệu quả trong sự vi nhân giống thực vật Điều này lại càng có giá trị đối với địa lan, giống cây quý nhưng có lối thụ phấn nhờ sâu bọ và khó nhân giống

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐỊA LAN (CYMBIDIUM)

1.1.1 Vị trí phân loại

Giới: Plantae, Ngành: Angiospermatophyta, lớp: Monocotyledoneae, bộ:

Orchidales, họ: Orchidaceae, chi: Cymbidium, loài: Cymbidium spp

Lan (Orchidaceae) là họ lớn nhất trong các cây một lá mầm với 800 chi và

35.000 loài trong đó chi Cymbidium có khoảng 60 loài Đây cũng được xem là họ

phát triển nhất trong khả năng sống sót Hiện nay, có khoảng 150.000 loài lan lai có thể sản xuất và đăng ký Các loài lan trong hệ thống này phân bố rất rộng, vì vậy, hình thái và cấu tạo cũng hết sức phức tạp và đa dạng [46], [99], [122], [216]

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Với những điểm nổi bật cả về giá trị khoa học lẫn giá trị nghệ thuật, địa lan

(Cymbidium) được mệnh danh là nữ hoàng của các loại lan Đây là một trong những

loài lan được nuôi trồng sớm nhất (cách đây khoảng 2500 - 3000 năm ở Trung Quốc) với dáng vẻ giản dị nhưng thanh nhã của cây và mùi hương dịu dàng của hoa [36] Đặc biệt, năm 1994, De Clercq đã đưa ra một khám phá thú vị rằng hoạt tính mannos–lectins đặc hiệu có trong địa lan và một số loài lan khác có khả năng ngăn chặn một cách có chọn lọc đối với virus HIV [54]

Chi Cymbidium có nguồn gốc Đông Nam Á và Nam Á, phân bố từ dãy

Hymalaya đến Nam Trung Quốc, các nước Đông Dương, Thái Lan, Ấn Độ, Nhật, Úc… Ở Việt Nam, địa lan được trồng nhiều ở vùng Tây nguyên và Sa Pa Đà Lạt là

nơi lý tưởng để trồng loại lan này, cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước một

lượng lớn lan cắt cành và lan chậu Tuy nhiên, ở nước ta, nghề trồng lan trong đó có

địa lan vẫn chưa được xem là một ngành kinh tế quan trọng như một số nước Âu,

Mỹ, Thái Lan, Úc [3]

1.1.3 Đặc điểm hình thái – đặc trưng của lan

Cymbidium (C.) thuộc nhóm lan đa thân, là loài cây đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo bụi nhỏ, có thể sinh trưởng bì sinh, trên đá hay trong đất C macrorhizon, một loại lan hoại sinh, sinh sống hoàn toàn dưới bề mặt đất, trừ khi nhú phát hoa C

4

ensifolium, C goeringii, C sinense thường được trồng rộng rãi Các loài lan lai

thường hình thành từ các loài này với những giống cho hoa đẹp, màu sắc phong phú [3]

Thân ngầm của lan (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan lại với nhau Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành gọi là giả hành

Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thỏng Chiều dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu nở hoa Thoạt

nhìn, hoa Cymbidium có năm cánh gần giống nhau nhưng thực ra chỉ có hai cánh

hoa ở bên trong, còn lại là ba lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ ba chuyên hóa thành cánh môi, có màu sắc rực rỡ hơn [2], [15]

Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị và nhụy cùng gắn chung trên một trụ

nhị-nhụy hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trên cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà dễ mở rời Hộc chứa phấn khối của trục hợp nhụy cách với núm nhụy bởi một cái gờ nổi

lên Cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ

Về tế bào học, số nhiễm sắc thể lưỡng bội của các loài Cymbidium khoảng

40 Ngoại trừ một vài loài tam bội hay tứ bội như C insigne 'Bieri' (2n = 60), C floribundum 'Geshohen' (2n = 80) hay C floribundum 'Yoshina' (2n = 60) [254] Là

một loại lan thích hợp với khí hậu vùng núi cao, vì vậy, các yếu tố sinh thái thường

phù hợp với Cymbidium là: nhiệt độ từ 7 - 27οC, tối thích ở 13 - 24οC Ở những vùng có địa hình thấp, nhiệt độ cao hơn, một vài giống cho hoa không đều đặn hay chỉ phát triển thân, lá Lượng ánh sáng khoảng 50 - 70% lượng ánh sáng trực tiếp

5

với độ chiếu sáng khoảng 20000 lux Độ ẩm khoảng 50 - 70 % độ ẩm tương đối của

không khí và 70 - 80% độ ẩm của giá thể [3], [94], [138] Cymbidium sinh trưởng

thích hợp trên các giá thể có tính acid, thông thoáng và giữ được độ ẩm cao như dớn, xơ dừa [240]

1.1.4 Phôi hữu tính ở địa lan

Không giống với phần lớn những thực vật khác, noãn của nhiều loại lan thường không phát triển cho tới khi sự thụ phấn thành công xảy ra Điều này gây nên sự phát triển của mô giá noãn và hình thành noãn [259] Kết quả là sự thụ tinh

bị trì hoãn trong vài tháng cho đến khi noãn được phát triển đầy đủ Vì vậy, lan là

một hệ thống lý tưởng cho việc nghiên cứu noãn và phát triển phôi Cymbidium là

đối tượng đại diện cho việc nghiên cứu về phôi họ Lan [91], [259]

Phát sinh phôi là quá trình tương đối ngắn so với thời gian hình thành quả, bắt đầu ở khoảng giữa thời kỳ thụ phấn và thời kỳ nứt ra của noãn và kéo dài trung bình trong hai tuần Phôi lan và quá trình phát sinh phôi ở các loài lan là giống nhau Hạt lan chứa vỏ bao quanh một phôi rất nhỏ (tiền phôi) gồm 80 – vài trăm tế bào hầu như đồng bộ trong giai đoạn hình cầu với tổ chức tế bào không xác định của mô phôi, không có nội nhũ và phôi chỉ được bao bọc bởi một lớp màng Phôi có kích thước khoảng 0,25 - 1,20 x 0,09 - 0,27 mm và chưa phân hoá, phần lớn không

có lá mầm, chồi mầm, rễ mầm (ngoại trừ Sobralia macrantha và Bletilla hyaqmthina có lá mầm sơ đẳng), chưa có sự thay đổi về kích thước tế bào và sự sắp

xếp các tế bào này, không có các enzyme để xúc tác các phản ứng trao đổi chất nhằm cung cấp năng lượng cho phôi (mặc dù bản thân phôi cũng tích lũy tinh bột, lipid và protein) [13], [16], [38], [63], [144], [149], [259] Ở thời điểm phân tán hạt,

Hình 1.1 Địa lan Cymbidium sinense [270]

A Cây trưởng thành mang giả hành, lá và hoa

B Cây con từ một giả hành

6

phôi chưa có mô phân sinh cũng như lá mầm Mặc dù không có sự biệt hóa hiển nhiên nào trong túi phôi nhưng lớp cutin bao bọc phôi có thể có ích cho sự biệt hóa tiền bì (protoderm) Tiền bì là mô đầu tiên được biệt hóa trong phôi hợp tử và sẽ hình thành biểu bì khi hạt nảy mầm Cutin là chất được tổng hợp trong tế bào để

hình thành biểu bì sau này Ở C sinense, lớp tiền bì trở nên xác định sau khi các sự

phân chia song song dừng lại trên bề mặt tế bào của túi phôi Sự hiện diện của cutin trong thành tế bào của tiền bì phản ánh tính chất vốn có của lớp biểu bì đang phát triển tuy cutin không có vai trò trực tiếp trong sự phát triển phôi Phôi lan có lớp vỏ mỏng và không có nội nhũ ở hạt Vì vậy, sự hiện diện của lớp cutin trong thành của túi phôi để bảo vệ tránh sự khô sớm khi phôi chưa trưởng thành [38], [149], [259]

Quá trình hình thành phôi từ hợp tử có thể tóm tắt như sau: lần phân chia

xiên đầu tiên từ hợp tử của Cymbidium hình thành tạo 2 tế bào rồi hàng loạt các lần

phân chia tiếp theo tạo phôi cầu [91], [259]

Sự khác biệt về hình thái giữa phôi của các loài họ Lan với họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi cầu Ở các thực vật có hoa khác, tất cả các tế bào của phôi cầu đều thuộc dạng mô phân sinh Riêng phôi lan, chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia, còn các tế bào khác sẽ không phân chia hoặc tăng kích thước Vì vậy, phôi lan có hai vùng phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn [130] Kích thước tế bào ở vùng tế bào nhỏ phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của phôi lan Vùng tế bào này có thể chiếm hơn 1/3 thể tích phôi ở hạt trưởng thành, còn lại là nhu mô với kích thước lớn, chứa tế bào chất đậm đặc [3], [30], [63] Phôi lan hiển thị 3 loại mô: mô biểu

bì, mô phân sinh và nhu mô, sự biệt hóa của các yếu tố mô mạch thì vắng mặt [20].

Có rất ít tinh bột được tích lũy ở phôi trưởng thành Các tế bào dây treo thì không

có các sản phẩm dự trữ và không được cutin bao phủ [38], [259]

Như vậy, phôi lan trong hạt hợp tử chỉ ở dạng hình cầu Phôi được bảo vệ bởi tầng đơn của lớp vỏ hạt và lớp vỏ hạt cũng không có các chất dự trữ Phần lớn các loài lan đều có phôi đơn giản, không biệt hóa với hạt nhỏ, nghèo chất dự trữ

Mặc dù vậy, phôi lan vẫn có thể nảy mầm in vitro qua giai đoạn trung gian là hình

Cũng như sự phát triển của hạt lan, hạt địa lan thường trải qua các giai đoạn

từ phôi cầu sang dạng protocorm Protocorm tương ứng với một giai đoạn chuyển tiếp mạnh mẽ của quá trình phát triển phôi [3], [40], [68] Melchior Treub là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ này (1890) để chỉ trạng thái sớm trong sự nảy mầm của cây thạch tùng [20], [35], [40], [106] Protocorm là giai đoạn phát triển tiếp tục của phôi khi hạt nảy mầm lúc mô phân sinh của phôi hình thành chồi đỉnh [68], [246]

Sau khi hút nước, hạt trương phồng và các tế bào của phôi hình cầu bắt đầu phân chia và làm nứt lớp vỏ hạt Lúc này, phôi có màu trắng chưa biệt hóa với những tế bào hình tròn, đồng bộ về kích thước, chưa có dấu hiệu của lá mầm, rễ sơ khởi cũng như chồi mầm Sau đó, phôi chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp với sự tăng kích thước tế bào đáy Trong lớp tế bào bề mặt của phôi, các lông dạng rễ bắt đầu phát triển và chẳng bao lâu mô phân sinh đỉnh chồi xuất hiện Các tế bào của

mô phân sinh đỉnh nhỏ hơn nhiều so với các tế bào nguồn gốc của phôi Sau đó, mô phân sinh đỉnh lún vào trong thành bộ phận bên trong của protocorm và dần biến mất khỏi bề mặt Cấu trúc lá hình phễu xuất hiện để tạo lá sơ khởi và từ nơi này sẽ tạo các lá tiếp theo Song song với những thay đổi hình thái này thì một chồi mới hình thành cùng với khí khổng Phần đáy của protocorm bắt đầu dần dần kéo dài và được phủ bởi các lông trong mờ với những tế bào bắt màu sẫm, nơi dự trữ và hấp thu chất dinh dưỡng cho cây con sau này Giai đoạn protocorm là giai đoạn phôi nảy mầm cho đến khi hình thành cây con phát triển đỉnh chồi nhưng chưa có rễ (trừ

Cypripedium, protocorm tạo rễ trước) [3], [13], [14], [192] Protocorm thường màu

xanh, tròn và đối xứng tỏa tròn sau đó chuyển sang dạng hình nón Sự hình thành protocorm được xem là sự phát triển đặc trưng của họ Lan và hình dạng của protocorm thì đa dạng: tròn, bầu dục, đĩa kéo dài, có nhánh, hình cầu hay dạng con quay [20] Các protocorm tiếp tục phát triển trong nhiều tuần, nhiều tháng hay hàng

8

năm phụ thuộc vào loài cho đến khi đủ lớn để hình thành chồi và rễ Sau đó là sự

xuất hiện các lá, thân Đối với Cymbidium, sau khi hạt nảy mầm sẽ hình thành

protocorm với chlolorophyll để quang hợp Chỉ khi protocorm dự trữ đủ chất dinh dưỡng thì mới hình thành chồi và rễ Phần cuối gốc cuống noãn của protocorm tạo nên mô xốp để có thể hỗ trợ chất dinh dưỡng với sự giúp đỡ của nấm cộng sinh Các loài lan không có rễ sơ cấp; các rễ bất định phát triển đầu tiên sau một vài tuần khi chồi xuất hiện Đến lúc này thì giai đoạn protocorm kết thúc và cây bước vào mùa sinh trưởng đầu tiên Cây con tiếp tục phát triển một đến hai rễ và một vài lá Các loài ở chi Orchis có thời gian nảy mầm nhanh nhất (28 ngày), lâu nhất là ở chi

Cypripedium (250 - 300 ngày) Thông thường là 50 - 90 ngày Vài chi lan rất khó nảy mầm và phát triển thành cây như Epipactis, Cephalanthera và Neotia [19],

[20], [21], [63]

Hạt lan không có nội nhũ nên phần gốc và phần giữa của protocorm mang nhiều lông (xuất phát từ biểu bì) có nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng trong môi trường để phôi phát triển.Vì vậy, phần gốc này có vai trò tương tự như nội nhũ [2], [13], [20] Hạt thiếu nội nhũ nhưng cũng có vài chất dinh dưỡng dự trữ trong các tế bào phôi chủ yếu là protein và lipid, đường để có thể hỗ trợ ban đầu cho sự nảy mầm cho đến khi sự nhiễm nấm xảy ra [20], [144], [192] Vài loài lan phụ thuộc vào nguồn sucrose bên ngoài, vì vậy cần có sự cộng sinh bởi nấm hoặc nuôi cấy có

đường in vitro Hạt lan khởi đầu là dị dưỡng và về sau với sự phát triển các mô

quang hợp dần trở thành tự dưỡng nhưng đôi khi hạt lan cũng cần các acid amin và các chất dinh dưỡng khác từ bên ngoài thêm vào [192] Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên ở phôi lan có thể được xem là tử diệp và bao quanh cực chồi Mô mạch không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy, phôi lan không chứa vùng mô phân sinh rễ Trong khi đó, phôi ở các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực: cực chồi và cực rễ Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan và các loài thực vật có hoa khác [3], [21], [191]

Trong tự nhiên, hạt lan nảy mầm với tỷ lệ rất thấp (0,2 - 0,3%) và cần có sự cộng sinh của nấm (Mycorrhizal) nhằm cung cấp nước, muối khoáng, carbohydrate

9

và vitamin cho phôi [248] Đối với các loài lan đất, mối quan hệ giữa lan và nấm cộng sinh rất quan trọng trong suốt giai đoạn sớm của đời sống của lan khi mà protocorm sống ngầm dưới đất và không thể tự sản xuất bất kỳ chất dinh dưỡng nào Khi hạt nảy mầm, tầng biểu bì trở nên rõ hơn Các tế bào ở lỗ noãn và cuối dây treo của phôi thay đổi kích thước tế bào để hình thành protocorm Trong các giai đoạn sinh trưởng trước khi hình thành đỉnh chồi, sự phân chia tế bào xảy ra ở cuối hợp điểm của phôi trong khi ở cuối lỗ noãn, các tế bào mở rộng nhưng nhỏ hoặc không phân chia [243] Đầu giai đoạn nảy mầm của phôi, diệp lục tố xuất hiện trong các tế bào của protocorm ở các loài lan bì sinh Hàm lượng m.RNA cũng đặc biệt gia tăng ở cuối hợp điểm của phôi Các thay đổi trong việc sao chép gene liên quan đến sự nảy mầm mặc dù những thay đổi trong sao chép gene thì không liên quan đến sự nhiễm nấm cộng sinh [12], [19], [20], [21], [191], [197] Đối với

Cymbidium, protocorm thường trở nên xanh và có thể sản xuất một số chất dinh

dưỡng cần thiết để phát triển [20], [144] Đỉnh sinh trưởng của protocorm có cấu trúc chưa đầy đủ và thiếu các phần khởi đầu của lá trong một khoảng thời gian Các

tế bào bề mặt của protocorm duy trì tiềm năng của các tế bào phôi, từ đây sẽ phát khởi sự tạo thành nhiều đỉnh sinh trưởng bất định [3], [10], [16], [20]

Từ những điều trên cho thấy, phôi hữu tính địa lan khi ở giai đoạn hạt, có giai đoạn hình cầu, cấu tạo rất đơn giản và chỉ khi phôi được nảy mầm trong điều kiện thích hợp mới hình thành mô phân sinh, chồi, rễ… (giai đoạn protocorm)

1.2 VI NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN (CYMBIDIUM)

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã và đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài

lan Trong việc nhân giống in vitro Cymbidium, nhiều phương pháp đã sử dụng như

gieo hạt, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phương pháp lớp mỏng tế bào, phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng [22], [23], [34], [89], [90], [143], [161],

[170], [233] Phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng sẽ được trình bày ở mục 1.3 1.2.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt

Hạt lan rất bé, phôi chưa phân hoá, chưa có lá mầm lẫn phôi nhũ và có khoảng vài trăm tế bào Vì vậy, để hạt nảy mầm cần có sự cộng sinh với nấm (cung

10

cấp nguồn carbon) hoặc gieo hạt trong môi trường in vitro [171], [180] Sự phát triển của hạt Cymbidium bắt đầu với một phôi chưa trưởng thành, tiếp theo là giai

đoạn protocorm và sau cùng là cây con Các protocorm có thể được nhân lên từ các

bề mặt cắt để hình thành các protocorm mới Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây ra hoa mất khoảng hơn 4 năm [226] Tuy nhiên, trong nhân giống hữu tính, biến dị thường xảy ra nên sẽ không thuận lợi cho việc sản xuất hạt đồng nhất về di truyền [17], [171]

1.2.2 Vi nhân giống địa lan – Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy mô là kỹ thuật chủ yếu trong nhân giống địa lan Ngoài việc nuôi cấy đỉnh chồi, lá, đầu rễ, phát hoa trong vi nhân giống địa lan thì phương pháp hiệu quả hơn cả là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của các chồi lan

Mô phân sinh: Đặc tính hình thái quan trọng của các tế bào mô phân sinh là: kích

thước nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, giàu tế bào chất (chỉ có những không bào nhỏ), nhân to và hạch nhân rõ Lúc đầu, các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh không khác với các tế bào đã sinh ra chúng; sau đó, các tế bào dẫn xuất này phân hóa dần dần

để thành mô nền, mô bì hay mô mạch, trong khi mô phân sinh tồn tại mãi ở trạng thái phôi [9]

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cymbidium: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo các đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh [160] Khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như một số giống cây khác là hình thành cấu trúc protocorm để sau

đó có thể biệt hóa thành cây Nhân các protocorm sẽ tạo thành các protocorm mới

gọi là protocorm-like body [161], [255] Không như trong nuôi cấy mô sẹo in vitro

của những loài thực vật khác, việc thiết lập gene của protocorm được xác định ngay

từ protocorm hình thành ban đầu [85], [159], [171]

Protocorm-like body (PLB) là thuật ngữ để chỉ những cấu trúc giống với

protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh

của chồi bất định ở các loài lan [106], [160] Đây là cấu trúc lần đầu tiên được đặt

ra bởi Morel [160] khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những cây sạch

11

virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là từ hạt

Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocorm-like body [3], [63], [160], [161]

Hình 1.2 Hệ thống nhân giống bằng hạt (trái) và nhân giống sinh dưỡng (phải) ở

địa lan [20]

Protocorm-like body (PLB)

Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về kiểu gene vừa cho

tỷ lệ nhân giống cao Mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, bộ phận đặc biệt của cây, được che chắn bởi những sơ khởi lá, không liên kết với hệ thống mạch, không có các cầu liên bào do đó thường không bị xâm nhiễm bởi virus vốn đi vào cây thông qua hệ thống này Hơn nữa, sự di chuyển của virus không theo kịp với tốc độ phân chia tế bào ở vùng này Bộ phận đỉnh sinh trưởng còn ở giai đoạn non nên quá trình phân chia và phân hóa diễn ra mạnh mẽ Vì vậy, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng trong công tác phục tráng và nhân nhanh giống cây trồng [159], [161], [171], [217]

Vùng đỉnh sinh trưởng Cymbidium với kích thước 1- 2 mm (gồm mô phân

sinh ngọn với 1 - 2 sơ khởi lá, được tách vô trùng từ chồi đỉnh hay chồi nách có chiều dài 3 - 10 cm) được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng bổ sung kinetin, myo-inositol và IAA Khoảng 4 tuần, trên bề mặt cắt của mẫu sẽ hình thành

Đỉnh chồi Đỉnh chồi

Chồi

Chồi

Chồi

Đỉnh chồi

Phôi hợp tử Phôi nang

Hạt

Đỉnh chồi Đỉnh chồi

Chồi

Chồi

Chồi

Đỉnh chồi

Đỉnh chồi Đỉnh chồi

Chồi

Chồi

Chồi

Đỉnh chồi

Đỉnh chồi Đỉnh chồi

Chồi

Chồi

Chồi

Đỉnh chồi

Đỉnh chồi Đỉnh chồi

Chồi

Chồi

Chồi

Đỉnh chồi

Rễ

12

protocorm mà sau đó có thể hình thành cây con hoặc được dùng để sản xuất các protocorm thứ cấp (PLB) Các PLB này chứa vài đỉnh sinh trưởng Vì vậy, vài cây con có thể hình thành từ việc cắt một PLB sau 3 tuần nuôi cấy Có thể nhân các PLB cũng như phát triển các PLB thành cây con mà không cần sử dụng CĐHSTTV Tuy nhiên, việc sử dụng CĐHSTTV là khả thi cho việc nhân PLB (môi trường nuôi cấy bổ sung 0,8 mg/l kinetin và 16 mg/l IAA tạo ra 45 PLB cho một bình nuôi cấy trong 6 tuần) [171]

1.2.3 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ chức thực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới

lá mầm, vùng đỉnh hay phôi) Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang (tTCL) Các lTCL chỉ chứa một loại mô như các tế bào biểu bì nhưng các tTCL lại bao gồm các tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ, tầng phát sinh gỗ, quanh mạch và lõi, nhu mô [6] Nuôi cấy các TCL có thể phân lập các tế bào, các tầng mô và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngoài gene, các điều kiện sinh trưởng có kiểm soát (ánh sáng, nhiệt độ, pH, CĐHSTTV, các chất bổ

sung vào môi trường…) dẫn tới sự cảm ứng in vitro phát sinh hình thái Khả năng

phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu tố như: sự nhận biết các dấu hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để đáp ứng và phản ứng với các dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay tổ chức) của TCL, các yếu tố stress, các trạng thái im lặng của gene Các tế bào trong TCL có thể phản biệt hóa dẫn đến việc thiết kế các kiểu hình Trong các TCL, con đường phát sinh hình thái của những mô chuyên trách xuất phát từ các tế bào, các mô có thể được điều khiển

và kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về sự thay đổi phân tử, sinh lý, sinh hóa

có thể xảy ra Các TCL cũng sử dụng trong tăng cường trao đổi các hợp chất thứ cấp, dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức chuyển gene, nuôi cấy thực vật tự dưỡng bằng bioreactor [6], [228]

Nhân giống các loài lan là một ví dụ về việc áp dụng phương pháp TCL

Laskshmanan [125] đã nuôi cấy các tTCL của lan đơn thân Aranda ‘Deborah’có

13

chiều dày 0,6 - 0,7 mm từ các chồi đỉnh dài 6 - 7 mm Sau 45 ngày nuôi cấy, các PLB hình thành với 13,6 PBL/mẫu TCL so với 2,75 PLB từ một đỉnh chồi Một tTCL có khả năng sản xuất được khoảng 80.000 cây con/năm so sánh với 11.000

cây con/năm khi sử dụng phương pháp nhân giống bằng chồi đỉnh Ở Phaleanopsis,

các mẫu TCL từ phiến lá non có diện tích 4 mm2 hay các phát hoa có thể được cảm ứng để tạo trực tiếp các protocorm theo rìa vết thương của cuống lá và trên bề mặt của TCL [230] Sử dụng CPPU (10 µM) với nồng độ sucrose thấp (1%) đã cho tỷ lệ

đạt được cao nhất của mẫu (95%) sinh trưởng chồi và rễ ở Rhynchostylis gigantean [31] Ở đối tượng Cymbidium Twilight Moon “Day Light”, sử dụng các lTCL của

biểu bì PLB đã hình thành các chồi, PLB thứ cấp hoặc mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (Hình 1.2), [229], [230]

Hình 1.3 Phát sinh hình thái và phát sinh phôi sinh dưỡng từ các PLB (lTCL và

tTCL) của Cymbidium Twilight Moon “Day Light” in vitro A Mô sẹo có khả năng

phát sinh phôi trong điều kiện tối; B Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong điều kiện có chiếu sáng; C Các PLB hình thành từ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi [230]

1.3 PHÔI SINH DƯỠNG THỰC VẬT

1.3.1 Khái niệm về phôi sinh dưỡng (somatic embryo)

Ngược với sự phát triển cơ quan chỉ tạo ra hoặc cực rễ hoặc cực chồi, phát sinh phôi sinh dưỡng giúp tạo ra cấu trúc hai cực: cực rễ lẫn cực chồi Phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ được định nghĩa là một cấu trúc mang tính lưỡng cực giống phôi hợp tử, phát triển từ tế bào sinh dưỡng và không có liên kết mạch với tế bào gốc ban đầu Sự phát sinh phôi sinh dưỡng xảy ra thông qua một số giai đoạn tương

tự như phôi hữu tính với các tế bào sinh dưỡng biệt hóa thành phôi và sự nảy mầm của phôi sinh dưỡng thì tương tự như của phôi hợp tử để hình thành cây con Phôi

14

sinh dưỡngcó thể biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn trung gian mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được

một số lượng phôi đáng kể, quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro đã được báo

cáo trên hơn 200 loài [189]

Giống như các tế bào của mô phân sinh hay hợp tử, các tế bào có khả năng sinh phôi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid nucleic cao, thể tích không bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân to và đậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ [62], [192], [232] Tuy nhiên, về mặt phát sinh hình thái, có

sự khác biệt, tế bào sinh phôi cho phôi còn tế bào mô phân sinh cho mô và cơ quan

[77] Hai sự kiện quan trọng xuất hiện trong sự hình thành in vitro các tế bào phôi,

đó là sự phân chia tế bào không cân xứng và sự kiểm soát việc mở rộng tế bào [55], [77] Sự phân chia không cân xứng tế bào gia tăng bởi CĐHSTTV và sau đó, hình thành tính hữu cực của tế bào, liên quan đến chênh lệch pH hay khu vực mang điện quanh tế bào [220] Khả năng kiểm soát việc mở rộng tế bào được kết hợp với các polysaccharide của thành tế bào và tương ứng với các enzyme thủy phân [55], [62]

Sự phân hóa cấu trúc trong sự phát sinh phôi sinh dưỡng bắt đầu ở giai đoạn hình cầu với sự xuất hiện của tiền bì (protoderm), lớp ngoài thật sự của phôi bởi sự phân chia thẳng góc Tiền bì có vai trò tạo hình dạng phôi do hoạt động như một tác nhân lý học đối với các tế bào bên trong, có khả năng điều hòa sự phân chia và biệt hóa tế bào trong phôi Sự hình thành mô phân sinh ngọn thường bắt đầu vào cuối giai đoạn phôi hình cầu và cấu trúc của mô phân sinh ngọn có thể thấy rõ ở giai đoạn tử diệp [120]

1.3.2 Các cơ sở của phát sinh phôi sinh dưỡng

Có ba giai đoạn phát triển trong phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro: cảm ứng,

phát triển và trưởng thành

15

Con đường phát sinh phôi xảy ra ngay sau nuôi cấy khởi đầu Các yêu cầu trong phát sinh phôi sinh dưỡng và cả trong phôi hợp tử: Các tế bào chuyên trách, một môi trường thích hợp hay một sự kích thích Trong phát sinh phôi sinh dưỡng trực tiếp, phôi phát triển từ các tế bào đơn, chẳng hạn từ trụ hạ diệp, cuống lá mà không cần sự hình thành mô sẹo Trong phát sinh phôi sinh dưỡng gián tiếp, sự hình thành mô sẹo trong đó có các tế bào tiềm năng (competent cell), hoạt động theo con đường tạo phôi, hình thành các tế bào tiền phôi (proembryogenic cell) rồi đến giai đoạn phôi hình cầu, giai đoạn phôi hình trái tim, phôi hình cá đuối, giai đoạn lá

mầm ở cây hai lá mầm Ở cà rốt (Daucus carota), cả hai dạng phát sinh này đều

xảy ra [83], [132], [177]

Trong nuôi cấy khởi đầu của phát sinh phôi sinh dưỡng gián tiếp, đã hình thành mô sẹo từ hoạt động phân chia tế bào cao với sự “tái chương trình” (reprogramming) dẫn đến một vài tế bào trong đó có tiềm năng phát sinh phôi sinh dưỡng [171]

1.3.3 Các khía cạnh di truyền – tổ chức DNA

Quá trình sinh phôi sinh dưỡng thật sự là một chương trình biểu hiện gene Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò trung tâm trong việc khởi động dòng thông tin tế bào Có khoảng 30.000 gene được hiển thị ở phôi và cây con [249], [171] và khoảng 3.500 gene được trang bị cho sự phát triển phôi

Khoảng 40 gene ảnh hưởng đến phôi Arabidopsis thaliana [71], [249], [251] Các

yếu tố di truyền cũng đóng vai trò trung tâm trong cảm ứng phôi sinh dưỡng Sử dụng sinh học phân tử với kỹ thuật RAPD, trên cơ sở trình tự các nucleotid đã hình thành protein leucine-rich repeat receptor-like kinase (SERK) Sử dụng cấu trúc bao gồm promoter SERK và gene phát sáng luciferase cho thấy sự hiển thị của SERK xảy ra chỉ đến giai đoạn hình cầu của sự phát triển phôi SERK mRNA cũng được tìm thấy ở phôi hợp tử đến giai đoạn hình cầu nhưng không có ở các hoa không thụ phấn hay những mô sinh dưỡng khác Rõ ràng, SERK là hoàn toàn chuyên trách trong những giai đoạn sớm của phôi sinh dưỡng và phôi hợp tử [206] SERK được

có 5 phần tử SoSERK1 có 72% giống hệt AtSERK1 Vài phần tử của họ SoSERK

có tỷ lệ tương đồng với những cây một lá mầm khác Ở cây bắp (Zea mays), có 2

gene SERK đã được mô tả (ZmSERK1 và ZmSERK2) Những gene sao chép này

có khoảng 80% giống hệt trình tự nucleotide và có các cấu intron/exon tương tự như trình tự của các gene SERK Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hoá cho enzyme SERK1 Sự hiển thị của SERK2 cũng xảy ra trong tất cả các mô đã được điều tra.Trong nuôi cấy mô sẹo cây mía, các SoSERK cũng được hiển thị [171] Nolan và cộng sự [178] sử dụng hệ thống nuôi cấy cây

Medicago truncatula cho thấy gene SERK1 (MtSERK1) tiến hóa từ AtSERK1 (có

đến 92% là giống nhau) được đặc trưng và các kết quả đề nghị rằng gene này lẽ ra

đã có vai trò rộng hơn trong phát sinh hình thái và không chỉ trong phát sinh phôi

sinh dưỡng Ở các loài thực vật khác, những gene SERK tương đồng cũng được xác

định, thậm chí còn được biểu hiện mạnh hơn, cho thấy vai trò của các gene này trong việc điều hoà sự phát sinh phôi

Nghiên cứu 2 dòng của Medicago truncatula, một dòng khó cho phôi và một

dòng cho tiềm năng phôi cao Hơn 2.000 protein được phát hiện trong đó có 54 protein được thay đổi có ý nghĩa trong biểu thị suốt 8 tuần nuôi cấy với sự phát triển phôi của dòng mang phôi Hơn 60% trong đó có sự khác nhau giữa 2 dòng này trong mẫu của việc hiển thị gene [96] Điều này cho thấy vai trò của gene trong việc hình thành phôi

Cái gì gây kích thích cảm ứng chương trình phát sinh phôi trong các tế bào tiềm năng? Có thể nói gì về bản chất của kích thích đó đã cảm ứng các tế bào tiềm năng để sản xuất phôi? Sự xáo động phân lập của mẫu từ cây mẹ: Auxin (hay chất điều hòa sinh trưởng khác) trong môi trường dinh dưỡng, hay cả hai? [171]

17

Thực nghiệm cho thấy, khả năng auxin như là một chất kích thích được công nhận Nghiên cứu 2 dòng cà rốt phôi và không phôi về nồng độ IAA cho thấy mẫu ở dòng có khả năng sinh phôi, suốt quá trình cảm ứng, IAA gia tăng nhưng mẫu ở dòng không có khả năng sinh phôi thì không xảy ra hiện tượng này Sự gia tăng CĐHSTTV cũng xảy ra song song với quá trình cảm ứng phát triển phôi trong phát sinh phôi hợp tử và các cấu trúc vô tính khác Các chương trình này có thể được khởi đầu trong điều kiện sáng hay tối [171]

1.3.4 Các yếu tố tác động trong phát sinh và nhân phôi sinh dưỡng

1.3.4.1 Vai trò sinh lý của sự hình thành và phát triển phôi

Sự hình thành và phát triển phôi sinh dưỡng phụ thuộc vào loài (như đã nêu

ở mục 1.3.2 và 1.3.3.) cũng như vào điều kiện nuôi cấy trong đó vai trò của CĐHSTTV có ý nghĩa quan trọng trong việc đạt đến những phản ứng phát sinh hình thái Con đường phát sinh hình thái có thể được định hướng qua phát sinh chồi hay phôi sinh dưỡng chỉ bởi thay đổi thành phần CĐHSTTV trong môi trường nuôi cấy [65], [102]

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong sự phát sinh phôi sinh dưỡng

Auxin

Auxin được tổng hợp ở ngọn thân, các mô phân sinh và lá non Auxin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng, phân hóa mô dẫn, phát triển chồi, phát sinh rễ [9] Auxin kích thích sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo, điều hòa

sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi kết hợp với cytokinin Auxin có vai trò khởi đầu sự phân chia tế bào để hình thành các mô phân sinh, các tổ chức cơ quan thực vật Auxin cảm ứng sự tiết ion hydro từ nguyên sinh chất ra ngoài làm pH vách tế bào giảm, làm lỏng lẻo các liên kết giữa hemicellulose, các hợp chất pectic và cellulose [4], [77] Sự di chuyển ngược dòng của ion kali từ ngoài vào trong làm tăng áp suất thẩm thấu tế bào dẫn đến sự di chuyển nước từ ngoài vào trong làm tăng kích thước tế bào Auxin cũng ảnh hưởng lên sự biến dưỡng RNA làm tăng

2,4-D được chứng minh là có tác dụng điều hoà sự phân chia của tế bào [33] 2,4-D làm gia tăng mức auxin của mẫu cấy, một trong những dấu hiệu quan trọng xác định số phận của tế bào nuôi cấy để trở thành phôi 2,4-D thường kết hợp với

BA trong cảm ứng các mô có khả năng phát sinh phôi Ngoài tác dụng kích thích tổng hợp ABA và ethylene, 2,4-D còn có tác dụng làm tăng mức auxin nội sinh (IAA) trong tế bào thực vật [134], [152] Cần có một lượng auxin nội sinh thích hợp của mẫu cấy có thể là yêu cầu chủ yếu trong quá trình phát sinh phôi Ngay cả ở những hệ thống mà không đòi hỏi phải có auxin để cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng thì vẫn dễ dàng nhận thấy tầm quan trọng của các auxin nội sinh Ví dụ, ABA chỉ có khả năng cảm ứng phát sinh phôi đối với những mẫu cấy cà rốt còn chồi đỉnh, là vùng tổng hợp auxin [177] Việc xử lý những stress khác nhau cũng có tác dụng đẩy mạnh sự cảm ứng tạo phôi của các tế bào đỉnh và nụ hoa [76], [95], [181]

Nhu cầu về loại và hàm lượng auxin cần cho sự tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm, hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy, khả năng tự tổng hợp auxin trong mẫu cấy, sự tương tác giữa auxin nội sinh và ngoại sinh, đặc tính của loại auxin cũng như sự liên hệ của auxin với các chất khác [9], [51] Đặc điểm tế bào sau khi được cảm ứng để phát sinh phôi là sự di chuyển của nhân tế bào về gần vách, sự phân chia nhân xảy ra và sự hình thành tế bào con bất đối xứng [93]

19

Auxin ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng sau đó, vì vậy, có vai trò trong sự hình thành các tế bào có khả

năng sinh phôi Trong nuôi cấy in vitro, khi xử lý auxin thì sự di chuyển hữu cực

của auxin có vai trò chìa khóa trong sự thay đổi hình thái phôi Sự thay đổi này xảy

ra khi phôi hình cầu chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp Tế bào thiết lập tính hữu cực đã bị mất trước đó bằng cách thay đổi hướng vi ống, vị trí mặt phẳng phân chia

và hướng kéo dài tế bào, tính hữu cực mới được tái lập [9], [93]

Vai trò của auxin trong cảm ứng mô sẹo lan như α-NAA hay 2,4-D cảm ứng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ các mô bên trong của PLB

Cymbidium Thanksgiving “Nativity” [23] hay từ lá của cây lan Trăng Phamabilis (L.) Bl [239], Paphiopedilum niveum [107], Vanda Miss Joaquim [108] cũng được

xác nhận

Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ và phôi là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin Cytokinin cần thiết cho giai đoạn khởi đầu của quá trình phân bào, làm tăng tốc độ phân chia tế bào và định hướng sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy Cytokinin giúp

tế bào gia tăng kích thước và sinh tổng hợp protein, là nhân tố chính kích thích quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi Cytokinin cùng với auxin thúc đẩy sự phân chia tế bào, điều hòa sự phát sinh hình thái, làm gia tăng số lượng tế bào trong phôi [77] Cytokinin có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy cùng với auxin để cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng Vài trường hợp, chỉ cần thêm cytokinin là đủ để hình

thành phôi sinh dưỡng [101]

Gibberellin và acid abscisic

Gibberellin (thường dùng GA3) làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích Auxin và gibberellin có vai trò thiết lập tính hữu cực ở tế bào do tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào Tuy nhiên, gibberellin làm giảm

sự tăng trưởng mô sẹo khi phối hợp auxin với cytokinin (Kartha, 1977 trong [77])

20

Ngược với auxin, ABA cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và mô nuôi cấy Ở nồng độ thấp (0,1 - 1 mg/l), ABA thúc đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân phôi thứ cấp, cản sự nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng [11]

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong sự phát triển của phôi sinh dưỡng

Sự giảm tỷ lệ auxin/cytokinin và sự di chuyển hữu cực của auxin là yếu tố cần thiết để thiết lập trục xác định giúp phôi hình cầu tiếp tục phát triển Trong nhiều hệ thống cảm ứng tiếp theo của quá trình phát triển phôi không cần điều kiện auxin [57] Điều này cho thấy tế bào có khả năng tự tổng hợp auxin Việc thiết lập tổng hợp auxin và quá trình vận chuyển có cực auxin là bước chìa khóa trong sự hình thành mô phân sinh của quá trình phát triển phôi Việc tách khỏi auxin khỏi môi trường nuôi cấy, xử lý với ABA, sucrose, bảo quản lạnh và nuôi cấy lỏng với

GA3 thường được sử dụng để ngăn cản sự hình thành phôi thứ cấp và làm phôi trưởng thành [72], [189]

Sự di chuyển hữu cực của auxin từ trên xuống theo một trục thẳng góc với bề mặt nuôi cấy cần cho sự hình thành hệ mạch và phát sinh cơ quan phôi [115] Sự quan trọng của việc vận chuyển hữu cực auxin (PAT) trong phát sinh hình thái phôi được chứng minh bởi các giai đoạn xử lý khác nhau trong phôi sinh dưỡng cà rốt với các chất ức chế PAT như 2,3,4-triiodobenzoic acid (TIBA) [44] TIBA ngăn cản khả năng phôi sinh dưỡng trải qua từ sự chuyển tiếp phát sinh hình thái đến các giai đoạn kế tiếp Xử lý trụ hạ diệp cà rốt trong đó phôi sinh dưỡng được cảm ứng trực tiếp 2,4-D, TIBA theo nhịp 24 giờ và acid 2,4,6-trichlorophenoxyacetic, một chất

ức chế PAT khác và cho thấy đã có hiện tượng ức chế sự phát triển các phôi sinh dưỡng nhưng không thường xuyên [235] Sự hình thành chênh lệch hữu cực auxin xuất hiện là cần thiết để thiết lập tính đối xứng của phôi trong suốt các bước khởi đầu của quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng, một điều kiện tất yếu cho sự phát triển

xa hơn của phôi [65]

Cytokinin có lẽ đóng vai trò quan trọng trong phân chia tế bào hơn là sự biệt hóa phôi [48], [81] Trong nuôi cấy mô, TDZ có thể làm gia tăng tổng hợp và tích

21

lũy các cytokinin nội sinh TDZ cũng ảnh hưởng đến nồng độ và làm chuyển vị IAA nội sinh [165], [235] TDZ là một cytokinin mạnh, có ảnh hưởng trong việc phát sinh hình thái như: tạo chồi, tạo mô sẹo, sự khởi đầu của phôi sinh dưỡng Cytokinin cũng rất hữu hiệu khi mọi xử lý cho phôi trưởng thành trở nên không hiệu quả [49], [150]

Ảnh hưởng của ABA trong quá trình phát triển phôi sinh dưỡng được ghi nhận

ở cây hạt trần Sự phát triển của phôi sinh dưỡng được kích thích bởi việc thêm ABA ngoại sinh [101] hay bổ sung arabinogalactan, một protein quan trọng trong

sự phát triển của phôi sinh dưỡng [119] Ở phôi hợp tử, ảnh hưởng cũng tương tự khi có sự gia tăng tự nhiên ABA nội sinh, việc thêm ABA vào môi trường nuôi cấy gây nên sự giảm nảy mầm sớm và gia tăng lượng phôi trưởng thành Tuy nhiên, xử

lý kéo dài có thể gây nên ảnh hưởng âm tính đối với quá trình nảy mầm của phôi trưởng thành [249]

1.3.4.2 Ảnh hưởng của các hợp chất hóa học và điều kiện môi trường lên quá trình phát sinh và phát triển phôi sinh dưỡng

Ảnh hưởng của các hợp chất hóa học chứa ni tơ

Nhân tố quan trọng nhất trong sự thu nhận phôi sinh dưỡng là auxin cũng như sự tác động tương hỗ giữa auxin với ni-tơ khử Các dạng ni-tơ hữu cơ và vô cơ dùng cho nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự tổng hợp protein, acid nucleic

và các chất khác cần thiết cho sự hình thành và trưởng thành của phôi

Nguồn ni-tơ vô cơ: như các dạng muối khoáng nitrat hay amoni…

Trong nuôi cấy các mẫu có nguồn gốc từ cuống lá cây cà rốt dại, sự phát triển của phôi chỉ xảy ra ở môi trường có ni-tơ dạng khử Nuôi cấy khởi đầu mô sẹo trên môi trường chứa KNO3 làm nguồn ni-tơ duy nhất đã không hình thành được phôi Khi bổ sung thêm một lượng nhỏ ni-tơ dạng amonium (0,27 g/l NH4Cl) vào môi trường có 5,5 g/l KNO3 đã thúc đẩy sự phát triển của phôi [82]

Amonium dùng trong môi trường nuôi cấy thường phối hợp với các acid hữu

cơ, đặc biệt là các hợp chất của acid malic và acid citric Phôi của lúa mì đã sinh trưởng tốt khi môi trường có chứa amonium malat, glutamine và saccharose ở nồng

22

độ thấp Nhưng nếu chỉ có amonium (NH4+) làm nguồn ni-tơ vô cơ sẽ gây ra hiện tượng acid hoá môi trường, vì vậy thường kết hợp với ni-tơ dạng nitrat (NO3-) Chẳng hạn, pH của môi trường chỉ chứa NH4Cl làm nguồn ni-tơ độc nhất đã giảm

từ 5,4 xuống 3,5- 4 sau 4 ngày nuôi cấy và có biểu hiện ức chế sự hình thành phôi [57]

Nguồn ni-tơ hữu cơ: thường sử dụng các polyamine, hỗn hợp các acid amin (casein

thủy phân) hay acid amin riêng lẻ (glutamine, proline)

Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích sự hình

thành phôi sinh dưỡng Những chất hữu cơ khác như nước dừa, casein thủy phân, mạch nha (chứa nhiều thành phần khoáng, các amino acid ) cũng được sử dụng và cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến sự cảm ứng tạo phôi ở một số loài thực vật Các

mô sẹo hình thành từ đây sau hai tuần nuôi trên môi trường MS có 2,4-D và 10% nước dừa được chuyển sang môi trường không chứa CĐHSTTV đã hình thành phôi Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò của ni-tơ, acid amin, amid, cũng như của kali, phosphate đến sự hình thành phôi [158], [233]

Peptone cũng như casein thủy phân là những loại protein amin quan trọng

trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Đã có ít nhất hai protein (14 và 33 KDal) xuất hiện được sinh tổng hợp và dự trữ trong suốt quá trình

phát triển hạt lan Dendrobium crumenaturz cũng như phát triển protocorm [243] Vì

vậy, các protein có vai trò quan trọng về dinh dưỡng trong suốt giai đoạn phôi phát

triển thành hạt Mặt khác, peptone cũng có thể làm mô sẹo tăng trưởng nhanh hơn

[34], [238]

Trong nuôi cấy in vitro các loài lan, casein hay trypton thường được sử dụng

để gia tăng tổng hợp mô sẹo hay nhân phôi [17] Huân và cộng sự [89] bổ sung 2 g/l

trypton để cảm ứng và gia tăng sinh khối mô sẹo của Cymbidium Twilight Moon

“Day Light” [89] hay bổ sung casein trong cảm ứng mô sẹo của Coelogyne cristata

[168]

Các acid amin khác cũng được dùng như glutamine

23

Glutamine là loại acid amin tự do phong phú nhất trong cơ thể, đóng vai trò

quan trọng trong nhiều quá trình hoạt động của thực vật như tham gia điều hòa trao đổi chất, trao đổi năng lượng, sự nhân lên của tế bào Glutamine góp phần quan trọng trong sự tổng hợp các hợp chất chứa ni-tơ ở thực vật (các chất xây dựng như: protein, enzyme, acid nucleic ), điều hòa các gene liên quan đến sự trao đổi chất, bảo vệ và phục hồi tế bào [48] Glutamine kích thích hình thành mô sẹo và gia tăng phôi sinh dưỡng, đóng vai trò như một chất điều hòa dinh dưỡng trong sự trưởng thành của phôi, là chìa khóa trong quá trình tổng hợp các acid amin khác cần thiết cho sự sinh trưởng của thực vật thông qua sự điều hòa của các enzyme như glutamate dehydrogenase, transaminase [153], [244] Vì vậy, trong nuôi cấy phát triển phôi sinh dưỡng, việc bổ sung glutamine có ảnh hưởng quan trọng Nồng độ glutamine thường dùng đến 8 mM [153] Glutamine và asparagin có tác dụng kích

thích phát triển phôi Datura và nhiều loài thực vật khác, nhưng glutamine có hiệu quả rõ rệt hơn [153] Glutamine kích thích sự phát sinh phôi ở đại mạch (Hordeum vulgare L.) [78] Khi nuôi cấy các đoạn phát hoa chưa trưởng thành của cây mía

(Saccharum sp.) trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA, 2,5 mg/l kinetin,

100 mg/l glutamine và 4% sucrose đã hình thành phôi sinh dưỡng trực tiếp mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo [56].Glutamine cũng được sử dụng phổ biến trong

việc nhân giống in vitro các loài lan [202]

Myo-inositol

Myo-inositol (meso-inositol, i-inositol) là chất duy nhất trong 9 đồng phân

của inositol có ý nghĩa sinh học quan trọng, được xem là phức hợp vitamin nhóm B

cần cho sinh trưởng của nấm men và nhiều tế bào động vật có vú Myo-inositol

không được xem là chất bổ sung nguồn carbohydrate, không có vai trò là nguồn năng lượng và không ảnh hưởng đến stress thẩm thấu Các gốc OH- của myo-

inositol phản ứng với các gốc acid hình thành các este như inositol phosphate hoạt động như tác nhân vận chuyển thứ cấp đến hoạt động sơ cấp của auxin trong thực

vật Acid phytic (inositol hexaphosphate) là một điển hình Việc bổ sung

myo-inositol vào môi trường nuôi cấy làm gia tăng sinh trưởng mô Trong vài loài, auxin

phosphate và các ion trong quá trình trao đổi chất của cây Trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, phytin được tiêu hóa bởi enzyme phosphatase gọi là phytase để giải phóng phosphate, các cation và inositol được dùng cho cây con Việc tích lũy phytin trong suốt giai đoạn sớm của sự phát triển hạt đóng vai trò không chỉ sau khi hạt nảy mầm mà còn trong suốt quá trình phát triển hạt.Vì vậy, myo-inositol là yếu

tố nhất thiết trong quá trình phát triển phôi [136], [137]

Đường (sucrose)

Đường đóng vai trò là nguồn năng lượng và cũng là tác nhân tạo mô sẹo Đường (sucrose) và auxin tác động lẫn nhau ở những nồng độ tối ưu [77] Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của phôi hợp tử chưa trưởng thành cây hướng dương

(Helianthus annus L.) cho thấy ở nồng độ sucrose 87 mM, mẫu có khuynh hướng

phát sinh hình thái cơ quan (organogenesis), trong khi đó, ở nồng độ sucrose 350

mM, mẫu có khuynh hướng phát sinh phôi sinh dưỡng [101] Ở mô sẹo cây mía

(Saccharum sp.), khả năng tái sinh sẽ không bị ảnh hưởng bằng cách giảm nồng độ

2,4-D và gia tăng hàm lượng sucrose, sinh khối mô sẹo gia tăng sau 3 tháng nuôi

cấy [76] Ngoài ra, các PLB cắt ngang của Phalaenopsis Richard Shaffer ‘Santa

Cruz’ hình thành mô sẹo trên môi trường Vacin Went Môi trường bổ sung 20% (v/v) nước dừa và 40 g/l sucrose là hữu hiệu trong hình thành mô sẹo mà không cần

sử dụng chất điều hòa sinh trưởng Các mô sẹo dễ dàng hình thành PLB sau khi chuyển sang môi trường không bổ sung sucrose [97] Như vậy, nồng độ đường đã

ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

25

Sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ các chồi non của lan

Chang Daeng (Rhynchostylis rubrum ) cũng được ghi nhận [227] Ảnh hưởng của

CĐHSTTV ở đây không đề cập Môi trường để tạo mô sẹo là môi trường Vacin Went bổ sung 20 g/l sucrose, 15% nước dừa và 2 g/l AC Như vậy, nước dừa,

sucrose và AC là các yếu tố góp phần làm gia tăng sự tạo mô sẹo của Rhynchostylis rubrum [227]

Ánh sáng

Phôi sinh dưỡng có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối Nhu cầu ánh sáng thay đổi tùy loài Việc cảm ứng tạo phôi ở cây họ Cà cần ánh sáng

nhưng cảm ứng phôi ở cây dương và Podophyllum thì hoàn toàn cần điều kiện tối

Ở cây vân sam Na-Uy thì việc tạo phôi sinh dưỡng chỉ có thể thực hiện được trong điều kiện tối hoàn toàn với sự hiện diện của ion amoni trong môi trường và việc loại

bỏ ion amoni khỏi môi trường là hoàn toàn cần thiết trước khi hình thành phôi ngoài sáng Ánh sáng đỏ thúc đẩy tạo phôi trên cây chà là trong khi ánh sáng xanh thì làm giảm khả năng đó Trong việc tạo phôi sinh dưỡng cây cà rốt thì ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh lục hoặc tối đều có hiệu quả tương tự như nhau, còn ánh sáng xanh, ánh sáng trắng thì lại ức chế sự cảm ứng tạo phôi [6] Ánh sáng đỏ là hữu hiệu trong

việc hình thành mô sẹo từ PLB của Cymbidium Twilight Moon “Day light” nhưng

sự hình thành PLB từ mô sẹo lại đạt được tốt nhất ở điều kiện 25% ánh sáng đỏ và 75% ánh sáng xanh [90]

pH pH trong tế bào thấp được đề nghị là có liên quan đến quá trình nới lỏng thành

tế bào cần thiết cho sự kéo dài tế bào trực tiếp trong quá trình phát triển phôi Các

26

giá trị của pH từ 4,8 - 5,5 là thích hợp hơn cả trong sự phát triển của protocorm lan

nuôi cấy in vitro [64]

Than hoạt tính (AC)

AC là một sản phẩm từ việc nung các vật chất chứa carbon như vỏ quả dừa,

vỏ sò, than ở nhiệt độ cao (600 - 900oC) AC gồm khoảng 120 tỷ mảnh nhỏ với các lỗ có kích thước từ 10 - 500 nm và có bề mặt riêng lớn (500 – 2.000 m2/g) Vì vậy, nó có khả năng hấp phụ các chất không tốt cho sự phát triển của mô thực vật

như phenol, sinh ra từ các mô cấy, 5-hydroxymethylfurfural (sinh ra từ việc

dehydrate sucrose trong quá trình hấp khử trùng) [253] AC hấp phụ CĐHSTTV (trong đó có cả ABA và ethylene), các ion khoáng và nới lỏng từ từ các chất này nên giúp mô cấy ổn định và phát triển AC còn làm tối môi trường nuôi cấy, tạo thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt và phát triển của rễ [59] Sự nảy mầm của hạt lan

Paphiopedilum và Phalaenopsis đạt hiệu quả khi có sự hỗ trợ của AC [16], [24]

Việc bổ sung AC cũng góp phần ổn định độ pH của môi trường nuôi cấy [191] AC cũng hấp phụ các vitamin, cytokinin và auxin, có khả năng làm thông khí trong môi trường nuôi cấy [13], [253], vì vậy, làm thay đổi tỷ lệ của các thành phần môi trường , ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây AC giảm hay ngăn chặn ánh sáng

trong nuôi cấy in vitro mà như đã biết ánh sáng làm gia tăng sự phân hủy IAA và IBA trong cả hai loại môi trường rắn và lỏng in vitro AC cũng kích thích ra rễ, kéo

dài chồi hay kích thích phát sinh phôi sinh dưỡng [257]

Ảnh hưởng kích thích của AC trong phát sinh phôi không chỉ là sự hấp phụ các hợp chất phenol hay ức chế các chất sinh ra từ việc phân giải đường (furfurol,

tác nhân làm giảm sinh trưởng của mô cấy in vitro) mà còn hấp phụ ABA và

ethylene, là các chất được sinh ra trong quá trình nuôi cấy [253] AC làm gia tăng phát sinh phôi sinh dưỡng dưa leo [139] hay phát sinh phôi trong nuôi cấy bao phấn

của Anemone và Nicotiana [103], [104], [105] Nhiều nghiên cứu cho thấy, việc bổ

sung AC làm gia tăng sự sinh trưởng và sự phát sinh hình thái của những loài thân

gỗ [257], lan [226]

27

Ảnh hưởng của AC lên sự phát sinh và tăng sinh mô sẹo, sự phát sinh phôi

và nhân phôi cũng được đề cập trên nhiều đối tượng như cỏ đuôi trâu Festuca rubra [264], ở lan Phalaenopsis gigantea, Rhynchostylis rubrum, Rhynchostylis retusa, Coelogyne cristata và Vanda coerlea [163], [168], [169], [227]

1.3.5 Phôi sinh dưỡng ở họ Lan

Phôi sinh dưỡng ở họ Lan cũng trải qua các giai đoạn phát triển như phôi hình thành từ hợp tử Nếu như ở thực vật Hai lá mầm, từ sự phân chia không cân xứng đầu tiên, sẽ tiến triển đến giai đoạn phôi cầu rồi phôi hình trái tim, hình cá đuối, giai đoạn lá mầm hoặc ở thực vật Một lá mầm từ giai đoạn phôi cầu, phôi hình thuẩn, giai đoạn tử diệp thì ở phôi sinh dưỡng họ Lan từ giai đoạn phôi cầu sẽ chuyển sang giai đoạn phôi chuyển tiếp, giai đoạn protocorm

Các protocorm cũng có thể được nhân lên để hình thành các protocorm thứ cấp gọi là protocorm-like body (PLB) [20], [161], [171] Các PLB cấu tạo từ nhiều trung tâm phân sinh mà có thể hình thành chồi và rễ [52] Tuy nhiên, các chồi và rễ của các cây tái sinh từ các PLB thì có thể cùng ở trên một trục hay không Vì vậy,

có hai trường phái bàn về PLB: một trường phái xem PLB là phôi sinh dưỡng [22], [23], [97], [39], [197], [223] và trường phái khác xem các PLB là cấu trúc được biệt hóa từ phôi sinh dưỡng [47], [52], [179], [233] Việc sử dụng thuật ngữ PLB xem như phôi sinh dưỡng được đặt cơ sở một cách rộng rãi trên chứng cứ xuất phát từ

việc tái sinh in vitro các loài lan Thực tế, việc sử dụng thuật ngữ PLB ban đầu chỉ

có ở lan [97] nhưng sau đó, thuật ngữ này đã được mở rộng cho những giống cây

khác như Anthurium [263], Lilium [172], Rosa [233] và Syngonium [47]

Ảnh hưởng của chất hữu cơ lên sự phát triển của PLB lan

Khi nuôi cấy các loài lan với các CĐHSTTV đã cho tỷ lệ thành công thấp Đây là một trong những lý do cho việc sử dụng các hợp chất hữu cơ không xác định như nước dừa [63], [261], peptone [64], trypton [89] bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Với các loài lan, các dịch chiết hữu cơ từ lâu đã được chú ý trong nuôi cấy

mô Tiềm năng của các dịch chiết như: chuối, dừa, cà chua với các nồng độ (10, 20,

28

30%) trong môi trường nuôi cấy (không bổ sung nguồn carbon và CĐHSTTV) là

đáng ghi nhận ở việc nhân lên PLB của Phalenopsis violacea cũng như phôi sinh dưỡng của Phalenopsis dưới các điều kiện in vitro PLB sinh trưởng trên môi

trường ½ MS bổ sung 10% dịch chiết chuối Tuy nhiên, với các nồng độ cao hơn, sẽ

ức chế quá trình này Điều này có thể do stress thẩm thấu Các chất hữu cơ (nước dừa, dịch chiết chuối, dứa ) cũng góp phần làm gia tăng sự sinh trưởng của phôi lan [63], [97], [186]

Các công trình nghiên cứu về mô sẹo và phôi sinh dưỡng ở lan

Begum và cộng sự [23] đã hình thành phôi sinh dưỡng từ mô sẹo của lan

Cymbidium x Thanksgiving “Nativity” Từ mô sẹo đã hình thành phôi với sự phân

chia không cân xứng đầu tiên tạo 2 tế bào rồi sang giai đoạn 3 tế bào, 8 tế bào và phôi hình cầu đa bào Mô sẹo hình thành từ các mô bên trong (inner tissue) của PLB, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D Mô sẹo được chuyển sang môi trường MS không CĐHSTTV, sẽ sản xuất các PLB sau

30 ngày và hình thành cây con sau 90 ngày nuôi cấy tiếp theo Từ nghiên cứu cho

thấy, nhân giống loài địa lan này có thể đạt được từ các mô bên trong của PLB qua

quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng bởi sự điều khiển các điều kiện nuôi cấy [23]

Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đạt được khi nuôi cấy các PLB cắt dọc

qua đỉnh của Dendrobium crumenatum Sw., có sự phối hợp giữa auxin và cytokinin

(0,1 mg/l α-NAA và 1 mg/l BA) [238] hoặc 0,1 mg/l α-NAA và 3 mg/l TDZ khi

nuôi cấy lá của Oncidium “Gower Ramsey” trên môi trường ½MS bổ sung 1 g/l

peptone trong 4 - 7 tuần Mô sẹo được nhân lên trên môi trường tương tự và có khối lượng tươi tăng 2 - 4 lần sau 1 tháng nuôi cấy Sự khởi đầu của sự phát sinh phôi sinh dưỡng và hình thành PLB từ mô sẹo đạt được khi chuyển mô sẹo sang môi trường tương tự nhưng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Mô sẹo hình thành phôi với tỷ lệ 93,8% và số phôi đạt được là 29,1 phôi/mô sẹo có kích thước 3 x 3 (mm) [37]

Từ các protocorm xuất phát từ hạt của Cypripedium formosanum đã hình

thành được mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trên môi trường ¼MS bổ sung 4,52

Sự hình thành phôi trực tiếp (từ nuôi cấy hạt lan để tạo protocorm) trên đối

tượng Phalaenopsis amabilis var formosa Shimadzu cũng được ghi nhận Các

protocorm được nuôi cấy trên môi trường ½MS bổ sung 3 mg/l TDZ đã đạt được số PLB là 13,5 PLB/protocorm Ngược lại, sự hình thành phôi từ các protocorm bị ức chế khi được cảm ứng với α-NAA ở các nồng độ (0,1; 1 mg/l) [42]

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng trong quá trình phát sinh phôi sinh

dưỡng cũng được thể hiện trên đối tượng Cymbidium Twilight Moon “Day Light”

Sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đạt được trên môi trường Vacin Went bổ sung 1ml/l vi lượng Nitch, 20 g/l sucrose, 0,1 mg/l α-NAA và 0,01 mg/l TDZ hoặc 0,01 mg/l 2,4-D và 0,01 mg/l TDZ và 2 g/l trypton Sau đó, nuôi cấy các

mô sẹo này trên môi trường tương tự nhưng không bổ sung CĐHSTTV sẽ hình thành các PLB với 90,7 PLB/ mẫu mô sẹo có khối lượng 40 mg [89]

Mô sẹo từ hạt của những quả lan Paphiopedilum alma gavaert 5 tháng tuổi

hình thành trên môi trường ½MS bổ sung 22,60 µM 2,4-D và 4,54 µM TDZ trong điều kiện nuôi cấy tối Khả năng nhân lên của mô sẹo không giảm sau 2 năm với khoảng cách cấy chuyền 2 tháng một lần Chuyển mô sẹo sang môi trường ½MS bổ sung 26,85 µM α-NAA, trung bình có 4,7 PLB/mô sẹo hình thành sau 120 ngày nuôi cấy [87]

Trên đối tượng cây vani (Vanilla planifolia), một loại lan dùng để sản xuất

hương vani, mô sẹo có khả năng phát sinh phôi hình thành khi cảm ứng các PLB (có được khi gieo hạt bổ sung 0,5 mg/l TDZ) trong môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IAA và 0,5 mg/l TDZ Tăng sinh mô sẹo và phát sinh phôi trong môi trường

MS bổ sung 0,5 mg/l IAA và 0,3 mg/l TDZ với việc cấy chuyền mỗi 21 ngày một lần Sau đó, phôi có thể biệt hóa thành PLB và bắt nguồn từ bề mặt của mô sẹo,

30

phát triển thành cây trên môi trường MS không bổ sung CĐHSTTV sau 6 tháng nuôi cấy [236]

Trên đối tượng lan Chang Daeng (Rhynchostylis rubrum), mô sẹo hình thành

từ các chồi non trên môi trường Vacin Went và New Dogashima (NDM) bổ sung 2% sucrose, 2 g/l AC và 15% nước dừa với tần số hình thành mô sẹo đạt 56% (trong điều kiện sáng và tối đều như nhau) Mô sẹo được cấy chuyền trên môi trường NDM dưới điều kiện sáng trở nên xanh và sản xuất ra số phôi cao nhất (79,8%) với số phôi trưởng thành (9 phôi/mô sẹo) Trong 1 tháng, các phôi này nảy mầm trên môi trường bổ sung AC [227]

Laelia speciosa là loài lan bì sinh đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Mexico Các

lá hình thành từ việc nuôi cấy hạt được cảm ứng trên môi trường bổ sung 30 g/l sucrose và 2,5 mg/l BA Đường kính của mô sẹo đạt được trung bình 1,25 cm sau 8 tuần nuôi cấy Sự hình thành PLB đạt được cũng trên môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l α-NAA và 1 mg/l BA Sự hình thành cây con đạt được trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA và 0,1 mg/l GA3 Cây con thích nghi trong nhà kính với tỷ lệ sống sót đạt 70% [145]

Trên đối tượng lan Coelogyne cristata, phôi sinh dưỡng đã hình thành từ các

khúc lá (3 - 5 mm) trên môi trường ½MS bổ sung 2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l BA và 2 g/l

AC Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa cho thấy nước dừa không có ảnh hưởng lên

sự hình thành mô sẹo từ lá [168]

1.4 HẠT NHÂN TẠO

1.4.1 Khái niệm về hạt nhân tạo (artificial seed)

Hạt tổng hợp (synthetic seed) hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ dùng để đề cập đến phôi sinh dưỡng được bọc bởi lớp vỏ bọc, có thể bảo quản và vận chuyển,

được gieo trồng, phát triển thành cây trong các điều kiện in vitro hay ex vitro Như

vậy, đây là dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên [194] Tuy nhiên, không nên lầm lẫn thuật ngữ “hạt tổng hợp” với hạt có tính thương mại của cây trồng có chọn giống được định nghĩa như là một thế hệ ưu thế của quần thể được thụ phấn bao gồm một nhóm các dòng lai cận huyết hay các dòng lai khác dòng được chọn lọc [201]

31

Khái niệm về hạt nhân tạo với vỏ bao bọc phôi sinh dưỡng đã được Murashige đề cập đầu tiên vào năm 1977 Từ việc tạo hạt nhân tạo làm khô cho phôi sinh dưỡng cà rốt, cần và đến năm 1984, Redenbaugh phát triển kỹ thuật bao

phôi sinh dưỡng cỏ linh lăng (Medicago sativa) bằng lớp vỏ hydrogel Từ lúc này,

vỏ bọc hydrogel được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất hạt nhân tạo [113], [195]

Mô phỏng cấu tạo của hạt tự nhiên, hạt nhân tạo cũng bao gồm “nội nhũ” thường được tạo từ các chất dinh dưỡng giúp phôi phát triển, các loại hydrogel như alginate, agar… và phần “phôi” đến từ bất kỳ mô, cơ quan hay phôi sinh dưỡng nào

có khả năng tái tạo cơ thể hoàn chỉnh của cây giống quan tâm Với kích thước nhỏ gọn và lớp gel bảo vệ bên ngoài, hạt nhân tạo tỏ ra rất tiện lợi trong vận chuyển, cất giữ, phân phối, trao đổi giống và hơn cả là thể hiện tiềm năng tự động hoá trong trồng trọt Cho đến nay, dẫu khả năng áp dụng thực tế hạt nhân tạo còn nhiều hạn chế, đòi hỏi thêm nhiều nghiên cứu, kỹ thuật này vẫn đã và đang được nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau như cúc, lily, cẩm chướng, khoai tây, chuối, dâu tằm …[92]

Những yêu cầu đối với công nghệ hạt nhân tạo [196], [201]:

1 Phải có một quy trình sản xuất phôi sinh dưỡng đảm bảo cung cấp phôi chất lượng cao, khỏe, có kiểu hình đồng loạt và phát triển bình thường

2 Vật liệu tạo vỏ bọc nhân tạo: vỏ bao không những phải đủ mềm để bảo vệ phôi, cho phép hạt nảy mầm mà còn phải bền trong suốt quá trình sản xuất, dự trữ, vận chuyển và gieo trồng Vỏ bao còn phải chứa các chất dinh dưỡng, các nhân tố kiểm soát tăng trưởng như CĐHSTTV, các thành phần cần thiết khác cho hạt nảy mầm và phát triển

3 Đối với một số loại cây trồng, việc sản xuất hạt nhân tạo đơn phôi là rất cần thiết

4 Hạt nhân tạo có thể được gieo trồng bằng các thiết bị cơ giới hiện đại

Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất hạt nhân tạo

Sản xuất hạt nhân tạo là một phương pháp thu nhiều lợi nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thông qua sự phát sinh phôi sinh dưỡng Hạt có thể được

32

gieo trồng trong điều kiện in vitro hay ex vitro và tạo ra các cây con đồng dạng Đây

là kỹ thuật phục vụ thiết thực cho việc sản xuất thương mại một số dạng cây vô tính [28] Hạt nhân tạo có nhiều ưu điểm như: nhân giống đồng nhất, dễ dàng vận chuyển và bảo quản giống lâu dài, có tiềm năng nhân giống với số lượng lớn và giá

cả sản xuất thấp [79], [112] Ziv [267] đề nghị tự động hóa toàn bộ quy trình sản xuất hạt nhân tạo Đây cũng là một thuận lợi của công nghệ hạt nhân tạo bởi vì ứng dụng thương mại của sự phát sinh phôi sinh dưỡng đòi hỏi hạt được sản xuất trong những thiết bị có thể tích lớn Việc trữ lạnh hạt cũng rất quan trọng đối với khả năng sống sót và khả năng nảy mầm của hạt sau quá trình trữ lạnh Hạt nhân tạo cũng có thể cung cấp nguồn giống cho những dạng thực vật mới - những cây chuyển gene, cây không hạt, cây đa bội - được tạo ra từ sự tiến bộ của công nghệ sinh học [193], [201], [203]

1.4.2 Các phương pháp tạo hạt nhân tạo

Cho đến nay, có hai loại hạt nhân tạo được đề cập: hạt làm khô và hạt hydrat Hạt nhân tạo làm khô được sản xuất từ phôi sinh dưỡng trần hay phôi được bọc bằng polyox, một loại polymer tổng hợp rồi làm khô Trên đối tượng cà rốt cho thấy, phôi sinh dưỡng ở hạt nhân tạo làm khô dễ bị tổn thương mặc dù phôi có khả năng sống sót sau quá trình làm khô Nguyên nhân là do quá trình khử nước và tái hấp thu nước hoặc do phôi chưa đạt đến trạng thái trưởng thành cần thiết để có khả năng chống chịu cao nhất đối với sự làm khô Quá trình làm khô có thể được thực hiện một cách chậm 1 hay 2 tuần trong phòng có độ ẩm tương đối thấp hoặc làm khô nhanh trong các hộp petri trong tủ cấy vô trùng Những kiểu hạt xử lý làm khô này chỉ áp dụng cho một số loài cây mà phôi sinh dưỡng có khả năng chịu khô như cần tây, cà rốt [113]

Hạt hydrat có lớp vỏ bọc phôi sinh dưỡng bằng các chất ưa nước hydrogel như alginate, sau đó, có thể được ngâm trong dung dịch để bảo quản Đa số hạt nhân tạo thường áp dụng theo loại hạt này như: chuối, dâu tằm, cỏ linh lăng, các loài lan… [92]

Quá trình tạo hạt nhân tạo gồm các bước sau:

33

Hình thành phôi sinh dưỡng
nhân phôi
làm đồng bộ phôi
làm phôi sinh dưỡng trưởng thành
chuẩn hoá vỏ bọc
tiêu chuẩn hoá phôi nhũ nhân tạo

sản xuất hạt nhân tạo
trồng trong nhà kính hoặc ngoài đồng

1.4.2.1 Phôi sinh dưỡng

Đây là vật liệu chủ chốt trong quá trình phát triển thành cây con Vì vậy, việc cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng, nhân phôi và tạo sự trưởng thành cho phôi có ý nghĩa rất quan trọng trong đảm bảo sức sống cũng như khả năng bảo quản cho hạt nhân tạo Quá trình hình thành và phát triển phôi sinh dưỡng đã trình bày ở phần 1.3 Vì vậy, trong phần này, xin đề cập cụ thể hơn về sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, một mắc xích quan trọng trong tạo hạt nhân tạo

Cần có giai đoạn làm phôi thành thục với việc xử lý làm khô, dự trữ protein (các nguồn N hữu cơ, glutamine, nguồn lưu huỳnh vô cơ, kali sunfat ), dự trữ tinh bột…

Có thể lợi dụng stress thẩm thấu cho phôi bằng cách sử dụng 5 - 6% sucrose thay vì 2 - 3% như nuôi cấy bình thường trong môi trường, giúp ngăn ngừa sự nảy mầm sớm và duy trì sự phát triển phôi Để phôi phát triển, việc dự trữ protein, carbohydrat với các nguồn N hữu cơ, glutamine, nguồn lưu huỳnh vô cơ như K2SO4được tiến hành ở phôi

Trong giai đoạn trưởng thành, môi trường chứa glutamine và sunfat, phôi sẽ tổng hợp, tích lũy protein khoảng 50% khối lượng được tìm thấy trong phôi hợp tử Phần dự trữ tổng hợp protein và tinh bột được điều hòa bởi tỷ lệ C/N trong môi trường Khi tỷ lệ này cao sẽ gia tăng tổng hợp protein từ tinh bột [123]

Giai đoạn cuối cùng trong sự trưởng thành của phôi đạt được bằng chuyển phôi sang môi trường chứa ABA Chất điều hòa sinh trưởng này có thể làm tăng khả năng chịu khô của hạt nhân tạo Những xử lý vật lý khác như làm lạnh, làm nóng, stress thẩm thấu hay stress dinh dưỡng có thể gây ra sự đáp ứng tương tự vì chúng kích thích tổng hợp ABA nội sinh [127], [149], [208]

Đối với cỏ linh lăng (Medicago sativa), xử lý in vitro trong giai đoạn trưởng

thành của phôi sinh dưỡng, làm tăng khả năng sống sót, tăng tỷ lệ nảy mầm khi

34

trồng cây trong điều kiện không vô trùng Dưới các điều kiện in vitro, việc thêm

đường và các chất dinh dưỡng là cần thiết trong sự trưởng thành của phôi Tuy nhiên, lợi ích của việc xử lý trưởng thành phôi sinh dưỡng thể hiện khi phôi được trồng dưới các điều kiện không vô trùng và thủy canh, khi đường và các chất dinh dưỡng ngoại sinh khác không hiện diện ABA và mannitol thường được sử dụng giúp phôi trưởng thành ABA với nồng độ 5 - 10 µM trong môi trường SH, xử lý phôi sinh dưỡng trong 11 - 21 ngày đã làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm từ 48 - 70% khi trồng trong đất [195] Kiểu xử lý này thì tương tự như các thay đổi xảy ra trong suốt quá trình phát triển phôi hợp tử [188]

Trong quá trình trưởng thành của phôi sinh dưỡng khi xử lý với ABA, sự phát triển phôi dừng lại, sự nảy mầm bị ức chế và phôi sinh dưỡng thay đổi từ xanh đến vàng hay trắng Có một sự gia tăng có ý nghĩa khối lượng tươi, hàm lượng chất khô với sự tích lũy tinh bột cao của phôi sinh dưỡng Các phân tích tế bào cho thấy, tinh bột được dự trữ trong các lá mầm của phôi sinh dưỡng và một ít ở các phần khác của phôi Ngược lại, phôi sinh dưỡng được xử lý trong điều kiện lạnh (4°C) không có ABA đã không thay đổi khối lượng tươi và hàm lượng chất khô, rất ít hay không có tinh bột trong phôi và tỷ lệ nảy mầm thành cây trong đất rất thấp hay bị chết hoàn toàn [70]

Nồng độ cao của sucrose (13%) với ABA trong suốt giai đoạn trưởng thành cũng đã làm tăng mức tổng hợp tinh bột hay các chất dự trữ cần thiết khác, giúp phôi sinh dưỡng chuyển đổi thành cây trong đất Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng nồng

độ đường cao thì không có tác động có lợi trong việc chuyển đổi phôi sinh dưỡng thành cây Nồng độ sucrose 9% sẽ làm giảm sự chuyển đổi Ảnh hưởng thẩm thấu của nồng độ đường cao có thể làm tổn hại đến phôi [71]

1.4.2.2 Phương pháp bọc hạt

Ngoài mầm hạt phôi sinh dưỡng, vỏ bọc cho hạt nhân tạo cũng rất quan trọng trong việc tạo hạt nhân tạo Vỏ bọc vừa là nơi phôi được bảo vệ, vừa có thể

dự trữ chất dinh dưỡng để phôi nảy mầm và chuyển đổi thành cây con có sức sống

Có nhiều phương pháp tạo vỏ bọc nhưng chủ yếu có những phương pháp sau:

35

Bọc hạt bằng các loại vật liệu hydrat hoá

Đây là phương pháp phổ biến nhất trong sử dụng làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo, điển hình là sodium alginate với lớp vỏ hydrogel trong môi trường nước Hạt bọc lớp vỏ hydrat thường áp dụng cho phôi khó sống và nhạy cảm với việc làm khô

Algin (acid alginic) được Standford phát hiện ra năm 1881, là acid hữu cơ có trong tảo nâu, khối lượng phân tử khoảng: 32.000 – 200.000, do các phân tử acid manuronic (M) và acid L-guluronic (G) gắn kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucoside, [8] Về phương diện sinh học, alginate là chất cơ bản tạo thành tế bào

của tảo nâu Laminaria sp., chiếm đến 45% trọng lượng khô [114] Algin được tạo

từ các polisaccharid không nhánh của α-1,4-D-mannuronic acid (M) và 1,4-L-guluronic acid (G), được sắp xếp trong các miền polimer đồng đều tạo nên các khối M, G, MG (1,4-D manuronic acid và C-5-epimer-1,4-L-guluronic acid) Các đặc điểm này thay đổi phụ thuộc điều kiện tự nhiên, tuổi của mô cũng như vào mùa và khu vực sinh trưởng (bị che khuất hay phơi bày) Cuống của bẹ tảo

C-5-epimer-Laminaria sp thường chứa tỷ lệ cao khối G, phiến bẹ thường chứa thành phần cao

hơn khối M [86] Ý nghĩa sinh học của sự không theo cặp này được liên hệ đến các đặc tính sinh hóa của alginate

Alginate có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, không mùi, hầu như không tan trong ethanol, ether… nhưng có thể tan trong nước tạo thành chất keo sệt Sau khi hấp thu nước, thể tích của algin có thể tăng lên gấp 10 lần Tính sệt khi hòa tan trong nước thay đổi theo mức độ polymer hóa và nồng độ alginate Alginate rất dễ

bị giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ thấp Độ nhớt của dung dịch alginate 5% sẽ bị giảm đi một nửa ngay cả khi bảo quản ở nhiệt độ 30 ± 2°C trong 5

- 10 ngày [8], [140]

Khác với agar, khi giảm nhiệt độ thì dung dịch alginate cũng không đông lại ngay cả khi làm lạnh (độ nhớt và bề ngoài đều không thay đổi) Sodium alginate tan được trong protein, gelatin, tinh bột, đường, glycerine…và có khả năng tạo sợi và màng [8]

36

Hình 1.4 Cấu tạo hóa học của sodium alginate [8]

Các alginate có khả năng tạo gel khi có mặt các ion can-xi khi ở nhiệt độ phòng, trong khoảng pH 4 - 10 Khi tham gia tạo gel, các tương tác tĩnh điện qua cầu calcium có vai trò quan trọng Các gel không thuận nghịch với nhiệt và ít đàn hồi [8]

Alginate hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hoá trị I (Na+, K+,

NH4+…) và sẽ chuyển sang dạng không tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị II hoặc đa hóa trị (Ca2+, Mg2+, Al3+…) Chẳng hạn, nếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch calcium chloride thì sodium alginate ở phần điện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa ngay thành calcium alginate tạo nên một màng không thấm nước tạo nên các viên alginate Đây là cơ sở trong tạo lớp vỏ hạt nhân tạo [8], [86]

Sodium alginate sẽ tạo phức khi trộn với các cation kim loại hóa trị 2 hay 3 như Ca2+ để tạo thành calcium alginate do sự hình thành liên kết ion giữa các nhóm acid carboxylic trên các phân tử acid guluronic của alginate Sodium alginate dễ hòa tan và ổn định ở nhiệt độ phòng (25°C) và bắt đầu tạo phức ngay khi tiếp xúc với các cation kim loại Độ cứng của viên phụ thuộc vào loại cation và thời gian tạo phức Thời gian tạo phức thấp nhất là 15 phút trong calcium chloride nhưng trung tâm của viên bọc vẫn ở dạng lỏng Kích thước của viên có thể được kiểm soát bởi tính nhớt của sodium alginate và đường kính trong của đầu pipette để tạo thành giọt

Vì vậy, nồng độ của sodium alginate, dung dịch Ca2+ và thời gian tạo liên kết ion tối

ưu có ảnh hưởng nhất định trong tạo độ cứng thích hợp nhất cho vỏ bọc Sodium alginate sẽ hòa tan và tồn tại ổn định ở nhiệt độ phòng (25°C) Độ cứng của viên

Các chất đi kèm trong vỏ bọc hạt nhân tạo (phôi nhũ nhân tạo)

Trong sản xuất hạt nhân tạo, ngay cả khi bọc với vật liệu kỵ nước, yêu cầu về các chất dinh dưỡng, thuốc trừ nấm, thuốc trừ sâu là cần thiết để tăng cường khả năng sống sót của phôi Các chất dự trữ cần thiết để nuôi cây mầm như: Hyponex (6,5 N – 6 P – 19 K) hoặc môi trường MS; các vitamine như: B1, B6, PP; các acid

amin như: glycine; myo-inositol và nguồn carbon hydrate như sucrose, các

CĐHSTTV như α-NAA… Để tránh nhiễm khuẩn, có thể bổ sung chất kháng sinh (rifampicin: 0,25 – 60 mg/l, cefatoxim: 250 mg, tetracycline: 25 mg pha trong 5 ml dimethyl sulphoxide để tạo chất nền gel) AC (0,1%) cũng được thêm vào để hấp thụ polyphenol (như ở chuối) [73], [74], [75], [173]

1.4.3 Bảo quản hạt nhân tạo

Có thể sử dụng phương pháp trữ lạnh và làm khô trong bảo quản hạt nhân tạo Tuy nhiên, chỉ có phôi sinh dưỡng của một số loài có khả năng trữ lạnh như:

Asparagus officinalis, Citrus sinensis, Coffea arabica, Coffea canephora, Daucus carota, Manihot esculenta [66]

Việc bảo tồn khả năng tạo phôi, trữ lạnh ở nhiệt độ -196°C là kỹ thuật hữu

dụng Karna và cộng sự [109] đã phục hồi các tế bào phôi của Picea glauca trong

nuôi cấy huyền phù sau khi bảo quản một năm trong ni-tơ lỏng Tiền xử lý các tế bào trong 24 giờ trong môi trường chứa 0,4 M sorbitol, tiếp theo bởi hỗn hợp của

38

sorbitol và 5% dimethylsulphoxide (DMSO) trong 30 phút đã cho sự bảo vệ tốt nhất khi làm lạnh

Ở cỏ linh lăng (Medicago sativa), khả năng chịu khô của phôi sinh dưỡng

được cảm ứng sử dụng ABA ngoại sinh Sau đó, phôi được làm khô ở độ ẩm 10 - 15% trong ít nhất 3 tuần Kết quả cho thấy, 65% trong số phôi sống sót và nảy mầm như hạt thật sự Hoặc tiền xử lý phôi bằng ABA 10 µM trong 10 - 16 ngày, làm lạnh ở 2 - 4°C, stress nhiệt 38oC trong 1 giờ, làm giảm độ ẩm đến 43%, thì khả năng sống sót của phôi sau 21 ngày đạt được 68 - 94% và có thể sống sót sau bảo quản

12 tháng [208]

Việc bảo tồn khả năng sống sót của phôi sinh dưỡng là vấn đề quan trọng trong công nghệ sản xuất hạt nhân tạo Phôi sinh dưỡng khác với hạt bình thường là sinh trưởng mà không có phase lag Vì vậy, sẽ gây khó khăn trong dự trữ và đưa cây ra đồng Việc dùng vỏ bọc hydrogel cũng có những bất thuận lợi như: phôi sinh dưỡng khô nhanh khi phơi bày trong không khí, dẫn tới sự chết của phôi Ví dụ:

phôi sinh dưỡng của cỏ linh lăng (Medicago sativa) bọc alginate, trữ ở 4oC sẽ gây

ức chế hô hấp của phôi hay bao phôi sinh dưỡng với nhựa polyox WSR-N, làm khô cũng dẫn tới giảm khả năng sống của phôi trong thời gian dự trữ [100]

Phôi sinh dưỡng cũng có thể được giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh hoặc bằng phương pháp lạnh đông sâu mà không làm mất đi khả năng nảy mầm Bằng cách này, phôi có thể bảo quản được ở nhiệt độ gần 0°C trong vài tuần hoặc có thể dài hơn rất nhiều, nhiệt độ bảo quản thường là 4°C Khả năng kéo dài thời gian dự trữ của hạt nhân tạo đạt được khi phôi được làm khô ở độ ẩm ít hơn 20% [109]

Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Một số hóa chất như ABA có tác dụng lên trạng thái ngủ của phôi, làm giảm

sự biến dưỡng, ngăn cản sự phân chia của tế bào và nhân hoặc làm tế bào ít bị tổn thương do nhiệt độ lạnh, giúp mẫu bảo quản trong một thời gian dài ở điều kiện lạnh

Bảo quản trong thời gian dài

39

Một trong những phương pháp hiệu quả đó là trữ lạnh Nguyên liệu cần bảo quản được giữ ở một nhiệt độ cực thấp (thường là -196°C) Tại nhiệt độ này, các phân chia ở mức độ tế bào, các quá trình biến dưỡng được ngưng lại hoàn toàn Phương pháp này thường được áp dụng để bảo quản tế bào, phôi, chồi đã biệt hoá [198]

Có thể kết hợp phương pháp loại nước và làm lạnh trong bảo quản hạt nhân tạo Làm khô hạt nhân tạo cà rốt với vỏ alginate, mất 67% nước, trữ ở 2°C, hạt có thể giữ được 60 ngày với tỷ lệ nảy mầm 100% Nếu không loại nước và làm lạnh, 100% hạt sẽ nảy mầm nhưng giảm khả năng sống sót Sau khi loại nước và làm lạnh trong ni-tơ lỏng, hơn 98% phôi sống sót Sau 90 ngày dự trữ, hơn 60% phôi sống sót [133] Tuy nhiên, hầu hết những nguồn nguyên liệu bảo quản lạnh không chịu được ở nhiệt độ này, dễ bị những thương tổn (như hiện tượng tạo tinh thể đá, làm tổn hại phôi)

Tóm lại, các phương pháp được cải tiến trong việc dự trữ ở nhiệt độ thấp như:

Hoá thủy tinh: là việc chuyển trực tiếp nước có trong nguồn mẫu bảo quản từ pha lỏng sang pha vô định hình, để tránh xảy ra việc tạo tinh thể đá với việc bảo quản lạnh trong ni-tơ lỏng (-196°C)

Tạo vỏ bao dinh dưỡng: nguồn mẫu được bọc một lớp áo dinh dưỡng trước khi được giữ ở nhiệt độ thấp

Làm khô: nguồn mẫu được khử nước trước khi được bảo quản lạnh

Bảo quản bằng những phương pháp này có thể tránh được các nguy cơ như nhiễm nấm, các đột biến sinh dưỡng Tuy nhiên, động tác kiểm tra lại sức sống, kiểu gene, sự ổn định của nguồn mẫu trước khi mang sử dụng là cần thiết nhằm loại

bỏ những mẫu đã bị đột biến nếu có [6]

Đánh giá sức sống của hạt nhân tạo sau bảo quản

Tetrazolium (C19H15ClN4) là chất nhuộm thích hợp trong việc xác định sức sống của hạt trong hầu hết các loài trong đó có lan, đặc biệt là khi hạt ở trạng thái ngủ hay chậm nảy mầm [98], [124], [214], [126], [162], [250]

40

Cơ sở khoa học của phương pháp này như sau: trong các mô sống, muối triphenyltetrazolium (TTC) không màu và tan trong nước bị khử bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong các tế bào thành triphenylformazan không tan và có màu đỏ Mô hạt sống sẽ xuất hiện màu đỏ còn mô hạt không sống sẽ không phản

ứng với muối và tồn tại không màu

Phản ứng của 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride xảy ra như sau:

Phương pháp này đáng tin cậy và cho kết quả chính xác ngay cả trong trường hợp có sự trở ngại sự nảy mầm của những hạt vừa mới chín cần trải qua quá trình nghỉ (như hạt ngũ cốc) [98]

Việc sử dụng phương pháp TTC để đánh giá sức sống của hạt lan cũng đã thực hiện bởi một số tác giả khi mà các yếu tố môi trường phức tạp ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt [214], [250]

1.4.4 Sơ lược một số nghiên cứu trên thế giới về hạt nhân tạo lan

Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo

Hạt nhân tạo lan (Spathoglottis plicata) có thể bảo quản trong 180 ngày ở 4°C mà không giảm sức sống [215] Hạt nhân tạo từ PLB của Dendrobium wardianum có tỷ lệ chuyển đổi thành cây là 100% sau 45 ngày nuôi cấy trên môi

trường MS Hạt có thể bảo quản trong 180 ngày ở 4°C nhưng khi tăng thời gian bảo

quản, sự nảy mầm của hạt giảm chỉ còn 10% [212]

Datta và cộng sự [52] báo cáo về hạt nhân tạo của lan Geodorum densiflorum

(Lam) Schltr đạt tỷ lệ nảy mầm 100% khi bảo quản ở 4°C trong 120 ngày so với phôi không được bọc đã không có sức sống sau 30 ngày bảo quản ở 4°C

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hạt nhân tạo của các loài lan với mầm hạt là PLB [52], [111], [147], [162], [173], [174], [202]

Triphenylformazan TTC