Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (cymbidium SP )

MỞ ĐẦU Việt nam đất nước thích hợp cho việc sinh trưởng loài lan nhiệt đới, cho hoa đa dạng Phần lớn loại lan có danh sách Hiệp hội Thương mại Quốc tế Các loài Quý (Convention on International Trade of Endangered Species - CITEs), có Cymbidium, loại địa lan cho hoa bền đẹp, có giá trị thương mại cao Tuy nhiên, nhiều loài lan có xu hướng tuyệt chủng tốc độ khai thác nhu cầu tiêu thụ cao Trong nhân giống loài địa lan lại có vấn đề gặp phải hạt lan bé, phôi chưa phân hoá phôi nhũ enzyme để cung cấp, chuyển hoá chất dinh dưỡng cho hạt phát triển nên khó nảy mầm tự nhiên Ngoài ra, nhu cầu tiêu thụ nội địa xuất địa lan cao nhu cầu trồng địa lan ngày gia tăng Vì vậy, vấn đề nhân giống bảo tồn địa lan cấp thiết Nhân giống địa lan thường thực đường nuôi cấy mô thực vật với trình nhân giống cần liên tục định kỳ vô mẫu lại ban đầu làm tăng chi phí hiệu đầu tư Sản xuất hạt nhân tạo với mầm hạt phôi sinh dưỡng khắc phục vấn đề việc chủ động sản xuất hạt giống từ phôi sinh dưỡng góp phần mở triển vọng công nghệ sinh học, nghiên cứu tế bào học thực vật với nhiều công trình đối tượng thực vật như: nho, mía, lan hồ điệp Nghiên cứu hình thành phát triển từ hạt nhân tạo, bảo quản hạt nhân tạo địa lan mục đích công tác nhân giống bảo tồn chất lượng giống địa lan Đề tài “Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo địa lan (Cymbidium sp.)” thực với mục tiêu: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng địa lan để tạo giống bệnh làm nguyên liệu cho thí nghiệm hình thành phôi sinh dưỡng Nghiên cứu phương pháp hình thành phôi sinh dưỡng địa lan Nghiên cứu phương pháp nhân phôi sinh dưỡng địa lan Nghiên cứu nguyên liệu phôi loại vỏ bọc thích hợp để tạo hạt nhân tạo địa lan Nghiên cứu khả sống sót nảy mầm hạt nhân tạo địa lan điều kiện in vitro ex vitro Nghiên cứu biện pháp bảo quản thích hợp hạt nhân tạo địa lan Nghiên cứu khả sống sót nảy mầm hạt nhân tạo địa lan điều kiện in vitro ex vitro sau hạt bảo quản Về mặt khoa học, luận án trình bày số vấn đề liên quan đến phôi sinh dưỡng hạt nhân tạo như: phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, phát sinh mô sẹo, hình thành phôi sinh dưỡng PLB địa lan, yếu tố hình thành nhân phôi việc tạo bảo quản hạt nhân tạo từ phôi địa lan mà lần nghiên cứu cách hệ thống Về mặt thực tiễn, việc tạo bảo quản hạt nhân tạo đưa hướng sản xuất mới: sản xuất chủ động hạt giống từ phôi sinh dưỡng với tiềm hạt giống mang tính đồng tạo tiền đề ứng dụng sản xuất giống đồng loạt, góp phần công tác sản xuất giống bảo tồn nguồn gene Những điểm luận án: Nghiên cứu hình thành phôi sinh dưỡng địa lan từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng từ mô sẹo có khả phát sinh phôi Nghiên cứu hình thành PLB từ phôi sinh dưỡng với biến đổi hình thái học sử dụng phôi sinh dưỡng làm vật liệu việc tạo hạt nhân tạo địa lan Nghiên cứu cách hệ thống hình thành nuôi trồng hạt nhân tạo địa lan Sự hình thành phôi sinh dưỡng, đặc biệt hình thành phôi sinh dưỡng họ Lan (Orchidaceae) với giai đoạn phát triển phôi lan, nhà sinh học thực vật giới quan tâm luận án này, việc nghiên cứu chứng minh hình thành phôi sinh dưỡng PLB phát triển từ phôi sinh dưỡng địa lan thực khía cạnh phát sinh hình thái nhằm ứng dụng có hiệu vi nhân giống thực vật Điều lại có giá trị địa lan, giống quý có lối thụ phấn nhờ sâu bọ khó nhân giống CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) 1.1.1 Vị trí phân loại Giới: Plantae, Ngành: Angiospermatophyta, lớp: Monocotyledoneae, bộ: Orchidales, họ: Orchidaceae, chi: Cymbidium, loài: Cymbidium spp Lan (Orchidaceae) họ lớn mầm với 800 chi 35.000 loài chi Cymbidium có khoảng 60 loài Đây xem họ phát triển khả sống sót Hiện nay, có khoảng 150.000 loài lan lai sản xuất đăng ký Các loài lan hệ thống phân bố rộng, vậy, hình thái cấu tạo phức tạp đa dạng [46], [99], [122], [216] 1.1.2 Nguồn gốc phân bố Với điểm bật giá trị khoa học lẫn giá trị nghệ thuật, địa lan (Cymbidium) mệnh danh nữ hoàng loại lan Đây loài lan nuôi trồng sớm (cách khoảng 2500 - 3000 năm Trung Quốc) với dáng vẻ giản dị nhã mùi hương dịu dàng hoa [36] Đặc biệt, năm 1994, De Clercq đưa khám phá thú vị hoạt tính mannos–lectins đặc hiệu có địa lan số loài lan khác có khả ngăn chặn cách có chọn lọc virus HIV [54] Chi Cymbidium có nguồn gốc Đông Nam Á Nam Á, phân bố từ dãy Hymalaya đến Nam Trung Quốc, nước Đông Dương, Thái Lan, Ấn Độ, Nhật, Úc… Ở Việt Nam, địa lan trồng nhiều vùng Tây nguyên Sa Pa Đà Lạt nơi lý tưởng để trồng loại lan này, cung cấp cho thị trường nước lượng lớn lan cắt cành lan chậu Tuy nhiên, nước ta, nghề trồng lan có địa lan chưa xem ngành kinh tế quan trọng số nước Âu, Mỹ, Thái Lan, Úc [3] 1.1.3 Đặc điểm hình thái – đặc trưng lan Cymbidium (C.) thuộc nhóm lan đa thân, loài đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo bụi nhỏ, sinh trưởng bì sinh, đá hay đất C macrorhizon, loại lan hoại sinh, sinh sống hoàn toàn bề mặt đất, trừ nhú phát hoa C ensifolium, C goeringii, C sinense thường trồng rộng rãi Các loài lan lai thường hình thành từ loài với giống cho hoa đẹp, màu sắc phong phú [3] Thân ngầm lan (căn hành) thường ngắn, nối củ lan lại với Các củ lan thực chất cành ngắn hành gọi giả hành Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thỏng Chiều dài phát hoa từ 10 cm đến 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc Búp hoa đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống bắt đầu nở hoa Thoạt nhìn, hoa Cymbidium có năm cánh gần giống thực có hai cánh hoa bên trong, lại ba đài bên ngoài, có cấu trúc màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ ba chuyên hóa thành cánh môi, có màu sắc rực rỡ [2], [15] Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị nhụy gắn chung trụ nhịnhụy hình bán trụ cong phía trước Nhị mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính keo Khối phấn đậy nắp màu trắng ngà dễ mở rời Hộc chứa phấn khối trục hợp nhụy cách với núm nhụy gờ lên Cấu trúc bắt buộc tự nhiên hoa Cymbidium thụ phấn nhờ côn trùng [3] Ngoài 12 loài tự nhiên (như lan Đoản kiếm - Cymbidium aloifolium Swartz), Thanh lan - Cymbidium cyperifolium), số giống địa lan trồng phổ biến Việt Nam hầu hết lan lai với khả cho hoa to, cánh dày, bền đẹp (Cam lửa, Vầng trăng, Xanh Chiểu, Xanh Thơm ) Về tế bào học, số nhiễm sắc thể lưỡng bội loài Cymbidium khoảng 40 Ngoại trừ vài loài tam bội hay tứ bội C insigne 'Bieri' (2n = 60), C floribundum 'Geshohen' (2n = 80) hay C floribundum 'Yoshina' (2n = 60) [254] Là loại lan thích hợp với khí hậu vùng núi cao, vậy, yếu tố sinh thái thường phù hợp với Cymbidium là: nhiệt độ từ - 27οC, tối thích 13 - 24οC Ở vùng có địa hình thấp, nhiệt độ cao hơn, vài giống cho hoa không đặn hay phát triển thân, Lượng ánh sáng khoảng 50 - 70% lượng ánh sáng trực tiếp với độ chiếu sáng khoảng 20000 lux Độ ẩm khoảng 50 - 70 % độ ẩm tương đối không khí 70 - 80% độ ẩm giá thể [3], [94], [138] Cymbidium sinh trưởng thích hợp giá thể có tính acid, thông thoáng giữ độ ẩm cao dớn, xơ dừa [240] Hình 1.1 Địa lan Cymbidium sinense [270] A Cây trưởng thành mang giả hành, hoa B Cây từ giả hành A B 1.1.4 Phôi hữu tính địa lan Không giống với phần lớn thực vật khác, noãn nhiều loại lan thường không phát triển thụ phấn thành công xảy Điều gây nên phát triển mô giá noãn hình thành noãn [259] Kết thụ tinh bị trì hoãn vài tháng noãn phát triển đầy đủ Vì vậy, lan hệ thống lý tưởng cho việc nghiên cứu noãn phát triển phôi Cymbidium đối tượng đại diện cho việc nghiên cứu phôi họ Lan [91], [259] Phát sinh phôi trình tương đối ngắn so với thời gian hình thành quả, bắt đầu khoảng thời kỳ thụ phấn thời kỳ nứt noãn kéo dài trung bình hai tuần Phôi lan trình phát sinh phôi loài lan giống Hạt lan chứa vỏ bao quanh phôi nhỏ (tiền phôi) gồm 80 – vài trăm tế bào đồng giai đoạn hình cầu với tổ chức tế bào không xác định mô phôi, nội nhũ phôi bao bọc lớp màng Phôi có kích thước khoảng 0,25 - 1,20 x 0,09 - 0,27 mm chưa phân hoá, phần lớn mầm, chồi mầm, rễ mầm (ngoại trừ Sobralia macrantha Bletilla hyaqmthina có mầm sơ đẳng), chưa có thay đổi kích thước tế bào xếp tế bào này, enzyme để xúc tác phản ứng trao đổi chất nhằm cung cấp lượng cho phôi (mặc dù thân phôi tích lũy tinh bột, lipid protein) [13], [16], [38], [63], [144], [149], [259] Ở thời điểm phân tán hạt, phôi chưa có mô phân sinh mầm Mặc dù biệt hóa hiển nhiên túi phôi lớp cutin bao bọc phôi có ích cho biệt hóa tiền bì (protoderm) Tiền bì mô biệt hóa phôi hợp tử hình thành biểu bì hạt nảy mầm Cutin chất tổng hợp tế bào để hình thành biểu bì sau Ở C sinense, lớp tiền bì trở nên xác định sau phân chia song song dừng lại bề mặt tế bào túi phôi Sự diện cutin thành tế bào tiền bì phản ánh tính chất vốn có lớp biểu bì phát triển cutin vai trò trực tiếp phát triển phôi Phôi lan có lớp vỏ mỏng nội nhũ hạt Vì vậy, diện lớp cutin thành túi phôi để bảo vệ tránh khô sớm phôi chưa trưởng thành [38], [149], [259] Quá trình hình thành phôi từ hợp tử tóm tắt sau: lần phân chia xiên từ hợp tử Cymbidium hình thành tạo tế bào hàng loạt lần phân chia tạo phôi cầu [91], [259] Sự khác biệt hình thái phôi loài họ Lan với họ thực vật có hoa khác nhận thấy rõ từ giai đoạn phôi cầu Ở thực vật có hoa khác, tất tế bào phôi cầu thuộc dạng mô phân sinh Riêng phôi lan, tế bào đỉnh tế bào mô phân sinh phân chia, tế bào khác không phân chia tăng kích thước Vì vậy, phôi lan có hai vùng phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ cực đáy với tế bào lớn [130] Kích thước tế bào vùng tế bào nhỏ phụ thuộc vào giai đoạn phát triển phôi lan Vùng tế bào chiếm 1/3 thể tích phôi hạt trưởng thành, lại nhu mô với kích thước lớn, chứa tế bào chất đậm đặc [3], [30], [63] Phôi lan hiển thị loại mô: mô biểu bì, mô phân sinh nhu mô, biệt hóa yếu tố mô mạch vắng mặt [20] Có tinh bột tích lũy phôi trưởng thành Các tế bào dây treo sản phẩm dự trữ không cutin bao phủ [38], [259] Như vậy, phôi lan hạt hợp tử dạng hình cầu Phôi bảo vệ tầng đơn lớp vỏ hạt lớp vỏ hạt chất dự trữ Phần lớn loài lan có phôi đơn giản, không biệt hóa với hạt nhỏ, nghèo chất dự trữ Mặc dù vậy, phôi lan nảy mầm in vitro qua giai đoạn trung gian hình thành protocorm, cấu trúc với tế bào chưa biệt hóa hình thành từ phôi nảy mầm [14], [38], [63], [130], [175], [245], [258] 1.1.5 Phát sinh hình thái phôi phát triển protocorm - Sinh học nảy mầm hạt địa lan Cũng phát triển hạt lan, hạt địa lan thường trải qua giai đoạn từ phôi cầu sang dạng protocorm Protocorm tương ứng với giai đoạn chuyển tiếp mạnh mẽ trình phát triển phôi [3], [40], [68] Melchior Treub người đưa thuật ngữ (1890) để trạng thái sớm nảy mầm thạch tùng [20], [35], [40], [106] Protocorm giai đoạn phát triển tiếp tục phôi hạt nảy mầm lúc mô phân sinh phôi hình thành chồi đỉnh [68], [246] Sau hút nước, hạt trương phồng tế bào phôi hình cầu bắt đầu phân chia làm nứt lớp vỏ hạt Lúc này, phôi có màu trắng chưa biệt hóa với tế bào hình tròn, đồng kích thước, chưa có dấu hiệu mầm, rễ sơ khởi chồi mầm Sau đó, phôi chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp với tăng kích thước tế bào đáy Trong lớp tế bào bề mặt phôi, lông dạng rễ bắt đầu phát triển chẳng mô phân sinh đỉnh chồi xuất Các tế bào mô phân sinh đỉnh nhỏ nhiều so với tế bào nguồn gốc phôi Sau đó, mô phân sinh đỉnh lún vào thành phận bên protocorm dần biến khỏi bề mặt Cấu trúc hình phễu xuất để tạo sơ khởi từ nơi tạo Song song với thay đổi hình thái chồi hình thành với khí khổng Phần đáy protocorm bắt đầu kéo dài phủ lông mờ với tế bào bắt màu sẫm, nơi dự trữ hấp thu chất dinh dưỡng cho sau Giai đoạn protocorm giai đoạn phôi nảy mầm hình thành phát triển đỉnh chồi chưa có rễ (trừ Cypripedium, protocorm tạo rễ trước) [3], [13], [14], [192] Protocorm thường màu xanh, tròn đối xứng tỏa tròn sau chuyển sang dạng hình nón Sự hình thành protocorm xem phát triển đặc trưng họ Lan hình dạng protocorm đa dạng: tròn, bầu dục, đĩa kéo dài, có nhánh, hình cầu hay dạng quay [20] Các protocorm tiếp tục phát triển nhiều tuần, nhiều tháng hay hàng năm phụ thuộc vào loài đủ lớn để hình thành chồi rễ Sau xuất lá, thân Đối với Cymbidium, sau hạt nảy mầm hình thành protocorm với chlolorophyll để quang hợp Chỉ protocorm dự trữ đủ chất dinh dưỡng hình thành chồi rễ Phần cuối gốc cuống noãn protocorm tạo nên mô xốp để hỗ trợ chất dinh dưỡng với giúp đỡ nấm cộng sinh Các loài lan rễ sơ cấp; rễ bất định phát triển sau vài tuần chồi xuất Đến lúc giai đoạn protocorm kết thúc bước vào mùa sinh trưởng Cây tiếp tục phát triển đến hai rễ vài Các loài chi Orchis có thời gian nảy mầm nhanh (28 ngày), lâu chi Cypripedium (250 - 300 ngày) Thông thường 50 - 90 ngày Vài chi lan khó nảy mầm phát triển thành Epipactis, Cephalanthera Neotia [19], [20], [21], [63] Hạt lan nội nhũ nên phần gốc phần protocorm mang nhiều lông (xuất phát từ biểu bì) có nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng môi trường để phôi phát triển.Vì vậy, phần gốc có vai trò tương tự nội nhũ [2], [13], [20] Hạt thiếu nội nhũ có vài chất dinh dưỡng dự trữ tế bào phôi chủ yếu protein lipid, đường để hỗ trợ ban đầu cho nảy mầm nhiễm nấm xảy [20], [144], [192] Vài loài lan phụ thuộc vào nguồn sucrose bên ngoài, cần có cộng sinh nấm nuôi cấy có đường in vitro Hạt lan khởi đầu dị dưỡng sau với phát triển mô quang hợp dần trở thành tự dưỡng hạt lan cần acid amin chất dinh dưỡng khác từ bên thêm vào [192] Cấu trúc dạng phát sinh phôi lan xem tử diệp bao quanh cực chồi Mô mạch không phát triển giai đoạn phôi, vậy, phôi lan không chứa vùng mô phân sinh rễ Trong đó, phôi loài thực vật có hoa khác phân rõ hai cực: cực chồi cực rễ Đây điểm khác biệt lớn phôi lan loài thực vật có hoa khác [3], [21], [191] Trong tự nhiên, hạt lan nảy mầm với tỷ lệ thấp (0,2 - 0,3%) cần có cộng sinh nấm (Mycorrhizal) nhằm cung cấp nước, muối khoáng, carbohydrate vitamin cho phôi [248] Đối với loài lan đất, mối quan hệ lan nấm cộng sinh quan trọng suốt giai đoạn sớm đời sống lan mà protocorm sống ngầm đất tự sản xuất chất dinh dưỡng Khi hạt nảy mầm, tầng biểu bì trở nên rõ Các tế bào lỗ noãn cuối dây treo phôi thay đổi kích thước tế bào để hình thành protocorm Trong giai đoạn sinh trưởng trước hình thành đỉnh chồi, phân chia tế bào xảy cuối hợp điểm phôi cuối lỗ noãn, tế bào mở rộng nhỏ không phân chia [243] Đầu giai đoạn nảy mầm phôi, diệp lục tố xuất tế bào protocorm loài lan bì sinh Hàm lượng m.RNA đặc biệt gia tăng cuối hợp điểm phôi Các thay đổi việc chép gene liên quan đến nảy mầm thay đổi chép gene không liên quan đến nhiễm nấm cộng sinh [12], [19], [20], [21], [191], [197] Đối với Cymbidium, protocorm thường trở nên xanh sản xuất số chất dinh dưỡng cần thiết để phát triển [20], [144] Đỉnh sinh trưởng protocorm có cấu trúc chưa đầy đủ thiếu phần khởi đầu khoảng thời gian Các tế bào bề mặt protocorm trì tiềm tế bào phôi, từ phát khởi tạo thành nhiều đỉnh sinh trưởng bất định [3], [10], [16], [20] Từ điều cho thấy, phôi hữu tính địa lan giai đoạn hạt, có giai đoạn hình cầu, cấu tạo đơn giản phôi nảy mầm điều kiện thích hợp hình thành mô phân sinh, chồi, rễ… (giai đoạn protocorm) 1.2 VI NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) Kỹ thuật nuôi cấy mô phát triển rộng rãi để nhân giống loài lan Trong việc nhân giống in vitro Cymbidium, nhiều phương pháp sử dụng gieo hạt, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phương pháp lớp mỏng tế bào, phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng [22], [23], [34], [89], [90], [143], [161], [170], [233] Phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng trình bày mục 1.3 1.2.1 Nhân giống hữu tính hạt Hạt lan bé, phôi chưa phân hoá, chưa có mầm lẫn phôi nhũ có khoảng vài trăm tế bào Vì vậy, để hạt nảy mầm cần có cộng sinh với nấm (cung cấp nguồn carbon) gieo hạt môi trường in vitro [171], [180] Sự phát triển hạt Cymbidium bắt đầu với phôi chưa trưởng thành, giai đoạn protocorm sau Các protocorm nhân lên từ bề mặt cắt để hình thành protocorm Quá trình nhân giống từ hạt hoa khoảng năm [226] Tuy nhiên, nhân giống hữu tính, biến dị thường xảy nên không thuận lợi cho việc sản xuất hạt đồng di truyền [17], [171] 1.2.2 Vi nhân giống địa lan – Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy mô kỹ thuật chủ yếu nhân giống địa lan Ngoài việc nuôi cấy đỉnh chồi, lá, đầu rễ, phát hoa vi nhân giống địa lan phương pháp hiệu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi lan Mô phân sinh: Đặc tính hình thái quan trọng tế bào mô phân sinh là: kích thước nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, giàu tế bào chất (chỉ có không bào nhỏ), nhân to hạch nhân rõ Lúc đầu, tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh không khác với tế bào sinh chúng; sau đó, tế bào dẫn xuất phân hóa để thành mô nền, mô bì hay mô mạch, mô phân sinh tồn trạng thái phôi [9] Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cymbidium: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo đặc tính di truyền mẹ tái sinh [160] Khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô phân sinh vùng đỉnh này, không số giống khác hình thành cấu trúc protocorm để sau biệt hóa thành Nhân protocorm tạo thành protocorm gọi protocorm-like body [161], [255] Không nuôi cấy mô sẹo in vitro loài thực vật khác, việc thiết lập gene protocorm xác định từ protocorm hình thành ban đầu [85], [159], [171] Protocorm-like body (PLB) thuật ngữ để cấu trúc giống với protocorm có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh chồi bất định loài lan [106], [160] Đây cấu trúc lần đặt Morel [160] nuôi cấy đỉnh chồi Cymbidium để tạo 10 [123] Lai F.M., McKersie, B (1994),“Regulation of starch and protein accumulation in alfalfa (Medicago sativa L.) somatic embryos”, Plant Science 100, pp 211-219 [124] Lakon G (1949), “The topographical tetrazolium method for determining the germination capacity of seeds”, Plant Physiology 24, pp 389-394 [125] Lakshmanan P., Loh C.S and Goh C.J.(1995), “An in vitro method for rapid regeneration of a monopodial orchid hybrid Aranda Deborah using thin section culture”, Plant Cell Reports 14, pp 510-514 [126] Lauzer, D., Arnaud M and Barabé D (1994), “Tetrazolium staining and in vitro germination of mature seeds of Cypripedium acaule (Orchidaceae)”, Lindleyana 9, pp 197-204 [127] Lecouteux C., Lai F.M and McKersie B.D.(1993),“Maturation of somatic embryos by abscisic acid, sucrose and chilling”, Plant Science 94, pp 207-213 [128] Lee K.S., Zapata-Arias F.J., Brunner H and Afza R (1997), “Histology of somatic embryo initiation and organogenesis from rhizome explants of Musa spp.”, Plant Cell Tissue Organ Culture 51, pp 1-8 [129] Lee Y and Lee N (2003), “Plant regeneration from protocorm-derived callus of Cypripedium formosanum”, In vitro Cell Development Biology Plant 39, pp 475479 [130] Lee Y, Edward C Yeung E.C., Lee N and Chung M (2008), “Embryology of Phalaenopsis amabilis var formosa:embryo development”, Botanical Studies 49, pp 139-146 [131] Leonhardt K.W (1977), 1950-chromosome number and cross-compatibility in the genus Cymbidium and some related tropical genera (Orchidaceae), University of Hawaii, University Microfilms International, Thesis, pp 35-40 [132] Li T and Neumann K.H (1985), “Embryogenesis and endogenous hormone content of cell cultures of some carrot varieties (Daucus carota L.)”, Berlin Dutsch Botany Gestalt 98, pp 227-235 170 [133] Li X (1990), “Somatic embryogenesis and synthetic seed technolory using carrot as a model system”, In: Synseeds, Redenbaugh K (ed), CRC Press Inc., pp 290-304 [134] Li X.Y and Huang F.H (1996), “Induction of somatic embryogenesis in Loblolly pine (Pinus taeda L.)”, In Vitro Cell Development 32, pp 129-135 [135] Lin Y.H., Chang C and Chang W.C (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid”, Plant Cell Tissue Organ Culture 62 (1), pp 2125 [136] Loewus F and Murthy P (2000), “Myo-inositol metabolism in plants”, Plant Science 150, pp 1-19 [137.] Lonnerdal B (2002), “Phytic acid-trace element (Zn, Cu, Mn) interactions”, International Journal Food Science Technology 37, pp.749-758 [138] Lopez R.G., Erik S.R (2005), “Environmental physiology of growth and flowering of orchid”, Horticulture Science 40(7), pp 1969-1973 [139] Lou H and Kako S (1994), “Somatic embryogenesis and plant regeneration in cucumber”, Horticulture Science 29, pp 906-909 [140] Madgwick M., Larsen B (1974), “Uronic acid sequence in alginate from different sources”, Carbohydrate Research 32, pp 217-225 [141] Mahendran G., Narmatha Bai V (2012), “Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from seed derived protocorms of Cymbidium bicolor Lindl.”, Scientia Horticulturae 135, pp 40-44 [142] Makowczynska J and Emilia A (2006), “Somatic seeds of Plantago asiatica L.”, Acta societatic Botanicorum Poloniae 75 (1), pp 17 - 21 [143] Malabadi R.B., Teixeira da Silva J.A and Mulgund G.S (2008), “Smokesaturated water influences in vitro seed germination of Vanda parviflora Lindl.”, Seed Science Biotechnology 2(2), pp 65-69 [144] Manning J.C and van Staden J (1987), “The development and mobilization of seed reserves in some African orchids”, Australian Journey of Botany 35, pp 343-353 171 [145] Marcela E.S., Irene A.D., Alonso C.G and Rafael S.G (2010), “Callus growth and plant regeneration in Laelia speciosa (Orchidaceae )”, Lankesteriana 10(1), pp 13-18 [146] Mathur J and Ahuja P (1989), “Propagation of Valeriana wallichii DC Using encapsulated apical and axial shoot buds”, Plant Science 60, pp 111-116 [147] Martin K.P (2003), “Clonal propagation, encapsulation and reintroduction of Ipsea malabarica (Reichb.f.) J.D Hook., an endangered orchid” In vitro Cell Development Biology Plant 39(5), pp 322-326 [148] Martin K.P and Madassery J (2006), “Rapid in vitro propagation of Dendrobium hybrids through direct shoot formation from foliar explants and protocorm-like bodies”, Scientia Horticulturae 108, pp 95-99 [149] Mayer J.L and Carmello-Guerreiro S.M (2011), “Anatomical development of the pericarp and seed of Oncidium flexuosum Sims (Orchidaceae)”, Flora 206, pp 601-609 [150] Merkle S.A., Parrott W.A and Flinn B.S (1995), “Morphogenetic aspects of somatic embryogenesis”, In: In vitro embryogenesis in plants, Thorpe T.A (ed.), Kluwer Academy Publishers, Dordrecht, pp 155-205 [151] Mei T.A., Danial M., Mahmood M and Subramaniam S (2012), “Exquisite protocol of callus induction and protocorm-like bodies (PLBs) regeneration of Dendrobium sonia”, Australian Journal of Crop 6(5), pp 793-800 [152] Michael R.D and Anthony P (2010), Plant cell culture, Wiley Blackwell, John Wiley and Sons, pp 25-60 [153] Miflin B.J., Lea P.J (1980), “Ammonia assimilation”, In: The Biochemistry of plants, Vol 5, Miflin B.J (ed.), Academic Press , New York, USA, pp 169 202 [154] Mishra J., Singh M., Palni L.M.S., Nandi S.K (2011),“Assessment of genetic fidelity of encapsulated micro shoots of Picrorhiza kurrooa”, Plant Cell Tissue Organ Culture 104, pp 181-186 172 [155] Mo L., von Arnold S (1989), “Morphogenic and genetic stability in longterm embryogenesis cultures and somatic embryogenesis of interior spruce (Picea abies (L.) Karst”, Plant Cell Report 8, pp 375 [156] Mohanraj R., Ananthan R and Bai V.N (2009), “Production and storage of synthetic seeds in Coelogyne breviscapa Lindl.”, Asian Journal of Biotechnology 1(3), pp 124-128 [157] Molle F and Dupius J (1993), “Carrot somatic embryogenesis and its application to synthetic seeds”, In: Synseeds, Rendenbaugh K (ed.) CRC Press, Boca Raton, pp 257-270 [158] Molnar S.J (1988), “Nutrient modifications for improved growth of Brassica nigra cell suspension cultures”, Plant Cell Tissue Organ Culture 15, pp 257-267 [159] Morel G (1971), “The principles of clonal propagation of orchids”, In: Corrigan, MJG (ed.), Proceedings 6th World Orchid Conference, pp 101-106 [160] Morel G.M (1960), “Producing virus − free Cymbidium”, American Orchid Society Bulletin 29, pp 495- 497 [161] Morel G.M.(1964), “Tissue culture − A new means of clonal propagation of orchids”, American Orchid Society Bulletin 33, pp 473-478 [162] Muñoz M and Jiménez M (2008), “Capsule development, in vitro germination and plantlet acclimatization in Phragmipedium humboldtii, P longifolium and P pearcei”, Lankesteriana 8(2), pp 23-31 [163] Murdad R., Latip M.A., Aziz Z.A and Ripin R (2010), “Effects of carbon source and potato homogenate on in vitro growth and development of Sabah’s Endangered orchid: Phalaenopsis gigantea”, Aspac Journal Molecular Biology Biotechnology 18 (1), pp.199-200 [164] Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures”, Physiology Plant 15, pp 73-97 [165] Murthy B.N.S., Murch S.J and Saxena P.K (1995), “Thidiazuron-induced somatic embryogenesis in intact seedlings of peanut (Arachis hypogaea): 173 endogenous growth regulator levels and significance of cotyledons”, Physiology Plant 94, pp 268-276 [166] Mweetwa A.M., Welbaum G.E and Tay D (2008), “A preliminary investigation on the effect of seed physiological stage, concentration and duration of exposure to calcium hypochlorite on in vitro germinability and seedling development of Phalaenopsis amabilis orchids”, Acta Horticulture 782, pp 99-106 [167] Na H.Y and Kondo K (1996), “Cryopreservation of tissue-cultured shoot primodia from shoot apices of cultured protocorm in Vanda pumila following ABA preculture and desiccation”, Plant Science 118, pp 195-201 [168] Naing A.H., Chung J.D., Lim K.B (2011), “Plant regeration through indirect somatic embryogenesis in Coelogyne cristata orchid”, American Journal Plant Science 2, pp 262- 267 [169] Narula A., Kumar S and Srivastava P.S (2007),“Genetic fidelity of in vitro regenerants, encapsulation of shoot tips and high diosgenin content in Dioscorea bulbifera L., a potential alternative source of diosgenin”, Biotechnology Letters 29, pp 623-629 [170] Nayak N., Sahoo S., Patnaik S and Rath S (2002), “Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation of Cymbidium aloifolium (L.) Sw and Dendrobium nobile Lindl (Orchidaceae)”, Science Horticulture 94, pp 107-116 [171] Neumann N.H., Kumar A and Imani J (2009), Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, pp 75134 [172] Nhut D.T., Le B.V and Tran Thanh Van K (2001), “Manipulation of the morphogenetic pathways of Lilium longiflorum transverse thin cell layer explants by auxin and cytokinin”, In vitro Cell Development Biology Plant 37, pp 4-49 [173] Nhut D.T., Thuy Tien T.N., Ngoc Huong M.T., Thanh Hien N.T., Huyen P.X., Luan V.Q and Teixeira da Silva (2005), “Aftificial seeds for propagation and preservation of Cymbidium spp.”, Propagation of Ornamental Plants (2), pp 3-9 174 [174] Nhut D.T., Tuyen N.T.T., Duy N and Phan M (2005), “Regeneration and preservation of Phalaenopsis artificial seeds”, Biotechnology Biosystem Engineer 113, pp 11 [175] Nikitcheva Z.I.(2006), Suspensor, In: Seed, Batygina T.B (ed.), Embryology of Flowering Plants, vol 2, Science Publishers, New Hampshire, pp 198-202 [176] .Nipawan J (2008), Vitrification-based cryopreservation of Vanda coerulea Griff Ex Lindl., Mahidol University [177] Nishiwaki M., Fijino K and Masuda K (2000), “Somatic embryogenesis induced by the simple application of abscisis acid to carrot seedlings in cuture”, Planta 211, pp 756-759 [178] Nolan E.K., Irwanto R.R and Rose R.J (2003), ”Auxin up-regulates MtSERK1 expression in both Medicago truncatula root forming and embryogenic cultures”, Plant Physiology 1033, pp 218-230 [179] Norstog K.J (1979), “Embryo culture as a tool in the study of comparative and development morphology” In: Plant cell and tissue culture, Sharp W.R (ed.), Columbus, Ohio State University [180] Olivia A.P and Arditti J (1984), “Seed germination of North American orchids II native California and related species of Aplectrum, Cypripedium, and Spiranthes”, Botanical Gazette 145, pp 495-501 [181] Otvos K and Pasternak T.P (2005), “Nitric oxide is required for and promotes auxin-mediated activation of cell division and embryogenic cell formation but does not influence cell cycle progression in alfalfa cell cultures”, Plant Journal 43, pp 849-860 [182] Owen H.R., Wengerd D and Miller R (1991), “Culture medium pH is influenced by basal medium, carbohydrate source, gelling agent, activated charcoal and medium storage method”, Plant Cell Report 10, pp 583-586 [183] Pamplin E.J and Chapman J.M (1975), “Sucrose suppression of chlorophyll synthesis in tissue cultures”, Journal Experiment Botany 26, pp 212-220 175 [184] Pasternak T.P., Prinsen E., Ayaydin F., Miskolczi P., Potters G., Asard H., Van Onkcelen H.A., Dudits D and Fehér A (2002), “The role of auxin, pH and stress in the activation of embryogenic cell division in leaf protoplast-derived cells of alfalfa”, Plant Physiology 129, pp 1807-1819 [185] Patil V.N and Dadlani M (2009), “Tetrazolium test for seed viability and vigour”, Handbook of seed testing, pp 209-241 [186] Pavallekoodi G., Xavier R., Uma Rani S and Sreeramanan S (2010), “A study on the use of organic additives on the protocorm-like bodies (PLBs) growth of Phalaenopsis violacea orchid”, Journal Phytology 2(1), pp 2075-6240 [187] Poobathy R., Nair H and Sreeramanan S (2009), “Optimisation of Encapsulation-dehydration Protocol for the Orchid Hybrid Ascocenda ‘Princess Mikasa’”, Advances in Environmental Biology 3(1), pp 69-83 [188] Prevost I and Degivry M (1985), “Inverse correlation between ABA content and germinability throughout the maturation and the in vitro culture of the embryo of Phaseolus vulgaris”, Journal Experiment Botany 36, pp 1457 [189] Raemakers C.J.J., Jacobsen E and Visser K.G.F (1995), “Secondary somatic embryogenesis and applications in plant breeding”, Euphytica 81, pp 93-107 [190] Ramon G and Micheal D (2004), “Artificial and natural seed banks differ in seedling emergence patterns”, Weed Science 52(4), pp 531-537 [191] Rao A.N (1977) “Tissue culture in orchids industry”, In: Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell Tissueand Organ Culture, Bajaj Y.P.S., Reinert J (eds.), Springer, Berlin, pp 44-69 [192] Rasmussen H.N (1990), “Cell diferentiation and mycorrhizal infection in Ductylorhiira mujulris (Rchb f) Hunt & Summerh (Orchidacae) during germination in vitro” New Phytology 116, pp 137-147 [193] Reddy M.C., Murthy S.K and Pullaiah T (2012), “Synthetic seeds: A review in agriculture and forestry”, African Journal of Biotechnology 11(78), pp 1425414275 176 [194] Redenbaugh K., Paasch B., Nichol J., Kossler M., Viss P., Walker K (1986), “Somatic seeds: encapsulation of asexual plant embryos”, Biotechnology 4, pp 797801 [195] Redenbaugh K., Slade D., Viss P., Fujii J (1987), “Encapsulation of somatic embryos in synthetic seed coats”, Horticulture Science 22(5), pp 803- 809 [196] Redenbaugh K., Fujii J., Slade D., Viss P., Kossler M (1991), “Artificial seeds–encapsulated somatic embryos”, In: High technology and micropropagation I, Bajaj Y.P.S (ed.), Biotechnology Agriculture Forestry, Springer, Heidelberg Berlin New York 17, pp 395-416 [197] Reinert J and Bajai Y.P (1974), Plant cell tissue and organ culture, Springer-Verlag, Berlinb Heidelberg, Newyork, pp 44-69 [198] Reinhoud P.J (1996), Cryopreservation of tobacco suspension cells by vitrification, Doctoral Paper, Rijks University, Leiden, The Netherlands [199] Roberts D., Fiona B (1993), “Somatic embryogenesis of Spruce”, In: Synseeds, Redenbaugh K (ed.),.CRC Press Inc., pp 428-446 [200] Roy and Banerjee N.(2003), “Induction of callus and plant regeneration from shoot-tip explants of Dendrobium fimbriatum Lindl Var oculatum”, Science Horticulture 97, pp 333-340 [201] Saiprasad G.V.S (2001), “Artificial seed and their applications”, Resonance, pp 39-47 [202] Saiprasad G.V.S and Raghuveer (2003), “Propagation of three orchid genera using encapsulated protocorm-like bodies”, In vitro Cell Development Biology Plant 39, pp 42-48 [203] Saiprasad G.V.S (2008), “Artificial seeds and their applications”, Resonance 6, pp 39-47 [204] Schwarz O.J., Beaty R.M (2000), “Organogenesis”, In: Plant tissue culture concept and laboratories exercises, Trigiano R.N., Gray D.J (eds.) CRC Press, Washington, DC 177 [205] Schenk R.V., Hildebrandt A.C (1972), “Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures”, Canadian Journal Botany 50, pp 199-204 [206] Schmidt E.D., Guzzo F., Toonen M.A and de Vries S.C (1997), “A leucinerich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos”, Development 124, pp 2049-2062 [207] Scowcroft W., Brettel R., Ryan S and David P (1987), “Somaclonal variation and genomic flux”, Plant Cell Tissue Organ Culture, pp 275 [208] Senaratna T., McKersie B.D., Bowley S.R (1990), “Artificial seeds of alfalfa (Medicago sativa L.) Induction of desiccation tolerance in somatic embryos”, In Vitro Cell Development Biology 16, pp 85-90 [209] Senaratna T., Saxena P.K., Rao M V and Atele J (1995), “Significance of the zygotic seed coat on quiescence and desiccation tolerance of Medicago sativa L somatic embryos”, Plant Cell Report 14, pp 375-379 [210] Sharma S.K., Tandon P., Mishra R.R (1991), “Vitamins as related to axenic seed germination and seedling growth of Cymbidium elegans Lindl and Coelogyne punctulata Lindl.”, Journal Orchid Society Indian 5(12), pp 25-28 [211] Sharma S.K and Tandon P (1986), “Influence of growth regulators on asymbiotic germination and early development of Coelogyne punctulata Lindl”, In: Biology, Conservation and Culture of Orchids, Vij S.P (ed.), Affiliated East West Press, New Delhi, India, pp 441-451 [212] Sharma A., Tandon P and Kumar A (1992), “Regeneration of Dendrobium wardianum Warner (Orchidaceae) from synthetic seeds”, Indian Journal Experiment Biology 30, pp 747-748 [213] Sheehan T.J (1983), “Recent advances in botany, propagation, and physiology of orchids”, In: Horticultural Reviews vol 5, Janick J (ed.), A.V.I Publishing Company, Westport, Connecticut, USA, pp 279-315 [214] Singh F (1981), “ Differential staining of orchid seeds for viability testing”, American Orchid Society Bulletin 50, pp 416-418 178 [215] Singh F (1991), “Formation synthetic seeds from protocorm like bodies of Spathoglottis plicata”, Lindleyama 6, pp 61-64 [216] Singh A.K (2006), Flower crops: Cultivation and management, New India Publishing, New Delhi, India, pp 429 [217] Singh M.K., Sherpa A.R., Hallan V and Zaidi A.A (2007), “A potyvirus in Cymbidium spp in northern India”, Australian Plant Diseases Notes 2, pp 11-13 [218] Sinha R.K and Mallick R (1991), “Plantlets from somatic callus tissue of the wood legume Sesbania bispinosa (Jacq.) W.F Wight”, Plant Cell Report 13, pp 247-250 [219] Skoog F., Miller C.O (1957), “Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro”, Sympodium Society Experiment Biology 11, pp 118-140 [220] Smith D.L and Krikorian A.D (1990), “ Somatic proembryo production from excised wounded zygotic carrot embryos on hormone-free medium; evaluation of the effects of pH, ethylene and activated charcoal”, Plant Cell Report 9, pp 3437 [221] Smith C.A and Wood E.J (1996), Cell Biology, Chapman and Hall [222] Srivastava V., Shamshand A., Banerjee S (2009),“An evaluation of genetic fidelity of encapsulated Microshoots of the medicinal plant: Cineraria maritima following six months of storage”, Plant Cell Tissue Organ Culture 99, pp 193-198 [223] Steward F.C and Mapes M.O (1971), “Morphogenesis in aseptic cell cultures of Cymbidium”, Botany Gazette 132, pp 65-70 [224] Sugiyama M (1999), “Organogenesis in vitro”, Current Opinion Plant Biology 2, pp 61-64 [225] Schwarz O.J., Beaty R.M (2000),“Organogenesis”, In: Plant Tissue Culture Concept and Laboratories Exercises, Trigiano R.N., Gray D.J (eds.) CRC Press, Washington, DC [226] Tawaro S., Suraninpong P and Chanprame S (2008), “Germination and regeneration of Cymbidium findlaysonianum Lindl on a medium supplemented 179 with some organic sources”, Walailak Journal Science Technology 5(2), pp 125135 [227] Te-chato S., Kongruk S., Khaimuk W (2010), “Micropropagation of Chang Daeng (Rhynchostylis rubrum) by embryogenic callus”, Journal Agricultural Technology 6(3), pp 589-597 [228] Teixeira da Silva J.A and Nhut D.T (2003), “Cells: functional units of TCLs”, In: Thin cell layer culture system: Regeneration and transformation applications, Nhut D.T., Van Le B., Tran Thanh Van K., Thorpe T (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 65-134 [229] Teixeiva da Silva J.A., Chan M., Sanjaya T., Chai M.L and Tanaka M (2006), “Priming abiotic factors for optimal hybrid Cymbidium (Orchidaceae) PLB and callus induction, plantlet formation, and their subsequent cytogenetic stability analysis”, Science Horticulture 109, pp 368-78 [230] Teixeira da Silva J.A.,Tran Thanh Van K., Biondi S., Nhut D.T and Altamura M.M (2007), “Thin cell layers: Developmental building blocks in ornamental biotechnology”, Floriculture Ornamental Biotechnology 1(1), pp 1-13 [231] Teng W.L (1997), “Activated charcoal affects morphogenesis and enhances sporophyte regeneration during leaf cell suspension culture of Platycerium bifurcatum”, Plant Cell Report 17, pp 77-83 [232] Thorpe T.A (1995), “In vitro embryogenesis in plants, description of somatic-embryo forming single cells in carrot suspension cultures employing video cell tracking”, Planta 194, pp 565-572 [233] Tian C., Chen Y., Zhao X and Zhao L (2008), “Plant regeneration through protocorm-like bodies induced from rhizoids using leaf explants of Rosa spp.”, Plant Cell Report 27, pp 823-831 [234] Tokuhara K and Mii M (2003), “Highly-efficient somatic embryogenesis from cell suspension cultures of Phalaenopsis orchids by adjusting carbohydrate sources”, In Vitro Cell Development Biology Plant 39, pp 635-639 180 [235] Tokuji Y and Kuriyama K (2003), “Involvement of gibberellin and cytokinin in the formation of embryogenic cell clumps in carrot (Daucus carota)”, Journal Plant Physiology 160, pp.133-141 [236] Tony L., Patrice M (2010), “Shoot differentiation from protocorm callus cultures of Vanilla planifolia (Orchidaceae): proteomic and metabolic responses at early stage”, BMC Plant Biology 10, pp 1-34 [237] Turnbull C.G.N (2005), Plant architecture and manipulation, Blackwell Publishing [238] Upatham M and Kamnoon K (2002), “In vitro plant regeneration through embryogenesis and organogenesis from callus culture of Pigeon orchid (Dendrobium cumenatum Sw.)”, Thammasat Intergration Journal Science Technology 7(2), pp 9-17 [239] Utami E.S., Sumardi I and Semiarti E (2007), “The influence of αnaphtaleneacetic acid (α-NAA) on somatic embryogenesis moon orchid Phalaenopsis amabilis (L.)”, Biodiversitas 8, pp 295-299 [240] Van Huylenbroeck J.M and Debergh P.C (1996), “Physiological aspects in acclimatization of micropropagated plantlets”, Plant Tissue Culture Biotechnology 2, pp 136 - 141 [241] Van Waes J and Debergh P.C (1986), “Adaptation of the tetrazolium method for testing the seed viability and scanning electron microscopy of some Western European orchids”, Physiologia Plantarum 66, pp 435-442 [242] Vansveren-Vanespen N (1973), “Effets du saccharose sur le contenu en chlorophylles de protocormes de Cymbidium Sw (Orchidaceae) cultivés in vitro”, Bulletin Society Royal Botany Belgium 106, pp.107-115 [243] Vellupillai M., Swarup S and Goh C.J (1997), “Histological and protein changes during early stages of seed germination in the orchid, Dendrobium crumenatum”, Journal Horticulture Science 72 (6), pp 945-948 181 [244] Vesco L., Guerra M., Dal-Vesco L (2001), “The effectiveness of nitrogen sources in Feijoa somatic embryogenesis”, Plant Cell, Tissue and organ culture 64, pp 19-25 [245] Veyret Y (1985), “Development of the embryo and the young seedling stages of Orchids”, In: The orchids scientific studies, Withner C.L., ), Robert E (eds.), Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, pp 223-267 [246] Vij S.P (1986), “Studies on growth and development of Cymbidium aloifolium Sw seedlings in vitro”, Conservation and culture of orchids, pp 423427 [247] Vij S.P (1995), “Genetic resources of orchid”, In: Avances in Horticulturevol 12- Ornamental plants, Chadha K L., Bhattacharjee S.K (eds.), Malhotra Publising House, New Delhi, India, pp 153-181 [248] Vij S.P (2002), “Orchids and tissue culture current status in role of plant tissue culture in biodioversity conservation and economic development”, edicted by Nandi S.K., Padni L.M., Prakasan, India, pp 491 [249] Von Arnold S., Sabala I., Bozhkov P., Dyachok J and Filonova L (2002), “Developmental pathways of somatic embryogenesis”, Plant Cell Tissue Organ Culture 69 pp 233-249 [250] Vujanovic V., Arnaud M., Barabé D and Thibeault G (2000), “Viability testing of orchid seed and the promotion of colouration and germination”, Annual Botany 86, pp 79-86 [251] Wang R., Guegler K and La Brie S.T (2000), “Genomic analysis of a nutrient response in Arabidopsis reveals divers expression patterns and novel metabolic and potential regulatory genes induced by nitrate”, Plant Cell 12, pp 1491-1510 [252] Wann S.R., Veazey R.L and Kaphammer J (1997), “Activated charcoal does not catalyze sucrose hydrolysis in tissue culture media during autoclaving”, Plant Cell Tissue Organ Culture 50, pp 221-224 182 [253] Weatherhead M.A., Bardon J and Henshaw G.C (1978), “Some effects of charcoal as an additive to plant tissue culture media”, Zenith Pflanzenphysiology 89, pp 141-147 [254] Wimber D.E (1963), Cytogenetic studies in the genus Cymbidium, CGU theses and dissertations Claremont Graduate university [255] Withner C.L (1985), “The orchids - scientific studies”, Robert E Krieger Publishing Company, Malabar, Florida [256] Wood H.N and Braun A.C (1961), “Studies on the regulation of certain essential biosynthetic systems in normal and crowngall tumor cells”, Procamble Natural Academy Science USA 47, pp 1907-1913 [257] Yam T.Y., Ernst R., Arditti J.and Nair H (1990), “Charcoal in orchid seed germination and tissue culture media: a review”, Lindleyana 5, pp 256-265 [258] Ye X.L., Zee S.Y and Yeung E.C (1997), “Suspensor development in Nun orchid, Phaius tankerilliae”, International Journal Plant Science 158, pp 704-712 [259] Yeung E.C., Zee S.Y and Ye X.L (1996), “Embryology of Cymbidium sinense: Embryo development”, Annual Botany 78, pp 105-110 [260] Yeung E.C., Radman R.H and Thorpe T.A (1996), “Comparative development of zygotic and microspore-derived embryos in Brassica napus”, International Journal Plant Science 157, pp 27-39 [261] Yong W.H., Ge L and Yan F (2009), “The chemical composition and biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water”, Molecules 14, pp 5144-5164 [262] You C.B., Chen Z.L and Ding Y (1992), “Practical application of somatic embryogenesis synthetic seed` system”, Biotechnology in Agricultural Procamble First Asia Pacific conferenceon Agricultural Biotchnology, Beijing, China, 20-24 August, pp 305-308 [263] Yu Y., Liu L., Liu J and Wang J (2009), “Plant regeneration by callusmediated protocorm-like body induction of Anthurium andraeanum”, Horticulture Agricutural Science China 8, pp 572-577 183 [264] Zaghmout O.M.F and Torello W.A (1988), “Enhanced regeneration in longterm callus culture of red fescue by pretreatment with activated charcoal”, Horticulture Science 23, pp 615-616 [265] Zhan Y., Wang L., Chen S., Yang Y., He S (2009), “Effect of microenvironment control on the photoautrophic growth of plantlet in sugar-free tissue culture of Pinellia ternate (Thunb.) Breit”, Journal Yunnan Agricultural, pp 4-10 [266] Zheng L.M and Pang J.L (2006), “In vitro flowering of cultures from a hybrid of Cymbidium goeringii and C hybridium”, Agricutural Science China 32(3), pp 320-327 [267] Ziv M (1995), “The control of bioreacter environment for plant propagation in liquid culture”, Acta Horticulture 393, pp 25 - 38 [268] Zouine J and Hadrami I (2007),“Effect of 2,4-D, glutamine and BAP on embryogenic suspension culture of date palm (Phoenix dactylifera L.)”, Science Horticulture 112(2), pp 221-226 Internet [269] http://www.tnau.ac.in/notesbscag/notestry/abt401/tissue_culture.doc [270] Orchids.wikia.com 184 [...]... thiết khác cho hạt nảy mầm và phát triển 3 Đối với một số loại cây trồng, việc sản xuất hạt nhân tạo đơn phôi là rất cần thiết 4 Hạt nhân tạo có thể được gieo trồng bằng các thiết bị cơ giới hiện đại Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất hạt nhân tạo Sản xuất hạt nhân tạo là một phương pháp thu nhiều lợi nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thông qua sự phát sinh phôi sinh dưỡng Hạt có thể được... sativa) bằng lớp vỏ hydrogel Từ lúc này, vỏ bọc hydrogel được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất hạt nhân tạo [113], [195] Mô phỏng cấu tạo của hạt tự nhiên, hạt nhân tạo cũng bao gồm “nội nhũ” thường được tạo từ các chất dinh dưỡng giúp phôi phát triển, các loại hydrogel như alginate, agar… và phần “phôi” đến từ bất kỳ mô, cơ quan hay phôi sinh dưỡng nào có khả năng tái tạo cơ thể hoàn chỉnh của cây. .. [168] 1.4 HẠT NHÂN TẠO 1.4.1 Khái niệm về hạt nhân tạo (artificial seed) Hạt tổng hợp (synthetic seed) hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ dùng để đề cập đến phôi sinh dưỡng được bọc bởi lớp vỏ bọc, có thể bảo quản và vận chuyển, được gieo trồng, phát triển thành cây trong các điều kiện in vitro hay ex vitro Như vậy, đây là dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên [194] Tuy nhiên, không nên lầm lẫn thuật ngữ hạt tổng... công nghệ hạt nhân tạo bởi vì ứng dụng thương mại của sự phát sinh phôi sinh dưỡng đòi hỏi hạt được sản xuất trong những thiết bị có thể tích lớn Việc trữ lạnh hạt cũng rất quan trọng đối với khả năng sống sót và khả năng nảy mầm của hạt sau quá trình trữ lạnh Hạt nhân tạo cũng có thể cung cấp nguồn giống cho những dạng thực vật mới - những cây chuyển gene, cây không hạt, cây đa bội - được tạo ra từ... - được tạo ra từ sự tiến bộ của công nghệ sinh học [193], [201], [203] 1.4.2 Các phương pháp tạo hạt nhân tạo Cho đến nay, có hai loại hạt nhân tạo được đề cập: hạt làm khô và hạt hydrat Hạt nhân tạo làm khô được sản xuất từ phôi sinh dưỡng trần hay phôi được bọc bằng polyox, một loại polymer tổng hợp rồi làm khô Trên đối tượng cà rốt cho thấy, phôi sinh dưỡng ở hạt nhân tạo làm khô dễ bị tổn thương... tây, cà rốt [113] Hạt hydrat có lớp vỏ bọc phôi sinh dưỡng bằng các chất ưa nước hydrogel như alginate, sau đó, có thể được ngâm trong dung dịch để bảo quản Đa số hạt nhân tạo thường áp dụng theo loại hạt này như: chuối, dâu tằm, cỏ linh lăng, các loài lan [92] Quá trình tạo hạt nhân tạo gồm các bước sau: 32 Hình thành phôi sinh dưỡng sinh dưỡng trưởng thành sản xuất hạt nhân tạo nhân phôi chuẩn hoá... và tạo ra các cây con đồng dạng Đây là kỹ thuật phục vụ thiết thực cho việc sản xuất thương mại một số dạng cây vô tính [28] Hạt nhân tạo có nhiều ưu điểm như: nhân giống đồng nhất, dễ dàng vận chuyển và bảo quản giống lâu dài, có tiềm năng nhân giống với số lượng lớn và giá cả sản xuất thấp [79], [112] Ziv [267] đề nghị tự động hóa toàn bộ quy trình sản xuất hạt nhân tạo Đây cũng là một thuận lợi của. .. Phytin chứa phosphate và các ion trong quá trình trao đổi chất của cây Trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, phytin được tiêu hóa bởi enzyme phosphatase gọi là phytase để giải phóng phosphate, các cation và inositol được dùng cho cây con Việc tích lũy phytin trong suốt giai đoạn sớm của sự phát triển hạt đóng vai trò không chỉ sau khi hạt nảy mầm mà còn trong suốt quá trình phát triển hạt. Vì vậy, myo-inositol... phôi sinh dưỡng thành cây Nồng độ sucrose 9% sẽ làm giảm sự chuyển đổi Ảnh hưởng thẩm thấu của nồng độ đường cao có thể làm tổn hại đến phôi [71] 1.4.2.2 Phương pháp bọc hạt Ngoài mầm hạt phôi sinh dưỡng, vỏ bọc cho hạt nhân tạo cũng rất quan trọng trong việc tạo hạt nhân tạo Vỏ bọc vừa là nơi phôi được bảo vệ, vừa có thể dự trữ chất dinh dưỡng để phôi nảy mầm và chuyển đổi thành cây con có sức sống... lẫn thuật ngữ hạt tổng hợp” với hạt có tính thương mại của cây trồng có chọn giống được định nghĩa như là một thế hệ ưu thế của quần thể được thụ phấn bao gồm một nhóm các dòng lai cận huyết hay các dòng lai khác dòng được chọn lọc [201] 30 Khái niệm về hạt nhân tạo với vỏ bao bọc phôi sinh dưỡng đã được Murashige đề cập đầu tiên vào năm 1977 Từ việc tạo hạt nhân tạo làm khô cho phôi sinh dưỡng cà ...5 Nghiên cứu khả sống sót nảy mầm hạt nhân tạo địa lan điều kiện in vitro ex vitro Nghiên cứu biện pháp bảo quản thích hợp hạt nhân tạo địa lan Nghiên cứu khả sống sót nảy mầm hạt nhân tạo địa. .. sinh dưỡng PLB địa lan, yếu tố hình thành nhân phôi việc tạo bảo quản hạt nhân tạo từ phôi địa lan mà lần nghiên cứu cách hệ thống Về mặt thực tiễn, việc tạo bảo quản hạt nhân tạo đưa hướng sản... liệu việc tạo hạt nhân tạo địa lan Nghiên cứu cách hệ thống hình thành nuôi trồng hạt nhân tạo địa lan Sự hình thành phôi sinh dưỡng, đặc biệt hình thành phôi sinh dưỡng họ Lan (Orchidaceae) với