nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án:  các loài .   , (HNT)    cây  Ý nghĩa khoa học:  HNT    HNT  . Ý nghĩa thực tiễn: , HNT                 ,   Những đóng góp mới của luận án: Nghiê   HNT  g ,   HNT  Mục tiêu đề tài: T -like body (PLB)                 phôi sinh        HNT    in vitro và ex vitroHNT in vitro và ex vitro. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu 2 Đối tượng:   (Cymbidium Madrid  )  Nội dung nghiên cứu:  ,  ành,    ,  và HNT. Thời gian nghiên cứu đề tài0/2012. Bố cục của luận án:    2       3 trang, 1 , 31  26 hình  9  2  CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ,       Begum A. (và cs.)  Huan L. và cs.   Cymbidium        minh các PLB này  HNT (Corrie S. and Tandon P., 1993; Tawaro S. và cs., 2008)  làHNT (Nhut và cs., 2005, Tiên và cs., 2011). CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU 3 Vật liệu nuôi cấy ban đầu: 60 ngày   Cymbidium        - 10 cm, n,    Vật liệu tạo phôi sinh dƣỡng:       Môi trƣờng nuôi cấy in vitro: S        () (-NAA, BA, ABA, kinetin).   pH , HNT     C, 1 atm. Vật liệu tạo HNT:  , sodium alginate và d 2 .2H 2 O. Vật liệu nuôi trồng HNT ex vitro:   Địa điểm thí nghiệm:        ,   PHƢƠNG PHÁP 2.1. Tách và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo các PLB, nhân các PLB để làm vật liệu tạo mô sẹo. 2.2. Tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi:  (lTCL) có      TTV -naphtaleneacetic acid (-NAA) và 6- - . 4 2.3. Khảo sát các yếu tố nhƣ môi trƣờng nuôi cấy, than hoạt tính (AC) lên sự tăng sinh mô sẹo. 2.4. Khảo sát các yếu tố nhƣ sucrose, than hoạt tính, glutamin, pH và acid abscisic lên sự hình thành và phát triển phôi từ mô sẹo. 2.5. Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẩu học:  ,   và  minh  phôi sinh , HNT. 2.6. Khảo sát khả năng tạo HNT:  + và Ca 2+  và  2 .2H 2 O  ,  Cl 2 .2H 2 này  HNT, ,  các c  (-NAA, AC, sucrose) lên HNT. 2.7. Nuôi cấy HNT trên các giá thể , in vitro. 2.8. Nuôi cấy thoáng khí giảm sucrose hoặc không bổ sung sucrose  HNT  2.9. Nuôi cấy trực tiếp HNT một lớp vỏ và hai lớp vỏ trong điều kiện ex vitro  HNT  2.10. Bảo quản HNT: K               tryphenyltetrazolium chloride  5 n ,  ô  + cho TTC ). 2.11. NHNT in vitro và ex vitro   HNT. 2.12. So sánh  HNT in vitro  2.13 HNT  ngày (ngay sau khi  2.14.  HNT  in vitro  2.15. S : và              tistical Program Scientific System) 16.0. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu PLB địa lan “Xanh Chiểu” 3.1.1. Tạo PLB qua nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng: 58,33%, t PLB,    -NAA và 0,1 mg/l kinetin. 3.1.2. Ảnh hƣởng của cách cắt PLB lên sự nhân PLB từ đỉnh sinh trƣởng:                 (52,67 mg). 6 3.2. Tạo mô sẹo và phôi sinh dƣỡng địa lan “Xanh Chiểu” 3.2.1. Tạo mô sẹo Ảnh hƣởng của α-NAA và BA lên sự tạo mô sẹo từ các lTCL của PLB khi nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy khác nhau Bảng 3.3. -   30 ngày . CĐHSTTV (mg/l) Phát sinh hình thái của các lát mỏng PLB Trong điều kiện sáng (%) Trong điều kiện tối (%) α- NAA BA Mô sẹo PLB Mô sẹo PLB 0,0 0,0 0,00 ± 0,00 e * 70,33 ± 3,18 c * 0,00 ± 0,00 f 61,33 ± 2,67 f 0,1 0,0 0,00 ± 0,00 e 94,00 ± 2,31 a 0,00 ± 0,00 f 91,67 ± 0,88 a 0,5 0,0 0,33 ± 0,33 e 90,00 ± 2,89 ab 0,33 ± 0,33 f 85,00 ± 2,08 abcd 1,0 0,0 11,67 ± 2,33 d 82,33 ± 1,20 b 8,33 ± 1,45 e 75,33 ± 1,20 de 0,0 0,1 0,00 ± 0,00 e 94,00 ± 2,08 a 0,00 ± 0,00 f 91,33 ± 0,88 a 0,1 0,1 7,33 ± 2,03 de 86,00 ± 3,06 ab 8,33 ± 0,88 e 80,67 ± 4,81 bcde 0,5 0,1 48,33 ± 3,53 a 46,33 ± 2,40 e 34,67 ± 3,18 a 59,33 ± 5,49 f 1,0 0,1 35,00 ± 4,00 b 56,00 ± 2,08 d 29,00 ± 3,06 b 58,67 ± 8,41 f 0,0 0,5 1,67 ± 1,20 e 93,67 ± 1,86 a 1,67 ± 1,67 f 89,33 ± 2,33 abc 0,1 0,5 0,33 ± 0,33 e 92,67 ± 1,86 a 2,00 ± 1,00 f 80,00 ± 0,58 cde 0,5 0,5 7,67 ± 2,96 de 84,00 ± 3,21 ab 12,33 ± 0,88 de 80,00 ± 1,73 cde 1,0 0,5 19,00 ± 3,46 c 71,33 ± 5,93 c 11,67 ± 1,20 de 72,33 ± 1,76 e 0,0 1,0 0,00 ± 0,00 e 91,33 ± 1,45 ab 0,00 ± 0,00 f 89,33 ± 2,33 abc 0,1 1,0 0,00 ± 0,00 e 93,33 ± 2,33 a 0,00 ± 0,00 f 91,00 ± 2,08 ab 0,5 1,0 18,67 ± 4,26 c 68,67 ± 1,86 c 13,33 ± 1,86 d 76,00 ± 3,06 de 1,0 1,0 19,00 ± 2,89 c 66,00 ± 6,08 c 18,67 ± 1,20 c 62,00 ± 1,15 f *Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P = 0,05 bằng phép thử Duncan. C B 7 Trong điều kiện nuôi cấy có ánh sáng: -NAA     vàng ,  Trong điều kiện nuôi cấy hoàn toàn tối:   , ,   3.2.2. Tăng sinh mô sẹo địa lan “Xanh Chiểu” Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lên sự tăng sinh mô sẹo Bảng 3.4.   . Môi trƣờng nuôi cấy Khối lƣợng tƣơi (mg) Tỷ lệ tăng trƣởng MS + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA (M1) 215,27 ± 16,57 d * 5,38 ± 0,41 d MS + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA, 0,2 g/l glutamine (M2) 361,28 ± 23,13 c 9,03 ± 0,58 c MS + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA, 20% (v/v) CW (M3) 505,32 ± 54,59 b 12,63 ± 1,37 b SH + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA (M4) 379,12 ± 19,25 bc 9,48 ± 0,48 bc SH + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA, 0,2 g/l glutamine (M5) 668,00 ± 29,92 a 16,70 ± 0,75 a SH + 50 g/l sucrose, 2 g/l AC, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l BA, 20% (v/v) CW (M6) 486,42 ± 64,70 bc 12,16 ± 1,62 bc *Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P = 0,05 bằng phép thử Duncan.             8                 AC, 50 g/l sucrose, 0,5 mg/l -NAA, 0,1 mg/l  Ảnh hƣởng của nồng độ AC lên sự tăng sinh mô sẹo:  AC . 3.2.3. Hình thành phôi sinh dƣỡng từ mô sẹo Ảnh hƣởng của sucrose lên sự phát sinh phôi sinh dƣỡng từ mô sẹo địa lan “Xanh Chiểu” Bảng 3.6. sucrose phôi   Nồng độ sucrose (g/l) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu tạo phôi (PLB) (%) Số phôi (PLB)/ mẫu Khối lƣợng của PLB từ phôi (mg) 30 ngày 60 ngày 30 ngày 60 ngày Tƣơi Khô 0 0,00 ± 0,00 c * 0,00 ± 0,00 c 97,00 ± 1,00 a 97,00 ± 1,00 b 13,18 ± 2,66 b 245,02 ± 83,09 c 21,66 ± 7,16 c 30 44,00 ± 6,00 b 0,00 ± 0,00 c 56,00 ± 6,00 b 100,00 ± 0,00 a 89,25 ± 0,81 a 1208,70± 120,06 b 107,50 ± 7,96 b 50 92,33 ± 1,76 a 9,33 ± 1,45 b 7,67 ± 1,76 c 90,67 ± 1,45 c 90,90 ± 1,71 a 1684,40 ± 62,92 a 164,08 ± 8,92 a 70 83,00 ± 3,21 a 80,00 ± 4,04 a 0,00 ± 0,00 c 0,00 ± 0,00 d 0,00 ± 0,00 c 0,00 ± 0,00 c 0,00 ± 0,00 c *Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P = 0,05 bằng phép thử Duncan.                   50 g/l sucrose, sau 30 ngày   9 au 60 ngày   90,9).    mg 60 ngày  Ảnh hƣởng của glutamine lên sự hình thành và nhân phôi sinh dƣỡng từ mô sẹo:    glutamin               a các phôi: 1706,80; 160,67 mg). Ảnh hƣởng của AC lên sự hình thành và nhân phôi sinh dƣỡng từ mô sẹo: AC , ,     AC   phôi,               Ảnh hƣởng của pH lên quá trình hình thành phôi sinh dƣỡng: S     Ảnh hƣởng của ABA trong sự phát triển của phôi sinh dƣỡng:      (PLB 10 Cho dù có  . Tái sinh cây:  100  và  AC          120 ngày     in vitro bình . phát sinh phôi  sau này. 3.2.4. . Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẩu học             5.       TTV,    [...]... NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu các giải pháp để gia tăng th i gian bảo quản hạt nhân tạo địa lan - Tiếp tục nghiên cứu các giải pháp để làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo địa lan trong điều kiện ex vitro sau bảo quản - Tiếp tục theo dõi sự phát triển của những cây từ hạt nhân tạo địa lan và khảo sát sự ra hoa của những cây này - Khảo sát các biến đổi về kiểu gen (nếu có) của hạt nhân tạo sau bảo quản... chuẩn hóa một số thông số của hạt nhân tạo ứng dụng trong công tác nhân giống và bảo quản cây địa lan (Cymbidium sp.)”, Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học 8(3B), trang 1381-1388 3 Trần Thị Ngọc Lan, Hoàng Văn Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Du Sanh và Dương Tấn Nhựt (2011), Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (Cymbidium Madrid “Forest King”) phục vụ công tác nhân giống và bảo quản, Tạp... thêm về sự ổn định di truyền từ những cây này 5 Hạt nhân tạo, hình thành với vỏ bọc là môi trư ng MS bổ sung 40 g/l sodium alginate và tạo hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O trong 30 phút, đạt tỷ lệ nảy mầm là 95,56% khi nuôi cấy hạt trong điều kiện in vitro 6 Nuôi cấy hạt nhân tạo trong điều kiện in vitro Hạt nhân tạo địa lan có nồng độ 40 g/l sodium alginate trong vỏ hạt khi nuôi cấy thoáng khí với việc... khi nuôi cấy trong điều kiện in vitro Hạt 24 nhân tạo 2 lớp vỏ sau bảo quản 180 ngày cũng trong điều kiện tương tự cho tỷ lệ nảy mầm là 23,33% khi nuôi trồng trong điều kiện ex vitro 10 Nghiên cứu sự sinh trưởng của cây địa lan từ hạt nhân tạo và từ cây nuôi cấy vi nhân giống thông thư ng cho thấy không có biến đổi về kiểu hình nào được ghi nhận từ các cây này Những cây này có chiều cao chồi và chiều... bảo quản 180 ngày vẫn có khoảng 23,33% hạt nảy mầm tuy tỷ lệ nảy chồi và ra rễ giảm (19,67% và 6,67%) 3.3.5 So sánh kiểu hình và sự sinh trƣởng của cây địa lan “Xanh Chiểu” từ hạt nhân tạo và từ cây nuôi cấy in vitro Từ việc quan sát khả năng hình thành chồi và rễ từ hạt nhân tạo và từ cây vi nhân giống in vitro thông thư ng cho thấy sự hình thành chồi và rễ của HNT có chậm hơn Từ giai đoạn PLB đến... trồng thì kiểu hình, chiều cao của chồi, rễ, hình dạng lá và hình dạng rễ của ba loại trên là như nhau Bảng 3.31 Sự sinh trưởng của các loại cây địa lan “Xanh Chiểu” sau 90 ngày nuôi trồng (phụ lục 2.29, 2.30) Loại cây nguồn gốc từ Chỉ tiêu xác định Vi nhân giống thông thƣờng Hạt nhân tạo in vitro Hạt nhân tạo ex vitro Chiều cao cây (mm) 42,21± 2,57ª* 15,23 ± 0,97b 9,88 ± 0,75b Chiều dài rễ (mm) 19,95... Như vậy, hạt nhân tạo địa lan “Xanh Chiểu” với vật liệu là phôi sinh dưỡng đã thể hiện ưu thế của phôi sinh dưỡng với tỷ lệ sống sót, sinh trưởng cao cả trong điều kiện in vitro và ex vitro Đây cũng là điều kiện cần thiết để sản xuất thành công hạt nhân tạo Việc không sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong các thí nghiệm nuôi trồng hạt nhân tạo đã nói lên tiềm năng sinh trưởng độc lập của phôi... về hình thái của những cây có nguồn gốc từ phôi so với cây nhân giống in vitro bình thư ng sau 270 ngày nuôi trồng Các phôi sinh dưỡng hình thành từ mô sẹo có triển vọng trong việc nhân giống địa lan do phôi sinh dưỡng có khả năng biệt hóa thành cây mà không cần trải qua các công đoạn cắt, nhân chồi, ra rễ như quá trình nhân giống in vitro bình thư ng Tuy 23 nhiên, cũng cần có sự nghiên cứu thêm về... cứu này là mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Nhưng nếu nhân PLB từ PLB thì một số PLB có thể hình thành các PLB mới dính nhau và phải cần qua các công đoạn cắt, dãn, nhân chồi, ra rễ mới hình thành cây con 3.3 Sự hình thành và nuôi trồng, bảo quản hạt nhân tạo địa lan “Xanh Chiểu” 3.3.1 Sự hình thành hạt nhân tạo 12 3.3.1.1 Khả năng sinh trƣởng của HNT trong điều kiện nuôi cấy in vitro với phôi ở các... nồng độ đư ng (10 g/l sucrose) là thích hợp cho sự nảy mầm và hình thành cây con với tỷ lệ nảy chồi và tỷ lệ ra rễ tương ứng lần lượt là 88,67% và 76% Cây con từ hạt nhân tạo sinh trưởng tốt và có khả năng thích nghi với 100% cây sống sót khi được nuôi trồng trong tự nhiên 7 Nuôi cấy hạt nhân tạo trong điều kiện ex vitro Hạt nhân tạo hai lớp vỏ alginate được xem là phù hợp với khả năng sống sót và thích . 3.3. Sự hình thành và nuôi trồng, bảo quản hạt nhân tạo địa lan “Xanh Chiểu” 3.3.1. Sự hình thành hạt nhân tạo 12 3.3.1.1. Khả năng sinh trƣởng của HNT trong điều kiện nuôi cấy in vitro.   3.3.5. So sánh kiểu hình và sự sinh trƣởng của cây địa lan “Xanh Chiểu” từ hạt nhân tạo và từ cây nuôi cấy in vitro  in. gian bảo quản (ngày) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Tỷ lệ hạt nảy chồi (%) Tỷ lệ hạt ra rễ (%) Sự sinh trƣởng của hạt nhân tạo Chiều cao chồi (mm) Chiều dài rễ (mm)