Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocom của loài lan sơn thủy tiên (dendrobium chrysotoxum)

1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VI THỊ MINH HUỆ NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ CẢM ỨNG TẠO PROTOCOM CỦA LỒI LAN SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Sinh học Phú Thọ, 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VI THỊ MINH HUỆ NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ CẢM ỨNG TẠO PROTOCOM CỦA LỒI LAN SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sƣ phạm Sinh học NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS TRẦN TRUNG KIÊN Phú Thọ, 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu hoàn thành khóa luận, em nhận đƣợc giúp đỡ ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, tồn thể thầy giáo khoa Khoa học tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ để em nghiên cứu thực khóa luận Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo hƣớng dẫn TS.Trần Trung Kiên tận tình hƣớng dẫn, quan tâm động viên em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Trung tâm nghiên cứu công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng tận tình giúp đỡ, bảo giúp em hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Phú Thọ, tháng năm 2017 Sinh Viên Vi Thị Minh Huệ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP CT KC MS NAA NXB MT ½ MS Benzylaminopurine Cơng thức Mơi trƣờng Knudson C Môi trƣờng Murashige and Skoog Naphthalene Acetic Acid Nhà xuất Mơi trƣờng Mơi trƣờng ½ Murashige & Skoog iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Một số loại hóa chất thƣờng dùng khử trùng bề mặt mẫu cấy Số lƣợng mẫu nhiễm công thức khử trùng Bảng 3.2 Số lƣợng mẫu nhiễm công thức khử trùng 23 Bảng 3.3 Số lƣợng mẫu nhiễm công thức khử trùng 23 Bảng 3.4 Số lƣợng mẫu nhiễm công thức khử trùng 24 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống 25 Bảng 1.1 23 hạt lan Sơn Thủy Tiên sau tuần nuôi cấy Bảng 3.6 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 29 môi trƣờng MT1 Bảng 3.7 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 29 môi trƣờng MT2 Bảng 3.8 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 30 môi trƣờng MT3 Bảng 3.9 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 30 môi trƣờng MT4 Bảng 3.10 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 31 môi trƣờng MT5 Bảng 3.11 Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên công thức 31 môi trƣờng MT6 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến tỷ lệ tạo 32 protocom Bảng 3.13 Đặc điểm chiều cao chồi lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển 37 iv Bảng 3.14 Số lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần 39 cấy chuyển Bảng 3.15 Số rễ lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển 40 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium Chrysotoxum) 17 Hình 2.2 Qủa lan Sơn Thủy Tiên 17 Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hƣởng hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống 25 hạt lan Sơn Thủy Tiên sau tuần nuôi cấy Hình 3.2 Mẫu tái sinh sau tuần ni cấy 27 Hình 3.3 Mẫu nhiễm sau tuần ni cấy 28 Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hƣởng mơi trƣờng ni cấy đến tỷ lệ tạo protocom 33 Hình 3.5 Hình thái protocom sau tuần ni cấy 34 Hình 3.6a Hình thái protocom ni cấy MT1, MT2, MT3 sau 35 tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi Hình 3.6b Hình thái protocom ni cấy MT4, MT5, MT6 sau tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi Hình 3.7 Biểu đồ chiều cao trung bình chồi lan Sơn Thủy Tiên 36 38 môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Hình 3.8 Biểu đồ số trung bình lan Sơn Thủy Tiên 39 mơi trƣờng sau tuần cấy chuyển Hình 3.9 Biểu đồ số rễ trung bình lan Sơn Thủy Tiên 41 môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Hình 3.10 Chồi lan Sơn Thủy Tiên sau tuần theo dõi 42 vi MỤC LỤC PHẦN 1:MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh học sinh thái học loài lan Sơn Thủy Tiên 1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học 1.2 Kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cơ sở lý luận nuôi cấy mô tế bào 1.2.3 Ưu điểm, nhược điểm phương pháp nhân giống in vitro 1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro 1.3 Một số nghiên cứu nhân giống hoa lan giới Việt Nam 10 1.3.1 Trên giới 10 1.3.2 Ở Việt Nam 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 vii 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 17 2.3.2 Phương pháp luận 17 2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17 2.3.4 Phương pháp thu thập số liệu 19 2.3.5 Phương pháp phân t ch v l số liệu 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất khử trùng tới tỷ lệ tạo mẫu in vitro 21 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến khả tạo protocom 27 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng giai đoạn tạo chồi 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .44 PHẦN 1: MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Phong lan đƣợc biết đến loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa, thƣờng đƣợc dùng làm cảnh trang trí, số lồi có tác dụng chữa bệnh Lan Hồng Thảo (Dendrobium) chi lớn họ Lan (Orchidaceae) có khoảng 1400 lồi, Việt Nam có 107 lồi, phân bố vùng núi từ Bắc vào Nam số đảo ven biển [2] Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum), thuộc chi Hoàng Thảo, loài lan rừng Việt Nam phân bố chủ yếu Tây Ngun [5] Hoa có hình thái đẹp, hƣơng thơm nhẹ nhàng, tƣơi mát, dễ chăm sóc, số loài lan Hoàng Thảo đƣợc ƣa chuộng Hiện loài lan tự nhiên bị suy giảm nghiêm trọng khai thác để trồng, bán làm cảnh, làm thuốc chặt phá rừng gây hủy hoại nơi cƣ trú Để hạn chế việc khai thác mức lan Sơn Thủy Tiên tự nhiên nhƣ để bảo tồn loài lan này, việc nhân giống công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) đƣợc quan tâm Công nghệ nhân giống in vitro công cụ đắc lực việc bảo tồn phát triển loài lan quý Phƣơng pháp mang lại nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, tạo đồng mặt di truyền, bệnh, đồng thời có tiềm sinh học cao Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu (khử trùng) cảm ứng tạo protocom (mô sẹo) thơng qua mơi trƣờng khác lồi lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) cơng trình nghiên cứu [9;10] Tại Việt Nam chƣa có đề tài nghiên cứu, so sánh tạo vật liệu khởi đầu cảm ứng tạo protocom thông qua môi trƣờng khác loài lan Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cảm ứng tạo protocom loài lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum)” 34 MT1 MT2 MT3 Hình 3.6a: Hình thái protocom ni cấy MT1, MT2, MT3 sau tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi 35 MT4 MT5 MT6 Hình 3.6b: Hình thái protocom nuôi cấy MT4, MT5, MT6 sau tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi 36 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng giai đoạn tạo chồi Sau giai đoạn tạo protocom giai đoạn tạo chồi Để thu đƣợc in vitro hoàn chỉnh đồng thời cung cấp nguyên liệu cho trình nhân nhanh chồi trƣớc hết thể chồi tạo cần đƣợc chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi nhằm kích thích tạo chồi từ protocom Qua tham khảo tài liệu chọn môi trƣờng MS Trên sở để tìm ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng giai đoạn tạo chồi hạt lan Sơn Thủy Tiên có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng BAP với nồng độ khác (1,5mg/l; 2mg/l 2,5mg/l) Bảng 3.13: Đặc điểm chiều cao chồi lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Chỉ tiêu Cơng thức Bình1 MTa Bình Bình Bình MTb Bình Bình Bình Bình MTc Bình Bình2 Bình3 Bình4 Chiều cao Trung bình chồi (mm) 7,56 6,23 8,43 8,65 6.69 9,49 10,41 9,82 10,3 7,32 6,68 9,04 7,72±0,95 9,1±1,43 8,34±1,43 37 9.5 9.1 8.5 8.34 Chiều cao trung bình (mm) 7.72 7.5 MTa MTb MTc Hình 3.7: Biểu đồ chiều cao trung bình chồi lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Qua bảng 3.13 biểu đồ 3.3 ta thấy cơng thức ni cấy chiều cao chồi có giao động tƣơng đối lớn (từ 6,23mm đến 10,41mm) Ở cơng thức MTa chồi có chiều cao trung bình 7,72mm ±0,95, thấp công thức nuôi cấy Chiều cao trung bình chồi có giá trị cao công thức MTb (9,1mm ±1,43) Ở công thức MTc chiều cao trung bình chồi 8,34mm±1,43 38 Bảng 3.14: Số lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Chỉ tiêu Số lá/chồi Trung bình Cơng thức Bình MTa 2,5 Bình 2 Bình 3 Bình Bình MTb 3,25 Bình Bình Bình Bình MTc 2,75 Bình 2 Bình Bình (đơn vị: lá) 3.5 3.25 2.75 2.5 2.5 số (lá) 1.5 0.5 MTa MTb MTc Hình 3.8: Biểu đồ số trung bình lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển 39 Từ bảng 3.14 biểu đồ 3.4 ta thấy chồi cơng thức MTb có số đồng nhiều nhất, số trung bình cơng thức 3,25 lá/chồi Ở cơng thức MTa, chồi có tƣơng đối đồng nhƣng số ít, trung bình có 2,5 lá/chồi Ở cơng thức MTc số trung bình có lớn cơng thức MTa (2,75 lá/chồi) nhƣng số chồi lại không đồng Bảng 3.15: Số rễ lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Chỉ tiêu Công thức Bình MTa Bình Bình Bình Bình MTb Bình Bình Bình Bình MTc Bình Bình Bình (đơn vị: rễ) Số rễ/chồi Trung bình 4 5 4 4 4,25 4,5 40 4.6 4.5 4.5 4.4 4.3 4.25 4.2 số rễ (rễ) 4.1 4 3.9 3.8 3.7 MTa MTb MTc Hình 3.9: Biểu đồ số rễ trung bình lan Sơn Thủy Tiên môi trƣờng sau tuần cấy chuyển Nhìn vào biểu đồ 3.5 t thấy số rễ trung bình/chồi cơng thức có chênh lệch rõ ràng Cơng thức MTa có số rễ trung bình 4,25 rễ/chồi, số rễ chồi tƣơng đối Cơng thức MTb có số rễ trung bình cao (4,5 rễ/chồi), cơng thức có số rễ chồi Ở công thức MTc, chồi sinh rễ không đồng đều, số rễ trung bình rễ/chồi Tiểu kết: Giai đoạn tạo chồi in vitro với công thức MTa bổ sung 2mg/l BAP cho tỉ lệ chồi tạo rễ, thân, cao với số lƣợng rễ trung bình 4,5 rễ, số lƣợng trung bình 3,25 chiều cao thân trung bình 9,1mm ±1,43 41 MTa MTb MTc Hình 3.10: Chồi lan Sơn Thủy Tiên sau tuần theo dõi 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Tìm cơng thức khử trùng tạo vật liệu khởi đầu loài lan Sơn Thủy Tiên cho hiệu cao sử dụng hóa chất EtOH (70%) thời gian phút sau nhúng vào EtOH (96%) đốt lửa đèn cồn lần, tỷ lệ mẫu mẫu tái sinh đạt 83,33% - Môi trƣờng tạo protocom phù hợp 1/2MS, tỷ lệ protocom đạt 83,33%, protocom phát triển đồng đều, trịn, to, bóng đẹp - Mơi trƣờng tạo chồi phù hợp MS, có bổ sung 2mg/l BAP Cho tỉ lệ chồi hình thành quan rễ, thân, cao với số lƣợng rễ trung bình 4,5 rễ, số lƣợng trung bình 3,25 chiều cao thân trung bình 9,1mm Kiến nghị Tiếp tục tiến hành nghiên cứu giai đoạn để hồn thiện quy trình nhân giống in vitro giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam ( ), NXB Trẻ Vũ Thị Huệ, Nhân giống số loài lan địa phương pháp nuôi cấy ống nghiệm (in vitro), luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp Nguyễn Nhƣ Khanh, Cao Phi Bằng (2009), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Giáo Dục Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), Nhân giống in vitro loài Lan địa Dendrobium nobile Lindl, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(7), tr 917-925 Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Hữu Lễ (2007), “Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật lên phát sinh chồi rễ Phong lan Giả Hạc Dendrobium anosmum“, Tạp chí khoa học công nghệ, tập 47, số 5, 2009 Tr 99 - 10 Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, NXB trẻ, trang 17 – 268 Dƣơng Tấn Nhựt (2008), Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật việc nhân nhanh lan Hài lan Hồ Điệp, Phân Viện sinh học Đà Lạt Sách đỏ Việt Nam (2007), phần thực vật, trang 423 10 Vũ Thanh Sắc, Nguyễn Thị Thu Huyền, Lê Thị Lý (2012) “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoang thảo trầm trắng (Dendrobium anosmum var.alba)”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 93(05), tr131-135 11 Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium Chrysotoxum) – lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng”, tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 64, 2011 12 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium 44 fimbriatum hook)” Trƣờng đại học Nơng nghiệp Hà Nội Tạp chí Khoa học Phát triển: Tập 10, số 2: 263 – 271 13 Nguyễn Quang Thạch (1995), Cơng nghệ sinh hóa thực vật, NXB Nông nghiệp 14 Nguyễn Thiện Tịch, Nguyễn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Dung (1996), Kĩ thuật nuôi trồng hoa lan, NXB Nông nghiệp Hà Nội 15 Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội 16 Jaime A Teixeira da Silva, Elena A Tsavkelova (2015) Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium Plant Cell Rep 34:1685–1706 17 Jonojit Roy, Soumi Naha,Madhumita Majumdar (2007) Direct and callusmediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl (Orchidaceae) Plant Cell, Tissue and Organ Culture Volume 90, pp 31–39 18 Potshangbam Nongdam, Leimapokpam Tikendra (2014) Establishment of an Efficient In Vitro Regeneration Protocol for Rapid and Mass Propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl Using Seed Culture Scientific World Journal Volume 2014; 740-150 19 (, xem ngày 2/5/2017) PHỤ LỤC ẢNH Kính hiển vi soi Tách mẫu Thƣớc đo điện tử Phòng bảo quản mẫu Quả lan Sơn Thủy Tiên PHỤ BIỂU Phụ biểu 1: Mơi trƣờng MS (Murashige & Skoog) Dung Hóa chất dịch mẹ MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 Khối lƣợng cần Nồng độ pha lƣợng lấy cho 500 ml môi trƣờng (mg/l) dung dịch mẹ (ml/l) NH4NO3 1650 41,25 MgSO4.7H2O 370,6 9,265 KNO3 1900 47,5 CaCl2 439,8 10,99 KH2PO4 170 4,25 NaH2PO4 85 2,125 ZnSO4.7H2O 8,6 0,43 H3BO3 6,2 0,31 MnSO4.2H2O 22,3 1,115 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,125 CuSO4.5H2O 0,025 0,0125 CoCl2.2H2O 0,025 0,0125 KI 0,83 0,415 FeSO4.7H2O 27,8 1,39 Na2EDTA 37,26 1,863 Nicotinic acid 0,5 0,025 Pyridoxine (B6) 0,5 0,025 Thiamin- HCl (B1) 0,1 0,005 0,1 100 Glycine MS8 Hàm Myo-inositol 20 20 20 10 10 10 10 10 Phụ biểu 2: Môi trƣờng KC (KnudsonC) Dung dịch mẹ K1 K2 K3 K4 (MS6) K5 (MS8) Hóa chất Hàm lƣợng (mg/l) NH4NO3 600 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 146,5 KH2PO4 170 KCl 300 CaCl2.2H2O 453 KI 0,75 H3BO3 MnSO4.4H2O 10 ZnSO4.7H2O Na2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,26 Myo-inositol 100 ... đầu cảm ứng tạo protocom thơng qua mơi trƣờng khác lồi lan Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cảm ứng tạo protocom loài lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium. .. vi nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thu hái từ tự nhiên - Vật liệu vào mẫu: Qủa lan Hình 2.1: Cây lan Sơn Thủy Tiên Hình 2.2: Quả lan Sơn. .. KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VI THỊ MINH HUỆ NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ CẢM ỨNG TẠO PROTOCOM CỦA LỒI LAN SƠN THỦY TIÊN (Dendrobium chrysotoxum) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: