nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ nghề nuôi trồng thuỷ sản

Công việc được tiến hành như sau: 1 Bổ sung kháng sinh vào môi trường thạch sau đó cấy dịch tảo lên mặt đĩa thạch để theo dõi sinh trưởng của vi khuẩn nhằm xác định sơ bộ loại kháng sinh

Bộ khoa học và công nghệ Viện ứng dụng Công nghệ Trung tâm sinh học thực nghiệm

C6 Thanh Xuân Bắc, Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc

TTSHTN trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

2 Địa chỉ cơ quan : C6- Thanh xuân bắc - Đống đa – Hà Nội

3 Thời gian thực hiện : 12 tháng (từ tháng 1/2005 đến tháng 12/ 2005)

4.Cơ quan chủ trì thực hiện : Trung tâm Sinh học Thực nghiệm

5 Cơ quan chủ quản : Viện ứng dụng công nghệ

6 Tên tổ chức KH & CN: Trung tâm Sinh học Thực nghiệm

7 Kinh phí Tổng số : 218.000.000 đ (Hai trăm mười tám triệu đồng)

8 Từ ngân sách SNKH : 218.000.000 đ (Hai trăm mười tám triệu đồng)

- CN Trần Bảo Trâm - Trung tâm Sinh học thực nghiệm

- Ths Nguyễn Trâm Anh- Trung tâm Sinh học thực nghiệm

- CN Nguyễn Thanh Mai- Trung tâm Sinh học thực nghiệm

- CN Nguyễn Thị Huyền - Trung tâm Sinh học thực nghiệm

Mục tiêu:

- Đưa ra qui trình phân lập làm sạch và bảo quản 5 giống vi tảo có giá trị dinh

dưỡng cao ứng dụng trong nhân giống thuỷ sản là Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris

- Từng bước xây dựng tập đoàn giống tảo có chất lượng tốt để cung cấp cho các cơ sở sản xuất giống thuỷ sản

Nội dung:

- Nghiên cứu qui trình bỏ tảo lạ và động vật phù du tạo 5 giống tảo thuần

(Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại kháng sinh lên sinh trưởng của tảo và

vi sinh vật

- Nghiên cứu bảo quản thử 5 giống tảo bằng kĩ thuật làm bất động

- Đề xuất qui trình phân lập làm sạch và bảo quản giống tảo

Chữ viết tắt

TA – Ký hiệu kháng sinh thuộc nhóm carbonhydrat NĐKS – Nồng độ kháng sinh

TN – Thí nghiệm

D salina – Dunaliella salina

N oculata – Nannochloropsis oculata

T chuii – Tetraselmis chuii

Ch vulgaris – Chlorella vulgaris

I galbana – Isochrysis galbana

EPA – Eicosapentaenoic acid

DHA – Docosahexanenoic acid

Lời mở đầu

Trong một số công trình nghiên cứu trước đây chúng tôi đã giới thiệu về giá trị dinh dưỡng của vi tảo biển và sự cần thiết sử dụng tảo làm thức ăn cho con giống trong nuôi trồng nhân giống nhân tạo các loài hải sản Do các loài vi tảo biển có giá trị dinh dưỡng cao, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp cho động vật biển giai đoạn còn non nên ở các nước có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển, vấn đề sản xuất tảo ở các trại giống rất được chú trọng Kinh phí

đầu tư cho việc sản xuất tảo chiếm tới 50% kinh phí của trại giống

ở nước ta, trong những năm gần đây các loài vi tảo biển đã được nuôi trồng phục vụ nhân giống hải sản ở nhiều trại giống Tuy nhiên việc sản xuất tảo

ở các trại giống hải sản hiện nay gặp rất nhiều khó khăn do chưa có nguồn giống

ổn định Thực tế cho thấy các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du, làm giảm năng suất

và chất lượng tảo, ảnh hưởng đến quá trình sản xuất giống hải sản Vì vậy cần có nguồn giống tốt để thường xuyên cung cấp cho sản xuất

Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm sạch và bảo quản lâu dài một số giống tảo có giá trị kinh tế cao để cung cấp giống chủ động, ổn định, kịp thời cho việc sản xuất giống thuỷ sản tại các trại giống là hết sức cần thiết

Phần I: Tổng quan tài liệu

Các loài vi tảo biển có kích thước bé, giàu dinh dưỡng, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp để sử dụng cho động vật biển giai đoạn còn non Vì vậy vi tảo được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản như là nguồn thức ăn tươi sống thiết yếu của động vật thân mềm 2 mảnh vỏ ( sò, điệp, ngao, vẹm, trai .),

ấu trùng bào ngư, tôm, một số loài cá và động vật phù du sử dụng trong dây chuyền thức ăn phục vụ nuôi trồng thuỷ sản Trong hơn bốn thập kỷ qua hàng trăm loài tảo đã được thử nghiệm và đã chọn được vài chục loài có khả năng nhân nuôi sinh khối ứng dụng trong thuỷ sản Chúng thuộc ngành tảo lục (Chlorophycophyta), tảo khuê (Bacilariophyta) và tảo roi cụt (Haptophyta) Theo các tác giả Brown et al ( 1991, 1992, 1997, 1999), Renaud et al (1999), Knuckey

et al (2002), các loại tảo này có kích thước nhỏ, thành tế bào mỏng, dễ tiêu hoá, giàu dinh dưỡng, hàm lượng protein, axit amin, lipít, cacbonhydrat và vitamin cao, thích hợp cho sinh trưởng của ấu trùng các động vật biển, đặc biệt các loài

vi tảo này có hàm lượng a xít béo rất cao, trong đó có các axit béo không no mạch dài (DHA, EPA) chiếm từ 49,7-77,9% ở tảo lục và chroomonas, từ 19,8-52,6% ở tảo diatoms và prymnesiophytes ) Các axít này rất cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của động vật biển giai đoạn ấu trùng

tảo Kinh phí để sản xuất tảo chiếm từ 15-50% kinh phí của trại giống

Để đảm bảo hiệu quả của quá trình sản xuất hải sản, cần có nguồn thức

ăn tảo với chất lượng cao, muốn vậy nguồn giống tảo cho quá trình sản xuất sinh khối phải đạt chất lượng tốt Thường các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du Để đáp ứng nguồn tảo giống cho các trại sản xuất thường xuyên phải cung cấp giống mới (sạch, tốt) từ tập đoàn giống gốc Vì vậy, giống cần được thường xuyên phân lập và bảo quản trong điều kiện thích hợp ở các nước có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển như Mỹ, úc, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, Hàn

dịch vụ đi kèm nhằm đảm bảo có giống tốt, cung cấp ổn định cho sản xuất Tuy nhiên việc phân lập tảo gặp nhiều khó khăn do kích thước tế bào tảo nhỏ, sống kết hợp với vi sinh vật và các loài ký sinh khác Vì vậy việc tách vi khuẩn khỏi tảo là rất khó Gerloff và cộng sự (1950), Kbutko (1961) đã làm sạch tảo lam bằng cách sử dụng tia cực tím Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là có thể gây đột biến di truyền Baccep và cộng sự (1989) đã sử dụng phương pháp cấy tảo trên thạch Sau đó chọn khuẩn lạc mong muốn và cấy tiếp vào môi trường lỏng để tảo phát triển, tiếp tục lấy tảo từ môi trường lỏng cấy tiếp vào môi trường thạch Quá trình được lặp lại nhiều lần cho đến khi thu được tảo sạch Cách phân lập này hiện nay vẫn được sử dụng phổ biến.Tuy nhiên với phương pháp như trên tốn rất nhiều thời gian và cũng không loại bỏ được vi khuẩn bám chặt vào lớp nhầy quanh tế bào tảo Stein (1973) cho thấy tảo sạch cũng có thể nhận được bằng cách rửa kỹ và sử dụng một hoặc nhiều loại kháng sinh để diệt khuẩn nhưng không nêu sử dụng loại kháng sinh nào

Để nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian phân lập, Alenkhina và cộng sự (2001) đã sử dụng chất diệt khuẩn Methiolat để tách vi khuẩn ra khỏi tảo lam Kết quả cho thấy nồng độ Methiolat 2ppm có tác dụng diệt khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng tảo lam nghiên cứu Việc nghiên cứu

làm sạch khuẩn các loài vi tảo biển nói chung và các chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrryis galbana, Tetraselmis chuii, Chlorella vulgaris còn ít được công bố

Sau khi có được tảo sạch, vấn đề giữ giống cũng rất quan trọng Thường tảo được giữ ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thấp để hạn chế sinh trưởng Tuy nhiên trong điều kiện này giống giữ không được lâu, dễ nhiễm, chất lượng kém Vì vậy, vấn đề bảo quản giống trở nên bức xúc và được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Morris (1978), Fenwick và cộng sự (1992), Pedro Canavate và cộng sự (1995), Hong Quan Liu và cộng sự (2004) đã nghiên cứu bảo quản một

số loài tảo bằng kỹ thuật đông lạnh, phương pháp này đòi hỏi phải áp dụng một

số phương thức đặc biệt nhằm hạn chế tổn thương đối với tế bào (Moris, 1987) như dùng các chất chống đóng băng, điều khiển tốc độ làm lạnh, tốc độ làm ấm,

sử dụng các yếu tố điều hoà nhiệt độ, nồng độ muối, Các tác giả trên cũng cho thấy: Có hai phương pháp đông lạnh là đông lạnh một bước và đông lạnh hai bước Đông lạnh một bước là tảo sau khi ủ, cho vào cọng rạ và đưa thẳng vào nitơ lỏng (-196 o C) (Tsuzu, 1973; Beu-Amotz và Gilboa, 1980) Đông lạnh 2 bước là đầu tiên tảo được đông lạnh trong điều kiện có kiểm soát nhằm giảm hư hại do quá trình tạo băng, sau đó đưa vào nitơ lỏng Kết quả nghiên cứu của Pedro canavate và cộng sự (1995) cho thấy: Tuỳ theo phương pháp làm lạnh, nồng độ chất chống đóng băng, nồng độ muối, môi trường và đặc điểm của từng giống nên khả năng sống của tảo sau khi bảo quản rất khác nhau Đối với

Chaetoceros glacilis, tỉ lệ sống chỉ đạt 2,9-7,3%; Rodomonas baltica 2,2-3,1%; Isochrysis galbana từ 9,3-25,8%, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis gaditana

và Nannochloropsis atomus không bị ảnh hưởng bởi quá trình làm lạnh

Theo nhận xét của nhiều tác giả: bảo quản bằng kĩ thuật đông lạnh phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố Ngoài ra trong quá trình đông lạnh, sự hình thành băng đột ngột có thể xảy ra làm hư hại tế bào (Moris, 1987), hơn nữa việc sử dụng các hoá chất chống lạnh gây độc đối với tế bào và có thể làm ảnh hưởng

đến khả năng sống của tảo Điều này đã được mô tả đối với tảo Chlorella (Moris.1976), tảo khuê (Mclellan, 1989) và Tetraselmis suecica (Fenwiek and

Day, 1992) Ngoài ra, sử dụng kĩ thuật đông lạnh còn đòi hỏi một số thiết bị đặc chủng, chi phí cao, khó thực hiện Vì vậy, công nghệ bảo quản mang tính ưu việt hơn: ít phức tạp, chi phí thấp, phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất đang được các nhà khoa học nghiên cứu áp dụng Đó là bảo quản tảo bằng cách làm bất động (immobilization) (Tamponet và cộng sự ,1985; Hertherg and Jensen, 1989; Susana Romo and Carmen Berer-Martiner ,1997; Yean-Chang-Chen, 2001,2003) Kết quả nghiên cứu của Tamponnet và cộng sự (1985)

và Hertzberg and Jensen (1989) cho thấy các giống tảo khuê được làm bất động trong gel vẫn duy trì được cấu trúc nguyên vẹn và hoạt tính sinh lí trong một số tháng, điều này gợi ý có thể sử dụng kĩ thuật này trong bảo quản giống tảo Tuy

tốt Tác giả Susana Romo and Carmen Perez Martinez (1997) đã thử nghiệm kĩ

thuật làm bất động để bảo quản giống tảo lam Pseudanabaena galeata Bocher

(cyanobacteria) và đánh giá khả năng sống, đặc điểm sinh lí, sinh hoá và cấu trúc của chúng sau thời gian bảo quản 14-18 tháng Kết quả cho thấy tảo sau khi

được bảo quản tỉ lệ sống đạt 93%, sinh trưởng tốt, không có sự khác biệt về cấu trúc tế bào, sinh hoá và tốc độ sinh trưởng giữa tảo thí nghiệm và tảo đối chứng Các tác giả trên nhận xét việc xử lí dường như không có ảnh hưởng đến khả năng

sinh trưởng và chức năng của tảo Pseudanabaena galeata, hàm lượng C, H, N và

P trong tế bào tảo được bảo quản và tế bào tảo đối chứng không có sự khác biệt

đáng tin cậy Tảo sau khi bảo quản được đưa vào môi trường thích hợp để sinh trưởng

Tác giả Yean-Chang-Chen (2001) đã nghiên cứu kĩ thuật làm bất động

Scenedesmus quadricauda trong hạt gel để bảo quản tảo lâu dài Tảo được cố

định bằng kĩ thuật làm bất động vẫn giữ được hoạt tính sinh lí sau 3 năm bảo quản trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 4o C, không có môi trường dinh dưỡng Sau khi cho vào môi trường thích hợp trong 4 tuần, số lượng tảo đã tăng lên 40 lần Kết quả quan sát cho thấy sau quá trình bảo quản dài ngày, một số cơ

quan tử (pyrenoids) của Scenedesmus quadricauda bị tiêu huỷ Tuy nhiên cơ

quan tử này sẽ phục hồi khi đưa vào điều kiện nuôi thích hợp về dinh dưỡng và

ánh sáng Kết quả nghiên cứu của Yean – Chang - Chen (2003) đối với tảo

Haptophyta; Laz E de Bashan và công sự (2002) đối với tảo Chlorella và Azospirillum cho thấy giống tảo sau khi bảo quản bằng phương pháp làm bất

động có độ nảy mầm cao, sinh trưởng tốt và đặc biệt là chi phí bảo quản thấp Giống có thể bảo quản được 1 – 3 năm vẫn đảm bảo chất lượng tốt Qua những kết quả thu được, các tác giả trên nhận xét có thể sử dụng kĩ thuật làm bất động

để bảo quản tảo lâu dài trong phòng thí nghiệm và ứng dụng vào thực tế sản xuất nuôi trồng thuỷ sản nhằm giảm chi phí sản xuất so với các phương pháp truyền thống

ở nước ta trong những năm gần đây, tảo đã được sử dụng làm thức ăn tươi sống phục vụ nhân giống hải sản (tôm, cá, bào ngư, ngao, sò, động vật hai

mảnh vỏ ) Hiện nay nhu cầu về tảo trong các trại giống rất lớn Nhưng để sản xuất tảo mang lại hiệu quả như mong muốn, vấn đề giống là khâu đặc biệt quan trọng Các cơ sở nhân giống thuỷ sản lớn như: Trạm nhân giống thuỷ sản nước mặn tại Cát Bà, trạm nghiên cứu nhân giống thuỷ sản nước lợ Quí Kim Đồ Sơn Hải Phòng, một số cơ sở nuôi trồng thuỷ sản ở Miền Trung (Nha Trang, Khánh Hoà, Cửu Hội, Nghệ An) đều có bộ phận nhân nuôi tảo phục vụ ươm nuôi con giống Tuy nhiên giống tảo sử dụng tại các trại giống hiện nay chủ yếu là nhập từ nước ngoài, trong quá trình sử dụng giống thường bị nhiễm dẫn đến giảm chất lượng Các cơ sở này ít có điều kiện phân lập làm sạch Vì vậy vấn đề sản xuất tảo nhân nuôi con giống gặp nhiều khó khăn Ngoài ra, việc giữ giống thường

được thực hiện bằng cách nuôi tảo trong môi trường lỏng, trong tủ mát với nhiệt

độ 15-17oC Trong điều kiện này tảo phát triển nhanh và dễ bị nhiễm tạp tảo lạ

và vi khuẩn Hiện nay công nghệ bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động ở Việt Nam chưa được nghiên cứu áp dụng Vì vậy việc nghiên cứu qui trình làm sạch tảo (bao gồm phân lập, loại bỏ tảo lạ, động vật phù du và làm sạch khuẩn tiến tới xây dựng tập đoàn giống có chất lượng tốt và nghiên cứu kỹ thuật nhằm bảo quản lâu dài các giống tảo nhằm chủ động phục vụ sản xuất là hết sức cần thiết

Với mục đích trên chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục

vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản”

Phần II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

II.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris Tảo Dunaliella salina và Chlorella vulgaris được lấy từ tập đoàn giống của Trung tâm sinh học thực nghiệm Tảo Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii được lấy từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, Hải phòng

Dunaliella salina là tảo đơn bào, màu xanh lục, kích thước tế bào 7-12àm

Tế bào có dạng hình ovan, không có màng cứng bằng xenlulloza bao bọc mà chỉ

có màng nguyên sinh chất, có khả năng chuyển động liên tục trong quá trình sống nhờ roi ở đỉnh Tảo sinh sản bằng hình thức vô tính chia dọc hay ngang tế

bào Dunaliella salina chứa nhiều loại sắc tố đặc biệt là β-caroten (chiếm từ

8-14% trọng lượng khô), hàm lượng dinh dưỡng cao, axit béo không no chiếm

77,9% tổng lượng axit béo, Dunaliella salina rất thích hợp để làm thức ăn cho

một số loài động vật biển

Nannochloropsis oculata có màu xanh, kích thước nhỏ 2-4àm thành tế

bào mỏng thích hợp làm thức ăn cho luân trùng Đặc điểm của tảo

Nanochloropsis oculata là hàm lượng axit béo không no omega-3 fatty

unsaturated fatty acids (HUFAs) rất cao ( từ 16-42%) trong đó chủ yếu là EPA (Eicosapentaenoic acid) Trong tảo chiếm một lượng lớn vitamin B12, vitamin này có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của ấu trùng cá Vì vậy,

Nannochloropsis oculata là tảo được nuôi trồng phổ biến nhất trong các trại

nuôi trồng thuỷ sản để phục vụ công tác nhân giống động vật biển

Isochrysis galbana có màu nâu vàng, có lông roi, kích thước từ 4-7àm

Tảo này được nuôi trồng phổ biến để làm thức ăn cho động vật hai mảnh vỏ

(ngao, sò ), kết hợp với tảo Chlorella hoặc tảo khác để làm thức ăn cho luân trùng Hàm lượng axit béo không no EPA trong tảo Isochrysis galbana chiếm 2-

3,5% và DHA 3,5-4%

Tetraselmis chuii thuộc loài tảo lục, kích thước 9-14àm, được sử dụng

nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản Trong tảo chứa khoảng 5% EPA và 7% DHA,

đặc biệt trong tảo này có chứa axit béo 20 : 5n-3 và sterol 24-methychlesterol hoặc 24-methylenecholesterol với hàm lượng cao Các hợp chất trên có rất ít trong thực vật phù du và rất thích hợp cho sinh trưởng của ấu trùng động vật biển nói chung và động vật thân mềm 2 mảnh vỏ như ngao, sò, hầu (Wikfors et al, 1991)

Chlorella vulgaris là tảo lục giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong

nuôi trồng thuỷ sản, ngoài việc làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng động vật biển

(tôm, động vật 2 mảnh vỏ) ở một số giai đoạn phát triển, Chlorella vulgaris còn

có tác dụng rất tốt trong xử lí nước ao nuôi, gây màu nước

II.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập, làm sạch tảo: dịch tảo được làm sạch sơ bộ bằng cách lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và động vật phù du Sau đó tiến hành ly tâm để xác định tốc độ và thời gian ly tâm thích hợp đối với từng chủng tảo, dựa vào đó có thể ly tâm tách tảo để thu được sinh khối chủng tảo mong muốn Từ sinh khối tảo thu được tiến hành phân lập theo 2 phương pháp: phân lập trên môi trường thạch và phân lập trong môi trường lỏng bằng phương pháp pha loãng

-Phân lập trên môi trường thạch:

Mẫu tảo sau khi pha loãng được cấy vào đĩa thạch có chứa dinh dưỡng phù hợp với loài cần phân lập Tảo được nuôi trong điều kiện chiếu sáng 1500lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 18oC Sau 15-20 ngày, tảo mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, chọn khuẩn lạc mong muốn, dùng que cấy tách khuẩn lạc đã chọn cho vào môi trường lỏng, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu

được tảo mong muốn (không lẫn tảo lạ)

Phân lập trong môi trường lỏng: Tảo sau khi đã làm sạch sơ bộ, được pha loãng sao cho mỗi giọt có một tế bào tảo, sau đó chuẩn bị các ống nghiệm có

Để các ống nghiệm trong điều kiện ánh sáng yếu (1000lux) để tảo phát triển, sau 2-3 tuần kiểm tra để chọn ống nghiệm có tảo mong muốn

Sau khi thu được tảo thuần, dùng kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn, thu tảo sạch khuẩn Công việc được tiến hành như sau:

1) Bổ sung kháng sinh vào môi trường thạch sau đó cấy dịch tảo lên mặt đĩa thạch để theo dõi sinh trưởng của vi khuẩn nhằm xác định sơ bộ loại kháng sinh, nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo

2) Bổ sung kháng sinh trực tiếp vào dịch tảo, sau đó theo dõi sinh trưởng của

tảo và sự phát triển của vi khuẩn nhằm xác định chính xác loại kháng sinh

và nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi

dịch tảo

Sinh trưởng của tảo được xác định bằng cách đo mật độ tảo (chỉ số OD)

trên máy quang phổ (Đối với tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata,, Chlorella vulgaris đo ở bước sóng 640 nm, Isochrysis galbana đo ở bước sóng 520nm) Xác định sự có mặt của vi khuẩn

trong dịch tảo bằng cách cấy dịch tảo lên môi trường thạch có chứa dinh dưỡng phù hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn và kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn để xác

định nồng độ và loại kháng sinh thích hợp cho việc loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo Sinh trưởng của vi khuẩn được tính bằng số khuẩn lạc hoặc diện tích

Tảo sau khi phân lập, làm sạch, loại bỏ vi khuẩn được bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động nhằm giữ giống lâu dài Nguyên tắc của phương pháp này là

sử dụng chất tạo gel để cố định mẫu, bảo quản mẫu ở nhiệt độ thấp, không có

ánh sáng, khi cần sử dụng hoà tan tảo và để ở điều kiện ánh sáng, nhiệt độ thích hợp cho tảo phát triển

Phần III: Kết quả nghiên cứu III.1 Nghiên cứu phân lập thu giống tảo thuần

Để thu được giống tảo thuần sạch tảo lạ và động vật phù du, quá trình phân lập tiến hành như sau:

Loại bỏ tảo lạ bằng phương pháp làm sạch sơ bộ: Lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và động vật phù du, sau đó dựa vào các đặc tính sinh lý của từng loại tảo để chọn phương pháp phân lập phù hợp

Đối với tảo Dunaliella salina là tảo ưa mặn có thể chịu được môi trường

có nồng độ muối cao hơn các loại tảo khác Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi tảo trong môi trường có nồng độ muối từ 25-30% (cao gấp 10 lần môi trường dinh dưỡng cho vi tảo biển nói chung) Sau một thời gian nuôi trong môi trường có nồng độ muối cao, các loài tảo nhiễm tạp giảm đáng kể Từ sinh khối tảo thu

được, dựa vào tốc độ ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp cho từng loại tảo chúng tôi tiến hành tách tảo theo phương pháp ly tâm Việc thí nghiệm ly tâm tách tảo như sau: Các chủng tảo được ly tâm với tốc độ khác nhau: 1000, 2000, 3000 (v/phút) trong thời gian 2 phút, 3 phút, 5 phút Sau mỗi lần ly tâm, kiểm tra dịch tảo và cặn tảo để xác định độ lắng, độ sạch của tảo, trạng thái tế bào tảo, từ đó xác định tốc độ và thời gian thích hợp để làm sạch sơ bộ các chủng tảo mong muốn Kết quả thí nghiêm được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1: Thời gian và tốc độ ly tâm thích hợp để tách tảo

Chlorella vulgaris

galbana

Nannochloropsis oculata

Kết quả cho thấy tảo Tetraselmis chuii ly tâm với tốc độ 1000vòng/phút

trong thời gian 2 phút có 80% số tế bào lắng, tảo tương đối sạch tảo lạ, khi tăng tốc độ ly tâm lên 2000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút, toàn bộ 100% tế bào lắng cặn, trong đó có nhiều tế bào tảo lạ Vì vậy chúng tôi cho rằng đối với

Tetraselmis chuii ly tâm tốc độ 1000v/phút trong vòng 2 phút là thích hợp

Đối với tảo Isochrysis galbana với tốc độ ly tâm 1000v/phút trong vòng 2

phút, 3 phút, 5 phút, tảo hoàn toàn không lắng Khi tăng tốc độ ly tâm lên 2000v/phút với thời gian ly tâm là 2 phút, số lượng tảo lắng là 50% nhưng tạo cặn không chắc, khi tăng tốc độ ly tâm lên 3000v/phút, có 90% số lượng tảo lắng cặn nhưng có chứa nhiều tế bào tảo lạ Kết quả sau nhiều lần thí nghiệm cho

thấy đối với tảo Isochrysis galbana ly tâm tốc độ 2000v/phút trong vòng 3 phút

là tương đối thích hợp ( 70% số lượng tế bào lắng trong đó có ít tế bào tảo lạ)

Kết quả thí nghiệm đối với tảo Nannochloropsis ocalata cũng cho thấy

với tốc độ ly tâm 1000v/phút, thời gian ly tâm: 2 phút, 3 phút, 5 phút tảo đều không lắng ở tốc độ 2000v/phút số lượng tảo lắng chỉ khoảng 30-40%; khi ly tâm với tốc độ 3000v/phút, thời gian ly tâm 3 phút, tảo lắng là 80% Tuy nhiên

ngoài Nannochloropsis oculata trong cặn tảo còn một số tế bào tảo lạ

Đối với tảo Chlorella, để tách được tảo tương đối sạch tảo lạ cần ly tâm ở tốc độ 3000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút và với tảo Dunaliella salina tốc độ ly

tâm 2000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút

Sau khi ly tâm để tách tảo, chúng tôi thu được các chủng tảo tương đối sạch tảo lạ Từ các mẫu tảo thu được tiếp tục phân lập theo phương pháp pha loãng hoặc cấy trên môi trường thạch để thu tảo thuần như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu

Sau quá trình phân lập công phu chúng tôi đã thu được tảo thuần:

Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana và Chlorella vulgaris

Tuy nhiên các giống tảo này còn nhiễm rất nhiều vi khuẩn Kết quả kiểm tra cho thấy trong dịch tảo chứa rất nhiều loại vi khuẩn khác nhau (ảnh 1) bao gồm các vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương ( ảnh 2) Vì vậy cần nghiên cứu loại bỏ vi khuẩn để thu tảo sạch khuẩn

ảnh1: Đĩa thạch có khuẩn lạc dày đặc

ảnh 2: Nhuộm Gram

III.2.Nghiên cứu thu tảo sạch khuẩn

Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh lên việc loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo

Để loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo chúng tôi đã thử nghiệm bổ sung một

số kháng sinh vào môi trường nuôi cấy tảo để nghiên cứu khả năng loại bỏ vi khuẩn của kháng sinh và ảnh hưởng của chúng lên sinh trưởng của tảo Các

kháng sinh được lựa chọn phải đáp ứng yêu cầu: có khả năng loại bỏ vi khuẩn và không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo Với mục đích trên, chúng tôi đã thử nghiệm 4 loại kháng sinh : Tetracycline, Peflacine, Erythromycine và TA

Thí nghiệm được tiến hành như sau: chuẩn bị môi trường thạch Gorbenko

có bổ sung kháng sinh với nồng độ khác nhau, sau đó cấy dịch tảo lên môi trường thạch để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và tảo Kết quả thu được là cơ

sở để xác định ngưỡng nồng độ kháng sinh thích hợp nhằm loại bỏ vi khuẩn đối với từng loại tảo Điều này rất cần thiết khi giữ giống trong môi trường thạch

Thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của một số loại kháng sinh lên sinh trưởng của tảo và vi khuẩn trong dịch tảo được tiến hành bằng cách bổ sung trực tiếp kháng sinh vào môi trường nuôi cấy tảo, sau đó theo dõi sinh trưởng của tảo và kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn

III.2.1 ảnh hưởng của Tetracycline và Peflacine lên việc loại bỏ vi khuẩn và sinh trưởng của tảo

Tetracycline là kháng sinh thuộc nhóm quinon có phổ tác động rộng, có tác dụng đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu thăm dò việc sử dụng kháng sinh này để loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo Tuy nhiên khi bổ sung Tetracyeline vào môi trường nuôi tảo đã làm cho môi trường

bị kết tủa, ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo Vì vậy chúng tôi tiếp tục thí nghiệm với một kháng sinh khác cũng thuộc nhóm quinon là peflacine Peflacine được bổ sung vào môi trường thạch đặc (Gorbenko) với nồng độ từ 2.5àg/ml-150àg/ml, sau đó cấy dịch tảo lên môi trường thạch để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2 cho thấy: ở công thức đối chứng (môi trường không có kháng sinh), sau 3 ngày cấy dịch tảo vào môi trường thạch, toàn bộ diện tích mặt đĩa thạch đều có vi khuẩn phát triển ở công thức có bổ sung peflacine nồng độ 2.5àg/ml cũng thu được kết quả tương tự như

công thức đối chứng, chỉ có ở công thức được cấy chủng tảo Isochrysis galbana

lượng vi khuẩn giảm 50%.Khi tăng nồng độ peflacine lên 20 àg/ml, lượng vi

khuẩn ở các đĩa được cấy các chủng tảo đều giảm đáng kể trừ Chlorella

Bảng 2: ảnh hưởng của peflacine đến sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường

thạch đặc (tính bằng % diện tích mặt đĩa thạch có vi khuẩn mọc)

100% 100% 100% (nhiều

loại khuẩn lạc)

100%

2.5

100%

(nhiều loại khuẩn lạc )

100%, 2 loại khuẩn lạc 100%

100%, 1 loại khuẩn lạc 50%

5

20%, chỉ có

2 loại khuẩn lạc

10% 100% 20%, khuẩn

lạc bé 50%

10

15%, có 2 loại khuẩn lạc

9%, 1 loại khuẩn lạc 100%

10%, khuẩn lạc rất bé

40%, khuẩn lạc bé

20

10%, chỉ có một loại khuẩn lạc

40

10%, chỉ có một loại khuẩn lạc

Từ kết quả trên có thể nhận xét rằng việc bổ sung peflacine nồng độ 20àg/ml vào môi trường thạch đặc có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn khỏi

tảo Nannochloropsis oculata và tảo Isochrysis galbana Đối với chủng tảo Dunaliella salina nồng độ kháng sinh cần bổ sung là 80àg/ml , còn đối với 2 chủng tảo Tetraselmis chuii và Chlorella nồng độ kháng sinh peflacine 150ml

vẫn không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn khỏi hai chủng tảo này

Để tìm hiểu thêm về khả năng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina của peflacine, chúng tôi cũng đã tiến hành thử nghiệm tác dụng diệt

khuẩn của peflacine trong môi trường lỏng nuôi tảo Kết quả được trình bày ở bảng 3

Bảng 3: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch tảo

15 ngày nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc

Kết quả thí nghiệm ở bảng 3 cho thấy: việc bổ sung kháng sinh trực tiếp

vào dịch tảo Dunaliella với nồng độ từ 40-150àg/ml không có tác dụng loại bỏ

vi khuẩn ra khỏi tảo, trong lúc đó ở môi trường thạch cứng, lượng peflacine cần

sử dụng là 80àg/ml (bảng 2) Có thể điều này phụ thuộc vào lượng dịch tảo( cụ thể là số lượng vi khuẩn) cấy vào môi trường thạch Kết quả nghiên cứu ở bảng 4 cũng cho thấy khi tăng nồng độ peflacine trong dịch tảo từ 40àg/ml đến 150àg/ml không làm ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của tảo mà ngược lại, mật

độ tảo ở các công thức có nồng độ peflacine 80/ml và 150àg/ml có chiều hướng cao hơn mật độ tảo ở công thức có nồng độ peflacine 40àg/ml (Đồ thị 1)

Qua kết quả được trình bày ở bảng 2 và bảng 4 cho thấy có thể sử dụng peflacine nồng độ từ 80-150àg/ml để loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo trong điều kiện

Bảng 4: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng (OD)của tảo D salina

Đối với các giống tảo Tetraselmis chuii và Chlorella vulgaris, sử dụng

peflacine với nồng độ từ 2.5àg/ml -150àg/ml trong môi trường thạch đặc không

có hiệu quả loại bỏ vi khuẩn Trong lúc đó đối với tảo Nannochloropsis oculata ,

việc bổ sung peflacine vào môi trường thạch đặc ở nồng độ 20àg/ml cho kết quả tốt, loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn (bảng 2) Tuy nhiên khi nuôi cấy tảo này trong môi trường lỏng nồng độ kháng sinh bao nhiêu là phù hợp và peflacine ảnh hưởng như thế nào đến sinh trưởng của tảo? Để làm rõ hơn câu hỏi trên chúng tôi

đã tiếp tục thử nghiệm bổ sung peflacine vào dịch tảo Nannochloropsis oculata

để theo dõi Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 5 và bảng 6

Bảng 5: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của vi khuẩn

trong dịch tảo N oculata

Thời gian (ngày)

Kết quả ở bảng 5 cho thấy khi bổ sung peflacine vào dịch tảo nồng độ 20àg/ml

và 40àg/ml vẫn không có khả năng loại bỏ hết vi khuẩn Mặt khác việc bổ sung

peflacine vào dịch tảo đã làm giảm sinh trưởng của tảo Nannochloropsis oculata (bảng

6) Vì vậy chúng tôi cho rằng không nên sử dụng peflacine đối với tảo

Đối với tảo Isochrysis galbana, bổ sung peflacine vào môi trường thạch

cứng nồng độ từ 20àg/ml -150àg/ml có tác dụng loại bỏ hết vi khuẩn(bảng 2)

Tuy nhiên khi bổ sung kháng sinh này vào môi trường lỏng nuôi tảo với nồng độ

từ 20-150àg/ml không có khả năng loại bỏ hết vi khuẩn trong dịch tảo(bảng 7)

Bảng 7: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của

vi khuẩn trong dịch tảo I galbana

nhiều khuẩn lạc

nhiều khuẩn lạc

Mặt khác, khi tăng nồng độ kháng sinh peflacine lên 80àg/ml đã có ảnh

hưởng xấu lên sinh trưởng của tảo (bảng 8) Vì vậy việc sử dụng peflacine để bổ

sung vào dịch tảo Isochrysis galbana là không thích hợp.

Bảng 8: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của tảo I.galbana

Từ những kết quả thu được ở trên cho thấy chỉ nên sử dụng peflacine bổ

sung vào môi trường thạch với nồng độ từ 20-40àg/ml để giữ giống các giống

tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana, không nên sử dụng

peflacine để bổ sung vào môi trường lỏng nuôi tảo

Chúng tôi cũng tiếp tục kiểm tra hiệu quả diệt khuẩn của peflacine trong

dịch tảo Chlorella vulgaris Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 9 và bảng

có ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng của tảo (bảng 11, 12)

Bảng 10: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch tảo

Ch vulgaris

Nồng độ

àg/ml

Bảng 11: ảnh hưởng của peflacine lên sinh trưởng của tảo Ch vulgaris

Chúng tôi cũng đã thử nghiệm sử dụng peflacine để bổ sung vào dịch tảo

Tetraselimis chuii, kết quả cho thấy đối với tảo Tetraselmis chuii, nồng độ

peflacine từ 50-200àg/ml không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo

Việc bổ sung peflacine vào môi trường thạch với nồng độ lên đến 300àg/ml

cũng không có kết quả.Vì vậy chúng tôi không tiếp tục thử nghiệm sử dụng

peflacine đối với tảo Tetraselmis chuii

Từ những kết quả thu được ở trên cho thấy: có thể sử dụng peflacine

nồng độ 20àg/ml -40àg/ml bổ sung vào môi trường thạch để giữ giống các

giống tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana, nồng độ 80àg/ml

để giữ giống Dunaliella salina Không nên dùng Peflacine để bổ sung vào dịch tảo Peflacine không thích hợp với các giống Chlorella vulgaris và Tetraselmis chuii

III.2.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của Erythromycine lên khả năng thu tảo sạch khuẩn

Để tìm hiểu ảnh hưởng của Erythromycine lên việc loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo, các thí nghiệm được tiến hành như sau:

Tảo được cấy vào môi trường dinh dưỡng có bổ sung Erythromycine nồng

độ 5-200 àg /ml, sau đó theo dõi sinh trưởng của tảo Sau thời gian nuôi cấy,

dịch tảo được cấy lên đĩa thạch để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn

Bảng 13 : ảnh hưởng của Erythromycine lên sự có mặt của vi khuẩn trong

Kết quả ở bảng 13 cho thấy với nồng độ Erythromycine từ 5-200 àg /ml

không có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina ở tất cả các mẫu tảo được bổ xung kháng sinh vi khuẩn đều phủ kín

100% diện tích bề mặt đĩa thạch Kết quả tương tự cũng thu được khi thí nghiệm

với dịch tảo Nannochloropsis oculata (bảng 14) và tảo Isochrysis galbana (bảng

Bảng 14: ảnh hưởng của Erythromycine lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch

trong dịch tảo Nannochloropsis oculata không giảm so với đối chứng (bảng 14)

Đối với tảo Isochrysis galbana ở các công thức có bổ sung Erythromycine, tuy

lượng vi khuẩn giảm nhưng không có hiệu quả loại bỏ hết vi khuẩn (bảng 15) Mặt khác Erythromycine có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của Duanliella

salina (bảng 16, đồ thị 2 )

B¶ng 16 : ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o D salina

Đồ thị 2: Ảnh hưởng của Erythrromycine lên sinh

trưởng của D.saliana