Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN CỦA MỘT SỐ NGUỒN GEN CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành : Di truyền chọn giống trồng Mã số : 9620111 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội - 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy PGS TS Lã Tuấn Nghĩa Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Thư viện Trung tâm Tài nguyên thực vật MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài luận án Các vùng trồng ăn miền Bắc nước ta góp phần tạo sản phẩm đa dạng phục vụ tiêu dùng xuất Trong đó, bốn loại ăn có diện tích sản lượng lớn theo thống kê Cục Trồng trọt - Bộ Nông nghiệp & PTNT chuối (63870 ha), vải (58.76 ha), nhãn (39570 ha) bưởi (34286 ha) Bảo tồn, lưu giữ khai thác nguồn gen có ý nghĩa vơ quan trọng, cung cấp nguồn nguyên liệu khởi đầu phục vụ công tác nghiên cứu khoa học, cải tạo giống, trì đa dạng sinh học Hiện nay, việc trì khai thác phát triển nguồn gen trồng đặc sản cách hiệu bền vững xu hướng chung nhiều quốc gia, có Việt Nam Trong thời gian gần đây, mã vạch ADN (DNA barcode) sử dụng công cụ bổ sung công tác nhận dạng sinh vật Sử dụng mã vạch ADN phương pháp xác nhanh chóng giúp nhận dạng sinh vật giai đoạn sớm; liệu thu được, kết phân tích, so sánh lưu giữ đơn giản Chính vậy, tiến hành thực đề tài luận án: “Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN số nguồn gen trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn chọn tạo giống” Mục tiêu nghiên cứu đề tài luận án Lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen bưởi, chuối, nhãn vải thị phân tử EST-SSR/ SCoT để tiến hành xây dựng mã vạch ADN; Khuếch đại giải trình tự vùng gen lục lạp rbcL, matK để đánh giá đa dạng di truyền, từ xây dựng mã vạch ADN cho nguồn gen bưởi, chuối, nhãn vải; Thiết lập liệu SNP công nghệ GBS để xây dựng mã vạch ADN mở rộng cho số nguồn gen nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Trên sở kế thừa thông tin tư liệu, kết thu thập, lưu giữ, bảo tồn nguồn gen ngân hàng gen trồng Quốc gia, đề tài luận án lựa chọn số giống/nguồn gen trồng (bưởi, chuối, nhãn, vải) có giá trị kinh tế cao lưu giữ Trung tâm Tài nguyên thực vật; Đề tài luận án thực phịng thí nghiệm Trung tâm Tài ngun thực vật (An Khánh, Hồi Đức, Hà Nội) Những đóng góp luận án Việc nhận dạng giống ăn đặc sản (bưởi, chuối, nhãn, vải) Việt Nam mã vạch ADN có ý nghĩa quan trọng công tác bảo hộ thương hiệu ăn nước ta Luận án cơng trình nghiên cứu công phu, sử dụng thị phân tử EST-SSR/ SCoT để đánh giá đa dạng giống ăn đặc sản Việt Nam (bưởi, chuối, nhãn, vải), hỗ trợ cơng tác định danh lồi, sử dụng để phân loại sớm ứng dụng chọn giống trồng nước ta Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Cơng trình nghiên cứu tạo sở liệu phân loại phân tử số trồng đặc sản bao gồm bưởi, chuối, nhãn, vải trồng Việt Nam, góp phần bảo tồn, lưu giữ phát triển nguồn gen địa phương Kết luận án cung cấp thông tin nhận dạng giống trồng địa phục vụ công tác bảo hộ giống trồng đặc sản địa phương Kết luận án sở khoa học cho việc xác định nguồn vật liệu chọn giống (bưởi, chuối, nhãn, vải), góp phần giải tranh chấp thương hiệu giống ăn đặc sản, đồng thời phục vụ công tác bảo hộ, dẫn địa lý, phục tráng, phát triển sản phẩm đặc hữu gắn với vùng miền địa phương nước Cấu trúc luận án Luận án có 135 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 28 bảng số liệu, 41 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (35 trang); Chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận (80 trang); Kết luận đề nghị (2 trang) Ngoài ra, có Tài liệu tham khảo (24 trang) 58 trang phụ lục bảng số liệu (26 bảng) phụ lục hình (11 hình) Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng quan 60 tài liệu tiếng Việt, 132 tài liệu tiếng Anh 23 tài liệu từ mạng Internet với nội dung liên quan, bao gồm: Các đối tượng nghiên cứu công tác bảo tồn, chọn tạo giống; Nghiên cứu đa dạng di truyền thị phân tử; Khái niệm mã vạch ADN hệ thống giải trình tự gen hệ mới; Tình hình nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Đề tài luận án sử dụng: - Các nguồn gen nghiên cứu: 25 giống bưởi, 12 giống chuối, 29 giống nhãn 14 giống vải Các nguồn gen lưu giữ quan mạng lưới Trung tâm Tài nguyên Thực vật - Các thị phân tử: 20 cặp mồi EST-SSR; 46 thị SCoT; 02 cặp mồi để khuếch đại vùng gen lục lạp (rbcL matK) - Các kit: TruSeq kit; NEB R06436; NEB, MK0202L; kit Master Mix, kit tinh sản phẩm PCR, kit gel; kit kiểm tra định lượng ADN Qubit dsDNA HS Assay Kit 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen nghiên cứu thị phân tử - Nội dung 2: Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL cho số nguồn gen nghiên cứu - Nội dung 3: Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK cho số nguồn gen nghiên cứu - Nội dung 4: Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho số nguồn gen nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN ADN tổng số tách chiết kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) theo bước hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền thị EST-SSR, SCoT * Phân tích đa dạng di truyền giống bưởi thị EST-SSR Phản ứng PCR với mồi EST-SSR thực với thể tích 25µl; điều º º º kiện nhiệt biến tính 95 C phút, 35 chu trình: 94 C 30 giây, 55 C º º 40 giây, 72 C phút; tổng hợp tiếp 72 C phút, bảo quản º C Sản phẩm PCR điện di gel polyacrylamide 8% với thang ADN chuẩn (hãng Fermentas) * Phân tích đa dạng di truyền giống chuối, nhãn vải thị SCoT Phản ứng PCR thực với thể tích 20µl; điều kiện biến tính º 94 C phút, chu trình: 94ºC ph t, 38ºC ph t, 72ºC ph t, 10 chu trình; 50ºC ph t, 72ºC ph t, 25 chu trình; tổng hợp tiếp 72ºC 10 phút, bảo quản 16ºC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% đệm TBE, nhuộm EtBr soi đèn UV để ghi nhận kết 2.3.3 Phương pháp xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL matK Phản ứng PCR khuếch đại gen rbcL thực với thể tích 25 µl; º º điều kiện biến tính 98 C 30 giây, chu trình; 98 C 10 giây, 55 60ºC 30 giây, 72ºC ph t, 30 chu trình; 72ºC 10 phút, chu º trình, bảo quản 16 C Chu trình phản ứng cho giải trình tự: Mẫu khuếch đại với mồi, mẫu lặp lại lần với thành phần sau: 100 ng sản phẩm PCR tinh sạch; 3,2 pmol mồi µl hỗn hợp BigDye Terminator Ready Reaction; º º tổng thể tích 20 µl; điều kiện 96 C phút, chu trình; 96 C 10 º º º giây, 50 C giây, 60 C phút, 25 chu trình; bảo quản C Sản phẩm đưa vào hệ thống giải trình tự máy ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Phản ứng PCR khuếch đại gen matK thực với thể tích 20µl; º º điều kiện nhiệt: biến tính 94 C phút, chu trình; 94 C 40 º º º giây, 52 C 35 giây, 72 C ph t, 35 chu trình; 72 C 10 giây, º bảo quản 16 C Chu trình phản ứng cho giải trình tự: Mẫu khuếch đại với mồi, mẫu lặp lại lần với thành phần sau: 5,5µl nước, 1µl Bigdie, 2µl 5X buffer, 0,5µl mồi 1µl sản phẩm PCR tinh sạch; tổng thể tích 20µl; điều kiện 96ºC phút, chu trình; 96ºC 10 giây, 50ºC º º giây, 60 C phút, 25 chu trình; 72 C phút; bảo quản 4ºC Sản phẩm đưa vào hệ thống giải trình tự máy ABI3700 1st base Seq company (Singapore) Phân tích hiệu chỉnh trình tự giải mã phần mềm Bioedit, DNAStar Geneious Sắp xếp thẳng hàng trình tự công cụ ClustalW so sánh ngân hàng gen cơng cụ NCBI/BLAST tích hợp phần mềm phân tích Geneious Phân tích tương quan di truyền thực phương pháp lập sơ đồ hình Neighbor - Joining (NJ) tích hợp Geneious (Saitou Nei, 1987) Giá trị bẫy (bootstrap) với số lần lặp 1000 sử dụng để đánh giá độ tin cậy phân nhánh phả hệ NJ 2.3.4 Phương pháp xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS Các bước cụ thể để thiết lập thư viện GBS gồm có: Tách chiết ADN; Chuẩn bị adapter; Ủ adapter; Cắt enzym ApeKI; Gắn adapter; Hỗn hợp lại làm sạch; Khuếch đại PCR; Làm thư viện GBS; Kiểm tra thư viện GBS; Giải trình tự NGS: sản phẩm thực giải trình tự chiều kênh máy phân tích gen Illumia Hiseq 2500 (http://ilumina.com) 2.4 Phần mềm xử lý số liệu Các phần mềm xử lý số liệu bao gồm: phần mềm Bioedit, DNAStar, MEGA, Geneious; NTSYSpc ver.2.1, DARWIN 6.0, Power marker v.3.2.5; STRUCTURE v2.3.4, STACK pineline v1 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm thực từ năm 2013 đến năm 2018 Bộ môn Đa dạng Sinh học Nông nghiệp, Trung tâm Tài nguyên thực vật (An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội) Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá đa dạng di truyền lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen thị phân tử 3.1.1 Đánh giá đa dạng di truyền lựa chọn mẫu đại diện giống bưởi thị EST-SSR Thống kê thị EST-SSR, 20 thị cho sản phẩm đạt yêu cầu để phân tích đa dạng di truyền giống bưởi nghiên cứu, sản phẩm PCR thu băng có kích thước nằm khoảng từ 82 - 413 bp Trong có 10 thị xuất 15 alen đặc trưng giống bưởi (G1, G4, G13, G15, G19, G22 G29) Hình 3.2 Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giống bƣởi nghiên cứu Quan hệ di truyền mẫu giống bưởi nghiên cứu phân tích UPGMA phần mềm Power marker v3.25 cho thấy giống bưởi có khác biệt khoảng cách di truyền, dao động từ 0,07 đến 0,37 chia thành nhóm rõ rệt (Hình 3.2) Từ kết phân tích đa dạng di truyền, giống bưởi đại diện cho nhóm giống có alen đặc trưng lựa chọn để giải trình tự Tổng số 20 mẫu giống lựa chọn gồm có: nhóm I - G2, G3, G27, G28, G29, G30, G26, G7, G10, G19, G20, G22; nhóm II G1, G4, G12, G8, G16, G13, G14, G15 3.1.2 Đánh giá đa dạng di truyền lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen chuối, nhãn, vải thị SCoT Kết phân tích đa dạng di truyền sử dụng 46 mồi SCoT 12 giống chuối, 29 giống nhãn, 14 giống vải thu được: - Đối với tập đoàn chuối: Kết đánh giá thị SCoT thu 29 thị cho đa hình, có 10 alen đặc trưng giống chuối (B4, B9, B10 B11) Hình Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giống chuối nghiên cứu Quan hệ di truyền giống chuối phân tích UPGMA phần mềm Power Marker cho thấy khoảng cách di truyền giống biến động từ 0,1528 đến 0,4583 chia thành nhóm lớn (Hình 3.6) Từ kết phân tích đa dạng di truyền, giống chuối đại diện cho nhóm giống có alen đặc trưng lựa chọn để giải trình tự Tổng số mẫu giống lựa chọn gồm có: nhóm I - B11, B9, B10; nhóm II - B4, B3, B5, B9, B2 - Đối với tập đoàn nhãn: thu 21 thị cho đa hình, có 15 alen đặc trưng giống nhãn (N5, N8, N9, N12, N14, N16, N17, N18 N29) Hình Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giống nhãn nghiên cứu Quan hệ di truyền 29 giống nhãn phân tích UPGMA phần mềm Power Marker cho thấy khoảng cách di truyền giống biến động từ 0,08 đến 0,36 chia thành nhóm lớn (Hình 3.7) Từ kết phân tích đa dạng di truyền, giống nhãn đại diện cho nhóm giống có alen đặc trưng lựa chọn để giải trình tự Tổng số 20 mẫu giống lựa chọn gồm có: nhóm I - N20, N23, N12, N21, N6, N13, N3, HTM2, N9, N10, N18, N8; nhóm II - N17, N14, N16, N29, N19, N28, N22 N26 - Đối với tập đồn vải: thu 22 thị cho đa hình, có 12 alen đặc trưng giống vải (L1, L2 L4, L5, L6, L9, L13 L14) Quan hệ di truyền 14 giống vải phân tích UPGMA phần mềm Power Marker cho thấy khoảng cách di truyền giống biến động 11 tương tự với kết tác giả Tshering cs (2010) phân tích tương quan trình tự bưởi Việt Nam trình tự tham khảo Tshering Kết thu được, trình tự chi Citrus xếp với thành nhóm, bưởi Thanh Trà Da Xanh đứng tách biệt với trình tự khác (Hình 3.12) Như vậy, đoạn mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL phân biệt đến chi Citrus 3.2.2 Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL giống chuối đại diện Phân tích so sánh trình tự đoạn gen rbcL thu từ giống chuối Việt Nam cho thấy: trình tự đoạn gen rbcL gần hồn tồn tương đồng (Hình 3.15) Giống chuối Tiêu Hồng - B2 có alen khác biệt vị trí 65 513 (C>A, TA) (Hình 3.20) Hình 3.20 So sánh trình tự gen rbcL giống vải nghiên cứu Kiểm tra hai trình tự ngân hàng gen thấy đột biến điểm hai trình tự vải hồn tồn khác biệt Hai trình tự đăng ký NCBI KU961571 KU961573 Kết phân tích tương quan di truyền trình tự vải Việt Nam trình tự tham chiếu Nephelium - AY724364, Dimocarpus - KY174176, KY174184, Litchi - KR529549, KR529548, AY188790… cho thấy, hai trình tự vải Thạch Bình - L3 Lục Ngạn chín sớm - L6 tách biệt với trình tự vải Việt Nam trình tự tham khảo giới với khoảng cách di truyền 0,004 Do đó, trình tự đoạn gen rbcL phân biệt đến chi Litchi 3.3 Xây dựng mã vạch ADN dựa vùng gen matK cho số nguồn gen nghiên cứu 3.3.1 Phân tích mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK giống bưởi đại diện Phân tích trình tự vùng gen matK giống bưởi nghiên cứu cho thấy có khác biệt giống bưởi Thanh Trà - G2 Da Xanh - G27 vị trí 762 tương đương với vị trí 1334 (C>T) có trình tự tham chiếu Oryza sativa - AY176644 Tiến hành BLAST trình tự NCBI, có 14 trình tự đạt tương đồng 100% so với G2 G27 LC461878, JN315361, JN315358 GQ434283 độ bao phủ không đạt 100% Do vậy, trình tự giúp phân biệt hai giống bưởi Thanh Trà Da Xanh Việt Nam so với giống bưởi khác tập đoàn nghiên cứu đăng ký mã số NCBI KR073222 KR073223 Hình 3.25 Cây phân loại dựa đoạn gen matK giống bƣởi nghiên cứu Kết phân tích tương quan di truyền giống bưởi Việt Nam giống tham chiếu C Maxima - AB626794, C Reticulata - JQ589068, C Limon - JN315359 cho thấy, giống bưởi Thanh Trà - G2 giống bưởi Da Xanh - G27 đứng tách biệt có khoảng cách với giống G1, G15, G16, G20, G22, G25 G29 0,002; với giống G3, G4, G10, G14, G28 G30 0,003; giống lại 0,001 (Hình 3.25) Hai đột biến điểm giống G2 G7 biến dị phân bố địa lý có ý nghĩa việc phân loại giống bưởi đặc sản Việt Nam Như vậy, đoạn mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK nhận biết đến chi Citrus 3.3.2 Phân tích mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK giống chuối đại diện Phân tích so sánh trình tự đoạn gen matK thu từ giống chuối 15 Việt Nam với trình tự thuộc chi Musa khác giới cho thấy: có khác biệt giống chuối Tiêu Hồng Trăm Nải vị trí 496 501 (tham chiếu từ trình tự có số đăng ký NCBI HF677508.1) Ngồi ra, giống chuối Tiêu Hồng - B2 có khác biệt so với giống lại vị trí SNP 519 (G>T), 659 (T>C) 825(G>A) (Hình 3.27) Hình 3.27 So sánh trình tự gen matK giống chuối nghiên cứu Tiến hành BLAST cho kết quả, chuối Tiêu Hồng Trăm Nải khác biệt với tồn trình tự ngân hàng gen vị trí 496bp 501bp Hai trình tự đăng ký NCBI với số đăng ký KR073220 KR073221 Tiến hành phân tích tương quan di truyền trình tự chuối Việt Nam trình tự tham chiếu thuộc chi Musa, Ensete… cho thấy, trình tự giống chuối nghiên cứu nhóm với trình tự thuộc chi Musa thành nhóm lớn tách biệt với chi Ensete Musella Do đó, kết phân nhóm dựa đoạn 787 nucleotit cho thấy đoạn gen matK phân loại đến chi Musa Kết tương tự với tác giả Saifudeen cs (2018) sử dụng mã vạch ADN dựa trình tự ITS nghiên cứu phân biệt 11 giống chuối 3.3.3 Phân tích mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK giống nhãn đại diện Phân tích trình tự giống Nhãn cho thấy, có khác biệt alen giống nhãn với tập đồn nhãn nghiên cứu vị trí 939 T>G (vị trí gen 16 matK, tham chiếu từ trình tự có số đăng ký NCBI AY724286.1) giống có khác biệt N10, N14, N16, N17, N19, N22, N26, N28 N29 Các trình tự có mã số NCBI KR073235, KR073239, KR073240, KR073241, KR073243, KR073245, KR073249, KR073251 KR073252 Hình 3.30 Cây phân loại dựa đoạn gen matK giống nhãn Kết phân tích tương quan di truyền giống nhãn Việt Nam trình tự tham chiếu thuộc chi Dimocarpus, Litchi cho thấy, trình tự chi Dimocarpus nhóm lại thành nhóm lớn, phân biệt rõ ràng với chi Litchi, Arytera, Sapindoidaea Cupaniopsis trình tự nhãn (N10, N14, N16, N17, N19, N22, N26, N28 N29) đứng tách biệt đứng tách biệt có khoảng cách di truyền với giống nhãn tập đoàn nghiên cứu 0,001 (Hình 3.30) Như vậy, tương tự kết nghiên cứu Suparat cs (2017), đoạn mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK nhận biết đến chi Dimocarpus 3.3.4 Phân tích mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK giống vải đại diện 17 Tiến hành phân tích trình tự giống vải nghiên cứu cho thấy khơng có sai khác trình tự vải Việt Nam trình tự tham khảo giới Hình 3.33 Cây phân loại dựa đoạn gen matK giống vải Phân tích tương quan di truyền trình tự vải Việt Nam trình tự tham chiếu thuộc chi Litchi, Dimocarpus… khơng có sai khác khoảng cách di truyền trình tự gen matK giống vải nghiên cứu với trình tự vải giới (Hình 3.33) Kết thực nghiệm cho thấy, đoạn gen matK nhận dạng đến chi Litchi Qua kết giải trình tự đoạn gen rbcL matK nguồn gen nghiên cứu, thấy, hai đoạn gen lục lạp hữu ích việc phân biệt họ, chi với Trong nội dung tiếp theo, mã vạch ADN mở rộng sử dụng để nghiên cứu nhận dạng nguồn gen nghiên cứu 3.4 Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho số nguồn gen nghiên cứu 3.4.1 Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho giống bưởi nghiên cứu Kết cho thấy tổng số 20 mẫu bưởi lập thư viện, có 17 mẫu có 18 liệu trình tự thơ đạt đủ tiêu chuẩn để tiến hành phân tích Trình tự giống tiến hành xếp phần mềm tích hợp Geneious Kết cho thấy, tổng số trình tự thơ xếp thành tổng số contig N>50 tất mẫu bưởi đạt 338.754 trình tự, đạt chiều dài tổng số 11,089Mb Bảng 3.6 Kết tập hợp đồ lắp ráp trình tự bƣởi Thơng số lọc Độ bao phủ hệ gen (Mb) GC% Số lượng scafold Tổng số tag có SNP 1SNP/tag SNP - 2alen/tag Tổng số SNP lọc ≥10 giống Số SNP (1SNP/tag) lọc ≥10 giống 1SNP/tag - alen≥10 giống Locut có SNP đặc trưng Mật độ SNP Các trình tự bƣởi Bản đồ lắp ráp 17 Bản đồ tham khảo HZU giống bƣởi VN (Xia cs, 2017) 11,089 345,757 46,9 11.699 1.612 18.465 23.592 10.466 14.273 14.274 8.357 6.489 4.773 3.184 4.730 2.176 1,665 2.613 0,068 Kết trình tự để xác định SNP đồ lắp ráp 17 giống bưởi Việt Nam đồ tham khảo HZU (Bảng 3.6) cho thấy tổng số scafold có SNP đạt 116.999/1.612 contig, tổng số tag có SNP 18.465/23.592, số lượng SNP chất lượng cao (1SNP/tag - alen) đạt 3.184/4.730 SNP Trong tổng số 3.184 SNP chất lượng cao, có 2.887 SNP đặc trưng 2.176 locut sử dụng để nhận dạng cho giống bưởi * Phân tích khả phân biệt giống bưởi cấu trúc di truyền nguồn gen dựa SNP thư viện GBS Về phân tích STRUCTURE cho thấy giống bưởi chia làm nhóm theo kiểu alen (Hình 3.35A) 19 Hình 3.35 Phân tích cấu trúc quần thể giống bƣởi locut SNP (K = 6) phần mềm STRUCTURE - Nhóm I: có kiểu alen phổ biến (màu xanh nhạt) gồm giống: G27, G4, G14, G28, G7, G19 Đây giống có màu ruột hồng - Nhóm II: gồm bốn giống G15, G3, G16, G2 (màu vàng) Tuy nhiên, giống G15 - có kiểu cấu trúc alen hồn tồn khác biệt so với nhóm I giống G26 Các giống bưởi đa phần có mùi thơm, độ cao, axit, có màu tép vàng nhạt, ngoại trừ giống G16 có màu ruột hồng giống có cấu tr c alen tương đồng so với giống khác nhóm chia sẻ phần lớn alen với nhóm - Nhóm III: gồm có giống bưởi G1 G20 (màu đỏ) Hai giống chia sẻ tỷ lệ nhỏ cấu trúc alen với nhóm giống khác - Nhóm IV: Giống bưởi G26 (màu xanh đậm) nhận biết với cấu trúc riêng biệt, mang ½ tổ hợp cấu tr c alen chia sẻ với nhóm khác Kết cấu trúc alen quần thể khơng có nhiều tương thích địa lý vùng trồng thị SNP phân nhóm 13 giống bưởi Việt Nam theo đặc điểm giống màu sắc, mùi thơm… Đặc biệt, có nhiều khác biệt cấu trúc di truyền, locut chung giống bưởi ruột hồng G16 - Lơng Cổ Cị (Tiền Giang) nhóm II giống bưởi ruột hồng nhóm I có ý nghĩa việc hình thành màu sắc chất lượng bưởi, 20 có ý nghĩa để nghiên cứu sâu công tác chọn tạo giống bưởi 3.4.2 Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho giống nhãn nghiên cứu Kết cho thấy tổng số 20 mẫu nhãn lập thư viện, có 11 mẫu có liệu trình tự thơ đạt đủ tiêu chuẩn để tiến hành phân tích Tổng số trình tự thô xếp thành tổng số contig N>50 cuả tất mẫu nhãn đạt 327.011 trình tự, đạt chiều dài tổng số 22,872Mb Tổng chiều dài contig mẫu nhãn biến thiên lớn từ 0,08Mb đến 11Mb Chiều dài contig biến thiên từ 93bp đến 801bp tùy thuộc vào mẫu (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Kết tập hợp đồ lắp ráp trình tự nhãn Thông số lọc Độ bao phủ hệ gen (Mb) GC% Số lượng scafold Tổng số tag có SNP 1SNP/tag SNP - 2alen/tag Tổng số SNP lọc ≥10 giống Số SNP (1SNP/tag) lọc ≥10 giống 1SNP/tag - alen≥10 giống Locut có SNP đặc trưng Mật độ SNP Nhãn Bản đồ lắp ráp 11 Bản đồ tham khảo giống nhãn Việt Nam) Yuling cs, 2017 22,872 471,88 59,0 33,7 257.114 17.367 218.645 96.702 39.403 13.468 278 11.464 4.608 82 562 74 43 9,560 0,205 Kết trình tự để xác định SNP hệ gen 11 giống nhãn Việt Nam cho thấy: tổng số SNP gọi từ hệ gen giống nhãn Việt Nam lớn gấp lần so với hệ gen tham chiếu Yuling cs, 2017 từ Trung Quốc (đạt 218.645 SNP so với 96.702) Trong đó, số SNP có 1SNP/tag có alen thu đồ lắp ráp cao nhiều lần so với đồ tham khảo (lần lượt 562 SNP 74 SNP so với SNP) Trong tổng số 74 21 SNP chất lượng cao, có 55 SNP đặc trưng 43 locut sử dụng để nhận dạng cho giống nhãn * Phân tích khả phân biệt giống nhãn cấu trúc di truyền nguồn gen dựa SNP thư viện GBS Hình 3.37 Phân tích cấu trúc quần thể giống nhãn locut SNP (K = 9) phần mềm STRUCTURE Phân tích cấu trúc di truyền quần thể giống nhãn nghiên cứu thực cho thấy giống nhãn phân thành nhóm (Hình 3.37A): Nhóm có tương đồng cao bao gồm giống (màu cam): N26, N22, N3, N20; Nhóm bao gồm giống (màu đỏ): N13, N21, N23 N10; Nhóm gồm giống N12, N19 N28 Hai giống nhãn N19 N28 có khác biệt di truyền lớn so với giống tập đoàn nghiên cứu Phân bố tương ứng lớn với phân loại tạo từ ma trận khoảng cách di truyền phần mềm Power Marker v.2.3.1 (Hình 3.37C) Kết phân nhóm khơng có tương đồng lớn với địa lý phân bố giống nhãn nghiên cứu 3.4.1 Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho giống vải nghiên cứu Kết cho thấy tổng số 14 mẫu vải lập thư viện, có 10 mẫu có liệu trình tự thơ đạt đủ tiêu chuẩn để tiến hành phân tích Tổng số trình tự thô xếp thành tổng số contig N>50 cuả tất 22 mẫu vải đạt 261.850 trình tự, đạt chiều dài tổng số 16,56Mb Kết thiết lập hệ gen từ 10 giống vải Việt Nam thu contig có chiều dài biến thiên từ 93bp đến 1.208bp, tỷ lệ GC đạt 49,4% Kết tập hợp cho thấy tổng số SNP thu 10 mẫu vải 44.195 Trong số SNP chất lượng cao, có 349 SNP đa hình (1SNP/tag - alen≥10 giống) Kết phân tích kiểu gen cụ thể locut cho thấy 151 locut có SNP đặc trưng (239 SNP), SNP gi p phân biệt 10 giống vải Việt Nam * Phân tích khả phân biệt giống cấu trúc di truyền giống vải nghiên cứu dựa locut SNP thư viện GBS Hình 3.39 Phân tích cấu trúc quần thể nguồn gen Vải locut SNP (K = 3) phần mềm STRUCTURE Phân tích cấu trúc kiểu gen SNP 10 giống vải phân bố thành nhóm Hình 3.39A: nhóm bao gồm giống có kiểu SNP nghiêng giống vải Thiều Thanh Hà (màu đỏ), gồm giống: L2, L3, L11, L12, L10, L6; Nhóm bao gồm kiểu gen nghiêng giống vải Lục Ngạn vụ (màu xanh đậm), gồm giống L5, L4 L7; Nhóm gồm có giống Thiều Khải Xuân - L14 có kiểu di truyền khác biệt (màu xanh lá) so với nhóm cịn lại Phân tích yếu tố phân nhóm thời vụ thu hoạch cho thấy giống chín vụ nằm phía phân tích cịn giống L14 23 phân bố phía ngược lại Tương tự nhóm giống chín sớm L4, L6, L7, L10 phân bố khơng tập trung theo nhóm mà rải rác xem kẽ với nhóm giống khác (Hình 3.39C) Phân tích cấu trúc phân tích yếu tố cấu thành quần thể cho thấy khơng có tương đồng phân bố địa lý phân nhóm theo tính trạng chín nghiên cứu sử dụng thị 155 SNP Trung Quốc (Wei cs, 2015), locut SNP đề tài nghiên cứu lớn gấp đôi so với số liệu Wei Liu Tuy nhiên, SNP nghiên cứu có khả phân biệt 10 giống tập đoàn nghiên cứu với KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Kết phân tích đa dạng di truyền nguồn gen thị phân tử EST-SSR/ SCoT thu 15 alen đặc trưng cho giống bưởi, 10 alen đặc trưng giống chuối, 15 alen đặc trưng giống nhãn 12 alen đặc trưng giống vải - Trên sở khoảng cách di truyền kết phân tích alen đặc trưng lựa chọn 62 mẫu giống đại diện nhóm đối tượng nghiên cứu (bao gồm 20 giống bưởi, giống chuối, 20 giống nhãn 14 giống vải) để xây dựng mã vạch ADN - Kết nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN dựa vùng gen rbcL phát alen đặc trưng vị trí 583bp giống bưởi (bưởi Thanh Trà Da Xanh) vị trí 317bp giống vải (vải Thạch Bình Lục Ngạn chín sớm) Các trình tự đăng ký ngân hàng gen NCBI với mã số KR073282, KR073281, KU961571 KU961573 - Kết nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN dựa vùng gen matK phát alen đặc trưng vị trí 762bp giống bưởi (bưởi Thanh Trà Da Xanh), vị trí 496bp 501bp giống chuối (Tiêu Hồng Trăm Nải), vị trí 939bp giống nhãn (nhãn Bản Nguyên, Long Gia Sần, Tiêu Vũng Tàu, Tiêu Da Me, Nhãn Sài Gòn, Cơm Vàng Bánh Xe, Xuồng 24 Cơm Ráo, Long Tiêu Xuồng Cơm Vàng Bà Rịa) Các trình tự đăng ký ngân hàng gen NCBI với mã số KR073222, KR073223, KR073220, KR073221, KR073235, KR073239, KR073240, KR073241, KR073243, KR073245, KR073249, KR073251 KR073252 - Kết nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS thu 03 contig gồm có: contig bưởi có chiều dài 11,089 Mb với 2.176 locut cho 2.887 SNP đặc trưng sử dụng để phân biệt 17 giống bưởi (Ph c Trạch, Thanh Trà, Ph Diễn, bưởi Đỏ, Đường Hiệp Thuận, Quế Dương, bưởi Ổi, bưởi Trụ, Luận Văn, Đoan Hùng, Lông Cổ Cò, Hồng Đường, Bằng Luân, Năm Roi, Da Xanh, Thanh Da Láng Đường Da Láng); contig nhãn có chiều dài 22,872 Mb với 43 locut cho 55 SNP đặc trưng sử dụng để phân biệt 11 giống nhãn (Lồng Hưng Yên chín muộn, Bản Nguyên, nhãn Việt Trì, Phong Châu 5, nhãn Sài Gịn, Tiêu Lá Dài, nhãn Cùi, Cơm Vàng Bánh Xe, Cùi Diếc, Xuồng Cơm Ráo Long Tiêu); contig vải có chiều dài 16,56 Mb với 151 locut cho 239 SNP đặc trưng sử dụng để phân biệt 10 giống vải (Thiều Thanh Hà, Thạch Bình, Ph Động chua chín sớm, Lục Ngạn vụ, Lục Ngạn chín sớm, Bình Khê chín sớm, U Hồng vặn, Nguyên Hồng, Xuân Đỉnh vải Thiều Khải Xuân) - Kết nghiên cứu đề tài luận án locut SNP đặc trưng sử dụng để phát triển thị phân tử/ mã vạch phân tử ADN (DNA barcode) giống trồng địa đặc sản Việt Nam phục vụ nhận dạng sớm, nghiên cứu đa dạng, bảo tồn chọn tạo giống trồng có giá trị kinh tế Đề nghị Cần tiếp tục mở rộng đánh giá đa dạng di truyền xây dựng mã vạch ADN cho nhiều nguồn gen đặc sản địa Việt Nam để phát triển mã vạch ADN rút gọn (mini barcode) phục vụ việc phân loại, nhận dạng sớm nguồn gen trồng cách nhanh chóng xác Xây dựng thị phân tử có tính đa hình cao để phát triển thành SNPCHIP ứng dụng hệ thống tự động hóa phục vụ chọn giống, lập đồ tính trạng thị phân tử… 25 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2017), “Nghiên cứu nhận dạng phân tử số nguồn gen vải địa phương thị SCoT”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số năm 2017, tr 14-17 Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lan Hoa, Hà Minh Loan, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Lã Tuấn Nghĩa (2018), “Nghiên cứu đa dạng di truyền đoạn gen matK số nguồn gen chuôi Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, số 10 năm 2018, tr 39-44 Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Lã Tuấn Nghĩa (2018), “Nghiên cứu đa dạng di truyền đoạn gen rbcL số nguồn gen bưởi Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, số 11 năm 2018, tr 65-69 Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Lã Tuấn Nghĩa (2019), “Nghiên cứu đa dạng di truyền đoạn gen matK số nguồn gen nhãn Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, tập số 61, số năm 2019, tr 61-64 ... án: ? ?Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN số nguồn gen trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn chọn tạo giống? ?? Mục tiêu nghiên cứu đề tài luận án Lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen bưởi,... 3: Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen matK cho số nguồn gen nghiên cứu 4 - Nội dung 4: Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa SNP công nghệ GBS cho số nguồn gen nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên. .. quan hệ di truyền giống vải nghiên cứu 3.2 Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL cho số nguồn gen nghiên cứu 3.2.1 Xây dựng mã vạch ADN dựa trình tự vùng gen rbcL giống bưởi đại diện