Nghiên cứu đa dạng nguồn gen cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về đặc điểm nông sinh học, phân nhóm theo các tính trạng đặc trưng và mức độ đa dạng di truyền c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

HOÀNG THỊ NGA

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN

CÂY SEN (Nelumbo nucifera Gaertn.) PHỤC VỤ

CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội - 2016

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

HOÀNG THỊ NGA

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN

CÂY SEN (Nelumbo nucifera Gaertn.) PHỤC VỤ

CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình

của các Thầy, Cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ -

Hội Giống cây trồng Việt Nam, PGS.TS Lã Tuấn Nghĩa - Giám đốc Trung tâm Tài nguyên thực vật - những Cô Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Tài nguyên thực vật, Lãnh đạo Bộ môn Quản lý Ngân hàng gen, các bạn bè đồng nghiệp trong Trung tâm Tài nguyên thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá

trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các anh, chị, em trong Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ

và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các tập thể, cá nhân, bà con nông dân tại Bắc

Ninh, Bắc Giang, Hà Nam, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Nghệ An,

Quảng Ninh, Thừa Thiên Huế, Đồng Tháp và cơ sở chế biến sen lão tại Hưng Yên

đã hợp tác giúp đỡ và chia sẻ thông tin, kinh nghiệm quý báu, cung cấp các mẫu

giống sen trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình đã luôn bên

cạnh, động viên khích lệ, tiếp thêm sức mạnh và nghị lực để tôi hoàn thiện công

trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Hoàng Thị Nga

1.2 Tình hình sản xuất và thị trường các sản phẩm từ cây sen trên thế giới và

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen trên thế giới 15 1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen ở Việt Nam 16

1.3.1 Đa dạng di truyền và các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền 19 1.3.2 Một số loại chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong đánh giá đa dạng

1.5.2 Kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc, quản lý sâu bệnh hại 36

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu 40

2.2.1 Điều tra tình hình sản xuất, thị trường và thu thập các mẫu giống sen tại

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống trong tập đoàn

2.2.4 Đánh giá và xác định một số mẫu giống sen triển vọng 43

2.4.1 Phương pháp điều tra tình hình sản xuất, thị trường và thu thập các mẫu

2.4.2 Phương pháp, mô tả đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống

2.4.3 Các phương pháp sử dụng đánh giá đa dạng di truyền 49

3.1 Hiện trạng sản xuất, thị trường và thu thập các mẫu giống sen tại một số

3.1.1 Hiện trạng sản xuất, thị trường các sản phẩm từ cây sen 59

3.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống sen 78 3.2.1 Đặc điểm thân, lá của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen 78 3.2.2 Đặc điểm nụ hoa và hoa của các mẫu giống trong tập đoàn sen 83 3.2.3 Đặc điểm nhị hoa của các mẫu giống trong tập đoàn sen 90 3.2.4 Đặc điểm gương, hạt sen của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen 95 3.2.5 Khả năng sinh trưởng, phát triển của các mẫu giống sen 99

3.2.7 Đánh giá tình hình sâu bệnh hại của các mẫu giống sen 103 3.2.8 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất hạt sen của các mẫu giống 107

3.3 Đánh giá tính đa dạng di truyền các mẫu giống sen trong tập đoàn 110 3.3.1 Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống sen dựa vào kiểu hình 111 3.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống sen bằng chỉ thị SSR 121 3.3.3 Đề xuất các hướng khai thác sử dụng nguồn gen sen hiện có 129 3.4 Đánh giá, xác định một số mẫu giống sen triển vọng có tiềm năng khai

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc ARN Ribonucleic Acid- Axit Ribonucleic

BGCI Botanic Gardens Conservation International

Bảo tồn vườn thực vật quốc tế Cinet Trang thông tin điện tử Bộ Văn hóa, Thể thao, Du lịch

DNA Deoxyribonucleic Acid-Axit Deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

IWGS International Waterlily and Water Gardening Society –

Hiệp hội làm vườn cây thủy sinh và hoa súng quốc tế ISSR Inter-Simple Sequence Repeats -Chuỗi lặp lại đơn giản giữa

Kew Royal Botanic Gardens, Kew-Vườn thực vật Hoàng Gia Anh Kew

NN và PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

PCA Phương pháp phân tích phối hợp chính

PCR Polymerase Chain Reaction-

Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA

DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên SSR Simple Sequence Repeats – Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản

SWOT Strengths - Weaknesses - Opportunities - Threats

Phân tích SWOT: điểm mạnh, điểm yếu, cơ hội và thách thức TNTV Tài nguyên thực vật

TPP Trans-Pacific Strategic Economic Partnership Agreement

Hiệp định Đối tác Kinh tế Xuyên Thái Bình Dương VHTTDL Văn hóa Thể thao Du lịch

WA Water Agar -Môi trường nước Agar

DANH MỤC BẢNG

TT

Bảng

2.1 Danh sách các mẫu giống sen được thu thập năm 2011-2012 và bảo

tồn tại Trung tâm TNTV (An Khánh-Hoài Đức-Hà Nội)

40

2.2 Danh sách các chỉ thị SSR sử dụng trong nghiên cứu 42

3.1 Diện tích và các giống sen hiện trồng tại các địa phương,

(Kết quả điều tra năm 2012-2013)

3.4 Các sản phẩm từ cây sen và thị trường tiêu thụ

( Điều tra năm 2012-2013)

3.9 Tham số thống kê tính trạng số lượng về thân lá của các mẫu giống

sen theo nhóm (năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

81

3.10 Phân nhóm các mẫu giống sen theo đặc điểm nụ hoa và hoa

(năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

84

3.11 Tham số thống kê các tính trạng số lượng về cánh hoa lớp bên ngoài

của các mẫu giống sen phân theo nhóm (năm 2012-2013, Hoài

Đức-Hà Nội)

88

3.12 Tham số thống kê các tính trạng số lượng về cánh hoa lớp bên trong

của các mẫu giống sen phân theo nhóm (năm 2012-2013, Hoài

Đức-Hà Nội)

90

3.13 Phân nhóm các mẫu giống sen theo đặc điểm nhị hoa

(năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

91

TT

Bảng

3.14 Tham số thống kê tính trạng số lượng về nhị hoa của các mẫu giống

sen (năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

93

3.15 Tham số thống kê tính trạng số lượng về nụ, hoa và năng suất hoa của

các mẫu giống sen (năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

94

3.16 Phân nhóm các mẫu giống theo đặc điểm gương sen và hạt sen (năm

2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

98

3.17 Phân nhóm các mẫu giống sen qua các giai đoạn sinh trưởng và tham

số thống kê (năm 2012-2013, Hoài Đức- Hà Nội)

100

3.18 Tình hình sâu hại trên cây sen (Hoài Đức, 2012-2014) 104 3.19 Mức độ nhiễm bệnh thối thân trên cây sen (Hoài Đức, 2015) 105 3.20 Phân nhóm các mẫu giống sen theo một số tính trạng chính và năng

suất hạt sen (năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

108

3.22 Thông tin đa hình các locut SSR ở các mẫu giống sen nghiên cứu 124 3.23 Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 42 mẫu giống sen 126 3.24 Đặc điểm sinh trưởng của 7 mẫu giống thuộc nhóm sen lấy hoa

(năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

134

3.25 Đặc điểm sinh trưởng phát triển của 7 mẫu giống thuộc nhóm sen lấy

hoa (năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

134

3.26 Số lượng cánh hoa, nhị hoa của 7 mẫu giống thuộc nhóm sen lấy hoa

(năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

135

3.27 Năng suất và chất lượng hoa của 7 mẫu giống thuộc nhóm sen lấy

hoa (năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

137

3.28 Phân nhóm 33 mẫu giống sen lấy hạt theo sinh trưởng, phát triển

và các tham số thống kê (năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

140

3.29 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của 18 mẫu giống sen lấy hạt

(năm 2013, Hoài Đức, Hà Nội)

142

3.30 Một số đặc điểm nông học và năng suất hạt của 18 mẫu giống sen

lấy hạt (năm 2013-2014, Hoài Đức-Hà Nội)

144

3.31 Đặc điểm sinh trưởng phát triển của 3 giống sen lấy hạt triển vọng

(năm 2014, Hoài Đức, Hà Nội)

145

TT

Bảng

3.32 Một số tính trạng chính và năng suất của 3 giống sen lấy hạt triển

vọng (năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

146

3.33 Đặc điểm hạt sen của 3 mẫu giống sen lấy hạt triển vọng

(năm 2014, Hoài Đức-Hà Nội)

146

3.35 Đặc điểm sinh trưởng phát triển của 2 giống sen lấy củ

(năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

148

3.36 Một số tính trạng và năng suất của 2 giống sen lấy củ

(năm 2012-2013, Hoài Đức-Hà Nội)

149

DANH MỤC HÌNH

TT

Hình

2.2 Sơ đồ tuyển chọn, xác định giống sen lấy hạt triển vọng 54 3.1 Một số hình ảnh về hoạt động điều tra tình hình sản xuất, thị

trường tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen

68

3.3 Bản đồ phân bố 42 mẫu giống sen thu thập tại các vùng khác nhau

trong cả nước

76

3.4 Hình dạng nụ hoa của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen 85 3.5 Cấu tạo kiểu hoa của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen 85 3.6 Hình dạng hoa của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen 86 3.7 Cánh hoa ở lớp cánh bên ngoài, lớp cánh bên trong

và hình dạng nhị hoa của các mẫu giống trong tập đoàn cây sen

86

3.9 Bề mặt gương sen và vị trí đính hạt trên gương sen 96

3.11 Hình dạng hạt sen của các mẫu giống trong tập đoàn 97

3.13 Tương quan giữa năng suất sen chè và tỷ lệ hạt chắc/gương 102 3.14 Tương quan giữa năng suất sen chè và số hạt/gương sen 102 3.15 Tương quan giữa năng suất sen chè và khối lượng 100 hạt 102 3.16 Tương quan giữa năng suất sen chè và số hàng hạt/gương sen 102

3.17 Nấm Pythium sp và Phythopthora sp gây thối thân ở sen Lai lùn S7 106 3.18 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 42 mẫu giống sen dựa

trên chỉ thị hình thái với 26 tính trạng hình thái nông học

114

3.19 Hình ảnh điện di ADN tổng số của 42 mẫu giống sen trên gel

agarose 1%

121

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở Việt Nam cây sen mọc hoang dại và được trồng khá phổ biến suốt từ Bắc vào Nam trong các ao, hồ, đầm, ruộng sâu nhiều bùn, thậm chí có thể sinh trưởng, phát triển tốt ngay cả trong điều kiện đất trũng, nước ngập sâu mà các cây trồng khác không thể tồn tại được Diện tích trồng sen ở nước ta còn ít, ước chừng khoảng trên 3000 ha, nhưng hàng năm đã cung cấp từ vài trăm đến 1.000 tấn hạt sen cho thị trường trong nước và xuất khẩu Từ lâu cây sen đã trở nên thân thuộc và gần gũi với người dân Việt Nam Miền Bắc nổi tiếng với sen Tây Hồ dùng làm hoa cảnh và ướp chè; miền Trung có sen Hồng Nghệ An; sen Trắng Đại nội Huế dùng lấy hạt, làm hoa cảnh; miền Nam có sen Hồng Đồng Tháp lấy hạt Giá trị của cây sen không chỉ dừng lại ở ý nghĩa vật chất, kinh tế mà còn mang cả ý nghĩa về mặt tinh thần Tại Myanmar từ cuống lá sen người ta còn có thể sản xuất ra tơ và vải lụa gắn với tín ngưỡng Phật giáo (Bộ Ngoại giao Việt Nam, 2013)

Hầu hết các bộ phận của cây sen đều có thể sử dụng được trong văn hóa ẩm thực và trong y học Từ phiến lá, cuống lá, nụ, hoa, hạt đến ngó sen, củ sen đều có thể dùng để chế biến các món ăn, thức uống ngon và bổ dưỡng như nộm ngó sen, mứt sen, chè sen Huế, gà hấp lá sen, cá hấp lá sen, bánh lá sen, củ sen muối, cốm trong lá sen, trà sen Tây Hồ, rượu sen Đồng Tháp… mang đậm nét văn hóa Việt Hạt sen và củ sen là những thực phẩm quý, giàu dinh dưỡng, chứa nhiều nguyên tố

vi lượng, các vitamin, chất xơ… giúp tăng cường sức khỏe cho con người (Nguyen, Q., 2001b) Hạt sen, tâm sen, lá sen cũng là những nguyên liệu quý trong các bài thuốc cổ truyền giúp an thần, điều trị mất ngủ, ổn định huyết áp và cầm máu

Giá trị tinh thần mà cây sen mang lại được thể hiện trong các lĩnh vực văn học, văn hóa mỹ thuật Hình ảnh hoa sen xuất hiện rất nhiều trong thơ ca nhằm ca ngợi Bác Hồ kính yêu: “Tháp Mười đẹp nhất bông sen/Việt Nam đẹp nhất có tên Bác Hồ”; Ca ngợi sức sống bền vững và mãnh liệt: “Hoa sen mọc bãi cát lâm/Tuy rằng lấm láp vẫn mầm hoa sen” và ca ngợi tình yêu đôi lứa: “Hôm qua tát nước đầu

đình/Bỏ quên chiếc áo trên cành hoa sen” Hình ảnh hoa sen còn xuất hiện trong nhiều tác phẩm nghệ thuật từ thời Đinh, Lý, Trần, Lê như kiến trúc Chùa Một Cột, bia tiến sĩ ở Văn Miếu, bệ tượng Phật… và hiện nay là biểu tượng của Hãng hàng không quốc gia Việt Nam hay trên trang thông tin điện tử của Bộ VHTTDL Tại các vùng trồng sen người dân còn gắn với du lịch sinh thái để phục vụ giáo dục và quảng bá hình ảnh quê hương đất nước

Tuy đã có vị trí nhất định trong đời sống văn hóa và đậm nét trong tiềm thức của người Việt nhưng đến nay hoa sen vẫn chưa được lựa chọn, suy tôn là Quốc hoa của Việt Nam, mặc dù kết quả lựa chọn Quốc hoa do Bộ VHTTDL tổ chức năm

2011 được người dân hưởng ứng, đã có 62,1% ý kiến được hỏi trên mạng internet chọn hoa sen là Quốc hoa Việt Nam (Thanh Hoài, 2013) Một số nguyên nhân chính được xác định do: (1) Hoa sen Trắng đã được Ấn Độ tôn vinh là Quốc hoa; (2) Bộ sưu tập hoa sen của Việt Nam còn nghèo nàn, đồng thời ở miền Bắc nước ta chỉ có duy nhất 1 vụ sen/năm; (3) Hoa sen rất nhanh tàn; (4) Nghiên cứu và khai thác công dụng của cây sen còn rất hạn chế, vì vậy giá trị cũng như vị thế của cây sen chưa xứng tầm với những gì vốn có thuộc về loài cây này (Đặng Văn Đông, 2011), do đó rất cần có những nghiên cứu sâu thêm về giống và kỹ thuật canh tác

Trong khi đó, hiện nay các giống sen địa phương có các đặc tính quí đang bị suy giảm một cách nghiêm trọng và đứng trước nguy cơ mất dần theo thời gian do phương thức tự để giống và lối canh tác theo kinh nghiệm dân gian, sản xuất manh mún, tự phát, thiếu qui hoạch tổng thể và diện tích trồng sen có xu hướng giảm dần

do qũy đất nông nghiệp ngày càng hạn hẹp Việc chế biến sản phẩm sen tươi hoàn toàn thủ công chưa có máy móc hỗ trợ nên không thể sản xuất hàng hóa lớn cũng là một nguyên nhân hạn chế việc mở rộng diện tích trồng sen ở nhiều vùng có điều kiện thuận lợi phát triển sen Hơn nữa, việc nghiên cứu trên cây sen chưa nhiều, chủ yếu tập trung vào lĩnh vực thực phẩm và dược liệu dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng thông thường, mới có một số nghiên cứu nhập nội giống và kỹ thuật canh tác trong khi công tác bảo tồn và chọn tạo giống sen ở Việt Nam hầu như chưa được quan tâm nghiên cứu

Tạo lập tập đoàn sen với đầy đủ các dữ liệu quản lý, dữ liệu mô tả, đánh giá của các giống sen ở Việt Nam để phục vụ công tác bảo tồn và khai thác sử dụng là việc làm tất yếu, cấp bách phục vụ công tác bảo tồn và khai thác tài nguyên hoa sen trong nền kinh tế tri thức

Đánh giá nguồn gen, bao gồm đánh giá đa dạng di truyền và xác định đơn vị bảo tồn (kiểu gen) là công đoạn quan trọng trong công tác bảo tồn và sử dụng nguồn gen thực vật Hiểu biết về phân loại, phân nhóm và mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen là cơ sở để sử dụng hiệu quả nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống sen mới cũng như định hướng bảo tồn và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ

về sản phẩm hoa sen bản địa quí Tuy nhiên, đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá và phân lập tập đoàn sen ở Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng của giống và bằng chỉ thị phân tử, từ đó đề xuất hướng khai thác sử dụng nguồn gen cây sen phục vụ cho bảo tồn và chọn tạo cải tiến giống sen

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng

nguồn gen cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống”

2 Mục tiêu của đề tài

Điều tra thu thập và tạo lập được tập đoàn cây sen có quy mô 35-40 mẫu giống, xây dựng được bản đồ phân bố các mẫu giống sen trong tập đoàn

Đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, đa dạng hình thái và mức độ đa dạng di truyền của các mẫu giống sen trong tập đoàn phục vụ cho công tác bảo tồn

và chọn tạo giống

Tuyển chọn, xác định được các mẫu giống sen triển vọng, phù hợp cho các mục đích sử dụng khác nhau (lấy hoa, lấy hạt, lấy củ) và một số tổ hợp lai tiềm năng phục vụ cho công tác chọn tạo, cải tiến giống sen

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về đặc điểm nông sinh học, phân nhóm theo các tính trạng đặc trưng và mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn 42 mẫu giống sen được thu thập từ các vùng miền của Việt Nam cũng như nguồn vật liệu di truyền khởi đầu cho công tác bảo tồn và chọn tạo giống sen

Luận án là tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu, đào tạo, bảo tồn

và phát triển nguồn gen cây sen Việt Nam

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đã chỉ ra được những khó khăn và hạn chế của sản xuất và tiêu thụ sen, góp phần thiết thực vào việc định hướng bảo tồn và phát triển cây sen ở ĐBSH nói riêng

và cả nước nói chung

Kết quả về đánh giá đặc điểm nông sinh học và phân tích đa dạng di truyền là

cơ sở khoa học để đề xuất các hướng khai thác sử dụng hiệu quả tập đoàn 42 mẫu giống sen hiện có

Đề tài đã tuyển chọn và giới thiệu cho sản xuất 6 giống sen triển vọng, trong

đó có 3 giống sen lấy hoa gồm sen Tây Hồ (S21), sen Trắng (S22) sen Cảnh (S25)

và 3 giống sen lấy hạt là sen Mặt Bằng (S2), sen Bát xanh (S12) và sen Cánh hồng (S18) Bước đầu đề xuất được 8 tổ hợp lai cho mục đích sen lấy hoa, sen lấy hạt, phục vụ công tác chọn tạo giống sen

4 Những đóng góp mới của đề tài

Tạo lập được tập đoàn với 42 mẫu giống sen Việt Nam với đầy đủ bộ dữ liệu

về quản lý và dữ liệu mô tả là nguồn vật liệu di truyền quí phục vụ công tác bảo tồn

và khai thác sử dụng nguồn gen sen ở Việt Nam

Bổ sung những dẫn liệu khoa học mới về đặc điểm nông sinh học và đa dạng

di truyền của 42 mẫu giống sen thu thập từ 3 miền của Việt Nam Kết quả phân

nhóm mẫu giống theo các tính trạng đặc trưng, theo mối quan hệ di truyền dựa trên

sự kết hợp phân tích chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử là cơ sở khoa học tin cậy cho công tác bảo tồn và khai thác sử dụng hiệu quả các nguồn gen sen hiện có Giới thiệu 8 tổ hợp lai và 6 giống sen triển vọng cho mục đích lấy hoa, lấy hạt phục vụ sản xuất, nhằm nâng cao giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây sen

5 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu giống sen hiện còn tồn tại trong sản xuất và đã được trồng tại Việt Nam; hiện trạng sản xuất và thị trường sen tại vùng ĐBSH; đa dạng di truyền của

42 mẫu nguồn gen sen hiện có

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Điều tra, đánh giá tình hình sản xuất và thị trường tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen chỉ tiến hành tại 6 tỉnh ở miền Bắc bao gồm Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên và Hà Nam

Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, đa dạng hình thái và tính đa dạng di truyền của tập đoàn 42 mẫu giống sen được thu thập từ 10 tỉnh thành trong cả nước gồm: Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nam, Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ An, Thừa Thiên Huế và Đồng Tháp

Tuyển chọn xác định giống sen triển vọng theo các mục đích sử dụng

Toàn bộ các thí nghiệm của đề tài được thực hiện tại Trung tâm Tài nguyên thực vật trong thời gian từ 2011-2015

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về cây sen

1.1.1 Nguồn gốc cây sen

Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) là loại cây thủy sinh đa niên có nguồn

gốc từ các nước châu Á nhiệt đới (Trần Hợp, 2000), xuất phát từ Ấn Độ (Makino and Tomitaro, 1979), sau đó được đưa đến Trung Quốc, Nhật Bản, vùng bắc châu

Úc và nhiều nước khác Ngày nay, cây sen được trồng phổ biến tại Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc… đồng thời các sản phẩm từ cây sen cũng được tiêu thụ mạnh khắp châu Á (Nguyễn Phước Tuyên, 2007)

Sen là một trong 12 loài cây thủy sinh được trồng cách đây hơn 3.000 năm Cây sen còn được coi là một trong số những cây cổ nhất cho đến nay Năm 1972, các nhà khảo cổ của Trung Quốc đã tìm thấy hóa thạch của hạt sen 5.000 tuổi ở tỉnh Vân Nam Năm 1973, hạt sen 7.000 tuổi khác được tìm thấy ở tỉnh Chekiang Một lượng lớn hạt sen được khám phá ở tỉnh Shan-tung, Liaoning và ngoại thành phía tây Bắc Kinh có niên đại trên 1.000 năm Shen Miller và cs., (1995) phát hiện hạt sen 1228±271 tuổi trong những hồ cổ của tỉnh Putatien, Liaoning vẫn còn khả năng nẩy mầm, một kỷ lục về sức sống bền lâu nhất được ghi nhận từ trước tới nay Hạt sen tìm thấy ở Đông bắc Trung Quốc nằm trong vùng nhiệt độ thấp được phủ một lớp bùn, hạt vẫn duy trì được sức sống sau hơn 600 năm (Xueming H., 1987)

Các nhà khảo cổ Nhật Bản cũng tìm thấy những hạt sen đã bị đốt cháy trong

hồ cổ sâu 6m tại Chiba có niên đại 1.200 năm (Iwao, 1986) Một số giống sen lấy hạt có nguồn gốc từ Nhật Bản nhưng các giống sen lấy củ thì xuất phát từ Trung Quốc (Takahashi B., 1994) Các giống sen của Trung Quốc khi du nhập sang Nhật Bản bị nội địa hóa và mang các tên gọi Nhật Bản như Taihakubasu, Benitenjo, Kunshikobasu, Sakurabasu và Tenjinkubasu (Yamaguchi M., 1990) Ngày nay, các quẩn thể sen dạng hoang dại vẫn được tìm thấy dễ dàng tại các nước châu Á và châu Mỹ (Qichao and Xingyan, 2005)

1.1.2 Phân loại và phân bố cây sen

Cây sen (N nucifera Gaertn.) thuộc chi Nelumbo Adans, họ sen

-Nelumbonaceae, bộ sen -Nelumbonales, phân lớp Mộc Lan - Magnoliales, lớp hai

lá mầm - Dicotyledonae, ngành thực vật hạt kín - Angiospermea (Phạm Văn Duệ, 2005) Trong bộ sen chỉ có duy nhất một họ sen và trong họ sen chỉ có một chi

Nelumbo Adans với hai loài rất gần nhau là N nucifera và N lutea (Savolainen and

Chase, 2003) Loài N nucifera Gaertn được phân bố ở châu Á và châu Đại Dương còn N lutea Willd (sen Mỹ) phân bố ở Bắc và Nam Mỹ (Qichao and Xingyan,

2005) Hai loài sen này khác biệt nhau bởi đặc điểm hình thái giữa chúng như kích

cỡ cây, hình dạng lá, hình dạng và màu sắc cánh hoa (Zhang Xy et al., 2011).

Loài N nucifera Gaernt có bộ nhiễm sắc thể 2n=16, được trồng làm sen

cảnh, sen lấy củ và sen lấy hạt Đặc điểm thân dày, cao và nhiều gai, củ đều phát triển ở đáy ruộng hoặc ao, lá gần tròn có đường kính lớn Cây non có khả năng

thích nghi trong nước sâu rất nhanh (Magness et al., 1971) Một chu kỳ sống của

cây sen thường chưa tới 12 tháng, thông thường cây sen cần phải mất từ 4-6 tháng

để hình thành lá, nụ, hoa, hạt, củ, trưởng thành trước khi bước sang giai đoạn ngừng sinh trưởng của cây (Xueming, 1987)

Loài N lutea Willd hình thành ở tầng nước nông rồi phát triển ra vùng nước

sâu hơn, mực nước thích hợp từ 0,6-2,0 m Thời gian nở hoa từ tháng 6-9, hoa màu vàng hoặc màu kem, đường kính từ 7,6 đến 20,0 cm, kéo dài 3-4 ngày Ở châu Mỹ, môi trường sống của cây sen trong tự nhiên đã và đang bị phá hủy nên những quần

thể sen của loài N lutea Willd đã giảm đáng kể về diện tích, chúng đã được đưa

vào danh sách loài có nguy cơ tuyệt chủng ở New Jersey, Pennsylvania và bị đe dọa

ở Michigan, Delaware (Sayre, 2004)

Theo kết quả nghiên cứu của Warner-Orozco O (2009), hầu hết các giống sen

được lai tạo ra giữa loài N lutea với N nucifera là các giống sen cảnh

Ở Việt Nam, cây sen chỉ có một loài là N nucifera, phân bố rộng rãi khắp

mọi nơi trong các ao, hồ, đầm lầy hay ruộng sâu Các tỉnh trồng nhiều sen như Bắc

Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An và khu vực ĐBSCL (như Đồng Tháp, An Giang, Sóc Trăng, Long An…) Hàng trăm hecta sen mọc tập trung và gần như thuần chủng, đã tạo nên cảnh quan sinh thái đặc biệt của vùng Đồng Tháp Mười Trước đây cây sen chủ yếu mọc hoang dại theo trạng thái tự nhiên và đã có

từ lâu, nhưng hiện nay ở một số nơi sen là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao

và còn dùng làm cây cảnh ở các công sở, trường học (Đặng Văn Đông, 2011)

1.1.3 Giá trị của cây sen

1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng

Giá trị dinh dưỡng trong củ sen và hạt sen được Nguyen, Q (2001a) đề cập ở bảng 1.1 Hạt sen và củ sen gồm rất nhiều dinh dưỡng bổ ích Hạt sen, ngó sen,củ sen là các sản phẩm mang lại giá trị dinh dưỡng cao nhất ở cây sen, chúng bao gồm protein, lipid, gluxit, các chất khoáng (canxi, sắt, photpho, natri, kali, tro), chất xơ, vitamin ( B1, B2, C) và nhiều axit amin không thay thế, rất cần thiết cho con người Hạt sen có hàm lượng bột đường, protein khá cao, ít chất béo, hàm lượng canxi cao cần thiết cho phát triển xương, giúp lưu thông máu và chất dịch trong cơ thể

Bảng 1.1 Giá trị dƣỡng trong 100 g củ sen và hạt sen

1.1.3.2 Giá trị y học

Trong y học, sen được coi là một loại thảo dược truyền thống quan trọng của

Trung Quốc và nhiều nước ở châu Á bởi tất cả các bộ phận của cây sen đều được sử

dụng (Xueming, 1987) Theo danh y Lê Hữu Trác, nhờ hấp thụ được thanh khí và

hương thơm của đất trời nên toàn bộ các bộ phận của cây sen đều được sử dụng làm

các bài thuốc cổ truyền rất hiệu nghiệm (Đặng Văn Đông, 2011) Điều này được

minh chứng qua nhiều nghiên cứu dưới đây:

Lá sen là chất làm mát, có tác dụng làm se vết thương, lợi tiểu được dùng

chữa tiêu chảy, sốt cao, bệnh trĩ và bệnh phong (Nguyen Q., 1999; Ku-Lee et al.,

2005) Ngoài ra một loại rượu của Hàn Quốc được làm từ lá và hoa sen có chứa các

hoạt chất chống ôxy hóa, làm giảm stress, chống nguy cơ mắc bệnh mãn tính

(Ku-Lee et al., 2005). Hợp chất nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn,

ức chế thần kinh trung ương, chống viêm, giảm đau, chống ho, kháng serotonin và

có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic Ngoài ra, nuciferin có tác dụng tăng

cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác (Nguyễn Thị

Nhung và cs., 2000, Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012)

Hoa sen có chứa các hợp chất alkaloid làm giãn mạch, hạ huyết áp và có khả

năng chống loạn nhịp tim Cánh hoa được dùng điều trị bệnh giang mai, cuống hoa

kết hợp với các loại thảo mộc khác điều trị chảy máu tử cung (Ku-Lee et al., 2005)

Nhị hoa giúp củng cố chức năng của thận và đặc biệt hữu ích trong điều trị các rối

loạn tình dục nam và nữ (Nguyen Q., 1999) Tại Ấn Độ, mật của những con ong hút

mật hoa sen được coi là một loại thuốc bổ để điều trị các rối loạn về mắt (BGCI, 2006)

Hạt sen chứa chất chống ôxit mạnh, kích thích enzyme phân hủy mô mỡ

trong cơ thể, làm chậm tiến trình lão hóa và ngăn ngừa ung thư (Dharmananda S.,

2002) Hạt sen có tác dụng giảm huyết áp, hạ nhịp tim, giảm cholesterol trong máu,

cắt cơn nôn hay làm dịu phản ứng co giật của hệ thống tiêu hóa và tử cung Trong

Đông y, người ta dùng hạt sen để điều trị viêm ruột, tiêu chảy mãn tính, tăng tiết

dịch và khí hư, nó có tác dụng giảm đau, đặc biệt hiệu quả trong điều trị bệnh mất ngủ Hạt sen còn có tác dụng như một loại thuốc bổ lá lách (Follett and Douglas, 2003); làm vị thuốc chống trầm cảm và ức chế viêm được sử dụng ở nhiều nước

châu Á (Bi Y et al., 2006) Theo Hyo et al., (2005); Kim et al., (2006), hạt sen còn

là một loại thảo dược truyền thống nổi tiếng được sử dụng để điều trị các triệu chứng tim mạch tại Hàn Quốc

Tâm sen rất giàu các hợp chất alkaloid, flavonoid và một số nguyên tố vi

lượng (gồm Zn, Fe, Ca, Mg) (Bi et al., 2006) Tâm sen lấy từ hạt sen già, phơi khô

được sử dụng để điều trị các rối loạn thần kinh, mất ngủ, sốt cao, bồn chồn tăng huyết áp (Nguyen Q, 1999) và thanh nhiệt rất hữu hiệu (Đặng Văn Đông, 2011)

Củ sen là loại thực phẩm bổ dưỡng cho trẻ em và người lớn tuổi Dịch chiết

xuất từ củ sen còn có khả năng chữa bệnh tiểu đường (Mukherjee et al., 1997) và chống béo phì (Ono et al., 2006)

1.1.3.3 Giá trị văn hóa, thẩm mỹ

Trong lĩnh vực văn hóa, nghệ thuật, sen là biểu tượng của sự thịnh vượng, linh thiêng và bất tử của nhiều nền văn hóa qua nhiều thế kỷ Từ hàng ngàn năm trước, hoa sen đã là biểu tượng chính của nhiều tôn giáo ở châu Á, đặc biệt trong đạo Phật và đạo Hindu Đạo Phật xem hoa sen là biểu tượng cao nhất của sự tinh khiết, hòa bình, từ bi và vĩnh hằng, người Hindu tin đức Phật được sinh ra từ sen Các họa sĩ thường vẽ về hình ảnh cây sen trong khi nhà thơ, các học giả lại sáng tác thơ và bình luận về cây sen (Xueming, 1987) Hoa sen được tôn kính như một viên ngọc quý đối với người Tây Tạng cổ, người Nepal, là biểu tượng của cuộc sống đối với người Nhật Bản (Slocum and Robinson, 1996), đồng thời biểu tượng cho tinh thần, cốt cách, bản sắc văn hoá dân tộc của người Việt Nam (Đặng Văn Đông, 2011)

Sen là loài hoa đẹp, có hương thơm tượng trưng cho vẻ đẹp tươi sáng, cao sang và thuần khiết mang tính dân tộc và thẩm mỹ cao Sen được trồng trong chậu cảnh, trên cánh đồng để làm đẹp cảnh quan, giúp bảo vệ môi trường, phục vụ giáo

dục và khách du lịch (Liu, 1994; Nguyen Q., 2001a) Ngoài ra, các sản phẩm từ cây sen còn được dùng làm nguyên liệu trong ngành thời trang và mỹ phẩm cao cấp Từ cuống lá của cây sen có thể sản xuất ra tơ sen làm vải lụa chất lượng cao (Bộ Ngoại giao, 2013) Sản phẩm may mặc thủ công được làm từ tơ sen rất được ưa chuộng, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn gấp nhiều lần so với các sản phẩm cùng loại làm

từ nguyên liệu sợi khác (Tuyết Loan, 2013; Đài THVN, 2014) Hoa sen ngoài giá trị thẩm mỹ còn được dùng sản xuất nước hoa có hương thơm quyến rũ (Hanelt, 2001)

1.1.4 Đặc điểm thực vật học cơ bản của cây sen

Cây sen có thân rễ mập nằm trong bùn còn gọi là ngó sen (Trần Hợp, 2000)

Lá sen được hình thành trực tiếp từ thân củ, lá mới trải trên mặt nước, lá trưởng thành gắn trên cuống lá đứng thẳng và thoát khỏi mặt nước Lá sen trưởng thành có hình khiên, trong lòng hơi lõm, tạo cảm giác giống như một cái bát, đường kính dao động từ 30-60cm, gân rõ Nhờ cấu trúc gồ ghề và đặc tính kỵ nước của tinh thể sáp

mà nước lăn trên bề mặt lá sen sẽ cuốn mọi hạt bụi dính trên đó (Auburn university, 2010)

Hoa sen to, mọc riêng lẻ trên cuống dài thẳng có gai Hoa sen có màu hồng, hồng đỏ hay trắng… (tuỳ theo giống), đối xứng hoàn toàn và đường kính 8-20 cm Hoa có 3-5 lá đài màu xanh nhạt và rụng sớm Cánh hoa phía ngoài to, khum lòng máng, những cánh hoa ở giữa và phía trong nhỏ hẹp dần Nhị hoa có những dạng chuyển tiếp; nhị nhiều màu, chỉ nhị mảnh, có phần phụ (gạo sen) màu trắng có hương thơm; bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen)

Gương sen được đính vào phần cuối cùng của cuống hoa, nằm phía trong cánh sen Gương sen chứa nhiều khoang nhỏ, mỗi khoang chứa một noãn riêng biệt Sau khi được thụ phấn mỗi noãn sẽ phát triển duy nhất thành 1 hạt trong gương sen Hạt sen nằm hoàn toàn bên trong phần gỗ trông giống như vòi hoa sen gọi là

gương sen, bát sen hay đài sen (Sayre, 2004; Masuda, J et al., 2006) Hạt sen

trưởng thành có dạng quả bế với núm nhọn, phần trước mỏng và cứng, có màu lục, phần giữa chứa tinh bột màu trắng ngà và trong cùng là tâm sen, trong khi hạt sen

lép chỉ chứa nước và không khí (Warner Orozco et al., 2009) Khi còn non và

trưởng thành vỏ hạt sen có màu xanh, khi già vỏ hạt chuyển màu nâu rồi sang màu

đen và vỏ hạt khô cứng lại, đường kính hạt khoảng 1cm gọi là sen lão Tâm sen

chứa 2 chồi mầm màu xanh do có chứa chất diệp lục chlorophyll, giúp cây có thể

quang hợp ngay khi vừa mới nẩy mầm (Auburn university, 2010)

Rễ sen thuộc dạng rễ chùm, mỗi đốt gồm 20-50 rễ Khi còn non rễ có màu

trắng kem, ít lông Khi già rễ chuyển sang màu nâu, kích thước rễ có thể dài tới

15 cm (Nguyễn Phước Tuyên, 2007)

Củ sen có dạng giống thỏi xúc xích, màu trắng kem xen lẫn màu nâu, được

hình thành từ một đoạn rễ Mỗi củ sen thường có 3-4 lóng, dài 60-90 cm tùy từng

giống và dinh dưỡng ở các vùng sinh thái khác nhau Lóng cuối của củ sen nhỏ,

đường kính 4-6 cm, dài 10-15 cm; Lóng thứ hai to nhất, đường kính 5-10 cm, dài

10-12 cm; Lóng thứ nhất ngắn khoảng 5-10 cm và mang thân mới Cấu tạo của củ

sen thường xốp để không khí thông suốt chiều dài của củ sen (Nguyễn Phước

Tuyên, 2007)

1.1.5 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây sen

1.1.5.1 Yêu cầu về nước

Sen là cây thủy sinh vì vậy yêu cầu môi trường nước lớn, tuy nhiên, các

giống sen lấy củ có nhu cầu nước lớn hơn so với các giống sen lấy hoa và sen lấy

hạt Nhu cầu về nước cho cây sen là không giống nhau ở các giai đoạn phát triển

Nói chung, khi trồng, mực nước chỉ cần khoảng 5-10 cm Khi mọc lá đứng, tùy

từng giống mức nước có thể được nâng lên 30-60 cm, vào cuối vụ mực nước nên

thấp hơn khoảng 5 cm Nước cạn sẽ làm tăng nhiệt độ và có lợi cho cây non Vào

mùa hè, do sự gia tăng tốc độ bay hơi nên mực nước trong ruộng thường ở mức cao

hơn là điều rất cần thiết cho cây sen nhưng độ sâu của nước không quá 1,5 m

(Auburn university, 2010)

Việc tăng độ sâu của nước sẽ giúp khống chế bệnh thối củ do nấm Fusarium

oxysporum pv nelumbicola gây hại do loại nấm này cần ôxy Tuy nhiên, nếu nước

ngập quá sâu sẽ ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của bộ rễ vì việc vận chuyển không khí từ lá qua hệ thống vận chuyển khí gặp trở ngại (Honda, 1987) Việc hình thành

củ sen cũng bị kích ứng khi thiếu nước Cây không có dấu hiệu hình thành củ và tiếp tục giai đoạn tăng trưởng dinh dưỡng khi lượng nước trong ruộng luôn nhiều

Do đó cần tạo sự thiếu nước ở giai đoạn nhất định để kích thích sự hình thành và phát triển củ (Nguyễn Phước Tuyên, 2007)

Chất lượng nước rất quan trọng để sen tăng trưởng tốt Nhiệt độ nước thích hợp và nước phải trong, không bị ô nhiễm Ngoài ra cây sen cũng có thể chịu được nồng độ muối nhất định Những khảo nghiệm bước đầu cho thấy thành phần natri trong muối bị thay thế bởi ion kali ở nồng độ thấp, mở ra triển vọng trồng sen ở những nơi nước bị nhiễm mặn Nồng độ muối được thể hiện qua độ dẫn diện EC, cây sen chịu được EC 2,8-3,1mS cm-1 Lá non bắt đầu bị vàng khi EC 3,2-3,5 mS

cm-1, tăng trưởng ngừng lại (Hick, D., 2005)

1.1.5.2 Yêu cầu với nhiệt độ và ánh sáng

Cây sen sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ ấm của vùng nhiệt đới, với nhiệt độ trung bình là 25oC Nhiệt độ đóng vai trò quyết định đến sự nảy mầm của hạt sen, nó kích thích phôi nảy mầm và phát triển, phá vỡ tính ngủ nghỉ và tăng

sự hòa tan các chất ức chế trong hạt Ở 15oC hầu như hạt không nảy mầm, ở 20oC thời gian nảy mầm là 9 ngày, từ 25-40oC thời gian nẩy mầm rút xuống còn 6 ngày,

40oC xuất hiện triệu chứng mầm chết do nóng (Nguyen Q and Hicks D., 2004; Hicks, D., 2005) Sen sinh trưởng chậm ở vùng bị sương giá do cây rất nhạy cảm với nhiệt độ lạnh Tuy nhiên củ sen có đặc tính ngủ nghỉ qua đông nhằm giúp cây sen tồn tại

Sen là cây ưu sáng, việc phân hóa củ bị kích ứng khi cường độ ánh sáng giảm

và nhiệt độ thấp (Auburn university, 2010)

1.1.5.3 Đất và dinh dưỡng

Đất trồng thích hợp cho cây sen sinh trưởng, phát triển, thu hoạch và nhất là trồng sen lấy củ thì yêu cầu đất ít ngấm nước, để củ sen có màu trắng kem Yêu cầu

lớp đất mặt phải có cấu trúc mịn để tránh củ bị trầy xước Trong môi trường nước

khi đánh bùn, dưới tác động của trọng lực những hạt đất có kích thước to nằm dưới,

hạt nhỏ nằm trên giúp củ sen không bị biến dạng Đất thịt pha sét là thích hợp cho

sự sinh trưởng và phát triển của củ sen nhất (Nguyễn Phước Tuyên, 2007) Một số

kết quả nghiên cứu cho thấy: sen là cây sinh trưởng nhanh, có thể trồng trong môi

trường không cần dinh dưỡng, tuy nhiên cây sẽ sinh trưởng, phát triển tốt hơn trong

điều kiện đất giàu dinh dưỡng Đáy hồ, ao chứa một lượng lớn các chất hữu cơ là

thích hợp cho cây sen (Xueming, 1987, Tian D et al., 2005)

Slocum và Robinson (1996) đề xuất sử dụng một loại đất có trọng lực nặng

để khi trồng cây hoặc củ giống sẽ không bị nổi lên mặt nước Shen Miller và cs

(2002) đã cho hạt sen hàng trăm năm tuổi nảy mầm được trong hỗn hợp đất sét và

đất mùn với tỷ lệ 3:1 Nếu là đất sét nặng, rễ không thể thâm nhập vào trong đất

đồng thời thu hoạch củ sẽ khó khăn hơn Ngược lại, đất cát thiếu sự ràng buộc giữa

cây với giá thể, cản trở việc giữ các chất dinh dưỡng làm hương vị của củ sen kém

thơm ngon Đất có bổ sung xác hữu cơ (gồm phân chuồng hoai mục hoặc sinh vật

đã phân hủy) sẽ cung cấp chất dinh dưỡng tốt cho cây sen (Nguyen Q., 2001a) Đất

tối ưu cho cây sen là bùn mềm có hàm lượng mùn cao, pH thích hợp cho cây sen từ

6,0-6,5 (Nguyen Q and Hicks D., 2004) Những nơi trồng sen dinh dưỡng trong đất

kém cần bổ sung phân bón Tuy nhiên yêu cầu phân bón phụ thuộc vào chất đất, độ

màu mỡ, biện pháp canh tác, mục đích thu hoạch sản phẩm và khả năng cho năng suất

Theo Nguyễn Phước Tuyên (2007), khi không đủ dinh dưỡng trong đất cây sẽ

có những biểu hiện rõ rệt ở trên lá sen Nhu cầu đạm của cây sen rất lớn ở giai đoạn

tăng trưởng dinh dưỡng Khi thiếu đạm, lá già chuyển sang màu vàng, khô rất

nhanh, thiếu đạm trầm trọng cây sẽ lùn lại Bón nhiều phân đạm ở giai đoạn hình

thành củ sẽ kích thích thân ngầm phát triển hơn là phát triển củ, ngộ độc phân đạm

khiến lá bị cháy tạo hình tròn ở giữa 2 gân lá Cây sen rất nhạy cảm với phân lân,

thiếu lân lá màu xanh đậm, có vệt tím trên lá non Khi thiếu lân trầm trọng lá sẽ

chuyển sang màu tím hoàn toàn, gân lá chuyển sang màu xám đen và khô, cây tăng

trưởng rất chậm Thừa lân lá non bị biến dạng, không bung ra được Nhu cầu kali của cây sen là rất lớn đặc biệt ở giai đoạn trổ hoa và hình thành củ Đầu tiên những vệt vàng xuất hiện chạy dọc gân lá già, rồi lan rộng và chuyển sang màu nâu Thiếu ma-nhê: xuất hiện trên lá già, có những đốm vàng giữa 2 gân lá, thiếu ma-nhê trầm trọng vệt vàng sẽ lan rộng ra cả phiến lá Thiếu canxi: triệu chứng tương tự như thiếu ma-nhê, những đốm vàng xuất hiện trên lá già, sau đó chuyển sang màu cam, đồng thời lá rất dòn dễ vỡ

1.2 Tình hình sản xuất và thị trường các sản phẩm từ cây sen trên thế giới và

ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen trên thế giới

Cây sen được trồng nhiều ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc và một số nước tại Châu Phi với mục đích làm thực phẩm, làm thuốc hay cây cảnh Ngoài ra, tại châu Âu và châu Mỹ cây sen được trồng chủ yếu với mục đích làm cây cảnh (Xueming, 1987) Tuy nhiên, đến nay chưa có số liệu thống kê

về diện tích trồng sen trên thế giới

Trung Quốc là nước sản xuất sen lớn nhất thế giới với diện tích ước đạt 133.400 ha, năng suất bình quân đạt 22,5 tấn/ha và sản lượng đạt trên 3 triệu tấn củ/năm Nhiều giống sen lấy củ rất giá trị có màu sắc hoa đẹp, hàm lượng tinh bột khá và khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiều mức nước khác nhau (Yamaguchi M., 1990; Slocum P and Robinson P., 1996) Lượng củ sen được nhập khẩu từ Trung Quốc chiếm tới 70% tổng khối lượng củ sen trên thị trường Hàn Quốc và

Nhật Bản (Libao Cheng et al., 2013) Sản lượng sen lấy hạt tại Trung Quốc đạt

8.000-14.000 tấn/năm từ những năm 1990 (Anomymous, 2000)

Ở Nhật Bản, sen được trồng với mục đích làm hoa cảnh và lấy củ Năm

1982, trên diện tích 6.350 ha sản lượng củ sen đạt được là 82.200 tấn củ Tuy nhiên, năm 1998 diện tích trồng sen đã giảm xuống chỉ còn 4.900 ha và sản lượng củ sen

là 71.900 tấn (Nguyen, 2001ab) Các giống sen lấy củ trồng ở Nhật Bản chủ yếu được nhập nội từ Trung Quốc, như “Shina Shirobana’, “Bitchu” và “Kishima”,

trong khi nhóm sen lấy hoa chủ yếu có nguồn gốc tại địa phương Hầu hết các giống sen địa phương được trồng như “Tenno” là giống có hoa màu đỏ, giống Aichi cho hoa màu trắng củ dài và thuôn, thuộc nhóm có thời gian sinh trưởng sớm đến trung bình (Anoymous, 2006)

Một số quốc gia như Hàn Quốc, Đài Loan và Úc cũng sản xuất củ sen, tuy nhiên diện tích và sản lượng thấp nên chủ yếu họ nhập củ sen của Trung Quốc Hàn Quốc có diện tích trồng sen khoảng 300 ha, năng suất củ đạt 31,83 tấn/ha/năm Hàn Quốc cũng là nước nhập khẩu nhiều củ sen và hạt sen (Trang thông tin điện tử công

ty Sen Ta, 2012) Tại Úc, có 1,2 triệu dân châu Á định cư và tiêu thụ khoảng 1.000 tấn củ sen/năm, trong khi sản lượng củ sen của nước này chỉ đạt 100 tấn củ/năm, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc (Vinning G., 1995; Nguyễn Phước Tuyên, 2007) Đài Loan có diện tích trồng sen không đáng kể nhưng hàng năm sản lượng

củ sen khoảng 600-700 tấn và sản lượng hạt sen đạt 30-35 tấn Tuy nhiên nhu cầu tiêu thụ củ sen và hạt sen của Đài Loan lại rất lớn Giá hạt sen ở Đài Loan thường cao gấp đôi so với giá củ sen, trong khi sản lượng hạt sen của Đài Loan chỉ bằng 5% sản lượng củ sen (Trang thông tin điện tử huyện Cao Lãnh, 2013)

Như vậy, hạt sen có nhu cầu rất lớn trên thị trường thế giới, hiện nay giá hạt sen rất khích lệ sản xuất do nhu cầu tăng trong khi sản xuất sen chỉ tập trung tại một

số nước nhiệt đới và vài nước Châu Phi Hàng năm, sản lượng hạt sen trên thế giới dao động từ 20-30 ngàn tấn, mới chỉ đáp ứng được một phần nhỏ nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng của nhiều nước có nguồn thu nhập cao Tại Hồng Kông, giá bán một tấn hạt sen thường lên tới 1.500-1.800 đôla Hồng Kông (Trang thông tin điện tử tỉnh Đồng Tháp, 2013)

1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm từ cây sen ở Việt Nam

Ở nước ta, sen được trồng suốt từ Bắc vào Nam Miền Bắc, sen được trồng nhiều tại các tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nam, Hà Nội… tại các vùng đất trũng miền Trung, có Nghệ An, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận Sen phát triển nhiều ở khu vực ĐBSCL như Long

An, Sóc Trăng, Tiền Giang, An Giang đặc biệt Đồng Tháp - được coi là xứ sở của cây sen Hiện nay, chưa có số liệu thống kê chính xác về diện tích trồng sen nhưng ước đạt trên dưới 3.000 ha Các giống sen chủ yếu là giống địa phương, các dạng hoang dại được khai thác tự nhiên, trồng quảng canh, năng suất ngó sen, củ sen, hạt sen đều thấp so với các giống nhập nội từ Trung Quốc và Đài Loan (Trang thông tin điện tử công ty Sen Ta, 2012)

Việt Nam là một nước có sản lượng sen lớn, hàng năm cung cấp từ vài trăm đến 1.000 tấn hạt sen cho thị trường trong nước và xuất khẩu Tuy nhiên, sản phẩm

từ cây sen chưa được người tiêu dùng chú ý và đánh giá cao trong vị thế nền kinh tế

mà chỉ được các nhà đông y quan tâm như một loại dược liệu với nhiều công dụng của nó Vài năm gần đây, cây sen đang dần dần tìm lại chỗ đứng của mình không chỉ bởi tạo cảnh quan sinh thái xanh, sạch, đẹp mà còn đem lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất, tạo điều kiện cho nhiều nông hộ thoát nghèo và có thể làm giàu

Hưng Yên là tỉnh trồng nhiều sen ở ĐBSH Các sản phẩm từ cây sen như hoa, hạt, tâm, nhụy, lá, ngó sen đều có thể bán được, đem lại thu nhập cao cho người trồng Thông thường hạt sen chè có giá từ 40.000- 50.000 đồng/kg Bên cạnh

đó sản phẩm hạt sen khô cũng được nhiều thương lái đến tìm mua bởi chất lượng thơm ngon, bùi, ngậy (Hương Giang và Đức Tuấn, 2014) Theo số liệu của Sở NN

và PTNT Hưng Yên, hiện tỉnh có khoảng 100 cơ sở chế biến hạt sen khô và đang tạo việc làm cho hơn 2.000 lao động, với thu nhập 2-2,5 triệu đồng/người/tháng Với sản lượng sen của Hưng Yên hiện nay, chỉ đáp ứng được 1/3 số lượng hạt sen của các cơ sở thu mua, chế biến Việc thu mua sen ở Hưng Yên diễn ra nhỏ lẻ, rất tốn thời gian, công sức, nên các cơ sở vẫn phải nhập sen từ miền Nam và sen nhập khẩu để đảm bảo phục vụ chế biến trong 1 năm (Nam Tùng Sơn, 2012)

Tỉnh Bình Thuận hiện đã có trên 25.000 ha ao hồ và hơn 600 ha ruộng canh tác lúa kém hiệu quả được chuyển đổi sang trồng giống sen Đài Loan và các giống sen khác Năng suất bình quân đạt từ 2,5-3,5 tấn gương sen thương phẩm/ha, giá bán dao động từ 20.000 - 28.000 đồng/kg gương sen Với giá bán như vậy, trừ tất cả

chi phí đầu tư và công chăm sóc người trồng sen có lãi 50 - 60 triệu đồng/ha Không chỉ bán gương sen mà các bộ phận khác của sen như: ngó, lá, cuống, hoa sen, tâm, nhụy, hạt sen cũng đều có thể bán được, đem lại lợi nhuận cao cho nông dân (Ngọc Bảy, 2012)

Tại ĐBSCL và tứ giác Long xuyên hàng trăm hecta sen mọc tập trung và gần như thuần chủng đã góp phần tạo nên cảnh quan sinh thái đặc biệt của vùng đất ngập nước Sen được trồng nhiều ở tỉnh Đồng Tháp để lấy hạt, vùng trồng sen ở tỉnh Sóc Trăng để lấy củ Đồng Tháp là nơi có diện tích trồng sen lấy hạt đứng đầu Việt Nam Giá trị kinh tế đem lại từ việc trồng sen cao hơn hẳn so với trồng lúa, hơn nữa cây sen có thể phát triển được trên đất phèn, đây là một lợi thế trong việc tận dụng đất đai của cây sen Với chân đất thấp, trũng việc trồng hai vụ lúa kém hiệu quả người dân chuyển sang trồng cây sen kết hợp với nuôi cá đã làm tăng hiệu quả kinh tế gấp 5-10 lần Tại huyện Cao Lãnh diện tích trồng sen đạt 542 ha với sản lượng 189,7 tấn hạt trong năm 2010 Kế hoạch năm 2011, diện tích trồng sen của huyện sẽ là 1.265 ha tại xã Mỹ Hội, Mỹ Thọ, Bình Hàng Trung đặc biệt tại xã Tân Hội Trung với 250 ha (Trang thông tin điện tử huyện Cao Lãnh, 2013) Theo Phòng

NN và PTNT huyện Tháp Mười, hiện nay diện tích trồng sen tại huyện Tháp Mười

là 423 ha, tập trung nhiều nhất ở các xã: Mỹ Quí, Mỹ Đông, Láng Biển, Mỹ An, Mỹ Hòa, Tân Kiều (Sở NN và PTNT Đồng Tháp, 2015) Tại huyện Tháp Mười, giá gương sen dao động từ 300-2.400 đồng/gương, có thời điểm giá sen cao nhất là 3.100 đồng/gương Theo nông dân với giá 300 đồng/gương, người nông dân vẫn có lời Hiện nay, có rất nhiều mô hình phát triển kinh tế nông nghiệp gắn với phát triển

du lịch sinh thái nông nghiệp để phát triển “du lịch làng sen” và tiêu thụ tại chỗ các sản phẩm sen như hoa, gương và ngó sen (Dương Thế Hùng, 2005)

Xã Thạnh Hòa huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang mỗi năm tổng diện tích trồng sen là 80 ha, được trồng ở 30 hộ Lúc đầu, nông dân trồng sen lấy ngó, sau chuyển sang trồng sen lấy hạt Giá ngó sen mùa lũ giá lên khoảng 20.000-22.000 đồng/kg và dao động từ 10.000-12.000 đồng/kg ngoài mùa lũ Nghề trồng sen phát

triển mạnh đã giúp nhiều hộ gia đình thoát nghèo, ổn định cuộc sống (Trang thông

tin điện tử tỉnh Tiền Giang, 2008)

Trồng sen rất thích hợp cho những hộ nông dân có ít ruộng vì cây sen đầu tư vốn ít lại cho thu nhập và tạo việc làm thường xuyên Bên cạnh đó việc tiêu thụ cũng dễ dàng có thể bán tại chỗ hoặc bán gương sen tại các trường học hay các khu

du lịch trong thành phố và các đầu mối thu mua Giá bán các sản phẩm từ sen cũng dao động khác nhau, ngó sen từ 20.000- 25.000 đ/kg, có lúc lên đến 30.000- 35.000 đ/kg (Chí Trung, 2015) Giá bán gương sen từ 13.000-14.000 đ/kg, những gương to, hạt đều, ít hạt lép thì có thể bán được với giá 15.000-16.000 đ/kg Thời điểm đầu vụ sen tháng 2-3 âm lịch giá sen có thể lên đến 50.000-60.000 đ/kg (Minh Diệp, 2015)

Như vậy ở Việt Nam, đặc biệt tại các tỉnh phía Nam - nơi có truyền thống trồng cây sen lâu đời như vùng Đồng Tháp Mười và tứ giác Long Xuyên có điều kiện thuận lợi cho phát triển cây sen đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất khi thị trường thế giới hiện có nhu cầu về sản phẩm từ cây sen rất lớn Tuy nhiên để nâng cao giá trị của các sản phẩm từ cây sen, cần được sự quan tâm đầu tư

về tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực giống và canh tác của các viện nghiên cứu, các doanh nghiệp hỗ trợ đầu ra của sản phẩm và cần sự cộng tác của các hộ trồng sen

1.3 Phân tích đa dạng di truyền ở cây sen

Đa dạng nguồn gen cây sen bao gồm đa dạng về di truyền (gen) và đa dạng về biểu hiện kiểu gen (kiểu hình) Mức độ biến động của kiểu gen và sự đa dạng của kiểu hình nói nên tính đa dạng của một loài cây trồng

Sự đa dạng nguồn gen cây trồng là cơ sở cho việc tuyển chọn, lai tạo những giống mới, loài mới, là nguyên liệu ban đầu cho công nghệ gen, vì thế cần được nghiên cứu theo nhiều phương diện để phục vụ cho các mục đích khai thác sử dụng khác nhau

một cách hiệu quả và mang tính bền vững

1.3.1 Đa dạng di truyền và các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen

giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có

thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Theo Công ước đa dạng sinh học (1992), đa dạng di truyền được hiểu là sự phong phú những biến dị trong cấu trúc di truyền của các cá thể bên trong hoặc giữa các loài; những biến dị di truyền bên trong hoặc giữa các quần thể

Theo tác giả Chu Hoàng Mậu (2008), đa dạng di truyền của sinh vật là một đặc tính của sinh vật Sự đa dạng về kiểu hình do tính đa hình về kiểu gen quy định

và có sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường Biểu hiện của tính đa dạng di truyền ở sinh vật thể hiện ở các mức độ khác nhau: Đa dạng về kiểu hình biểu hiện

ở các tính trạng hình thái và đa dạng về tính trạng số lượng; Đa dạng về các phân đoạn ADN; Đa dạng về trình tự nucleotide của gen; Đa dạng về thành phần protein;

Đa dạng về trình tự amino acid

Đa dạng di truyền biểu hiện ở nhiều cấp độ khác nhau, từ hình thái đến phân

tử Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng của các loại dịch bệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi trường sống Sự đa dạng di truyền ở cây trồng, vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích con người Chính vì vậy nghiên cứu đa đạng di truyền có ý nghĩa đặc biệt trong công tác bảo tồn và chọn tạo giống (Trung tâm Tài nguyên thực vật, 2015)

Có hai phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của sinh vật đó là dựa vào kiểu hình và bằng các chỉ thị phân tử

Phân tích tính đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình: bao gồm phương pháp phân tích sự đa dạng các tính trạng hình thái và các tính trạng số lượng Đa dạng về kiểu hình là sự biểu hiện đa dạng các tính trạng của cá thể trong quần thể Các tính trạng hình thái được mô tả kèm theo hình vẽ, ảnh chụp để so sánh Các tính trạng số lượng được đo đếm xử lý bằng phần mềm chuyên dụng sẽ cho kết quả về hệ số đa dạng kiểu hình, khoảng cách di truyền và mối quan hệ di truyền giữa của các đối tượng nghiên cứu Trong đó, xác định hệ số sai khác bằng việc thiết lập bảng ma

trận và xác định khoảng cách di truyền bằng thiết lập sơ đồ hình cây (Chu Hoàng Mậu, 2008)

Phân tích sự đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử bao gồm phương pháp phân tích đa dạng ở mức ADN, đa dạng protein và đa dạng cấu trúc gen và trình tự amino axit

Phân tích đa dạng di truyền ở mức ADN trên cơ sở xuất hiện các phân đoạn ADN và xử lý bằng phần mềm NTSYS Các cá thể khác nhau, cấu trúc ADN khác nhau biểu hiện ở trình tự nucleotide và do đó các đoạn ADN cũng rất khác nhau Vì vậy, dựa vào sự khác nhau về các phân đoạn ADN mà có thể đánh giá được mức độ

đa dạng của sinh vật Phân tích số liệu RAPD, SSR, AFLP, RFLP theo chương trình NTSYSpc Version 2.1, với mục tiêu là xác định sự giống nhau, khác nhau về cấu trúc ADN trong phạm vi phân tích các đoạn; xác định sự đa hình các phân đoạn ADN và tìm mối quan hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu Nguyên tắc xử

lý các số liệu là so sánh từng cặp đối tượng trong nghiên cứu bằng cách tính toán khoảng cách quan hệ giữa chúng; Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán được trước đó; Giải ma trận và biễu diễn thành một biểu đồ đặc trưng (Chu Hoàng Mậu, 2008; Nguyễn Đức Thành, 2014)

Phân tích sự đa dạng protein trên cơ sở phân tích thành phần điện di protein: phương pháp này gồm: Chiết rút protein; Phân tích điện di protein; Đánh giá mức

độ đa hình protein; Xác định tiểu đơn vị protein đặc trưng

Phân tích tính đa dạng trong trình tự gen, trình tự amino acid và so sánh trình

tự gen, trình tự amino acid Sự đa dạng trong cấu trúc gen thể hiện ở sự khác nhau kích thước và về số lượng, thành phần, trình tự nucleotit trong gen Sự đa dạng trong cấu trúc gen là cơ sở để đánh giá tính đa dạng di truyền ở mức phân tử Sự đa dạng của các đối tượng nghiên cứu còn thể hiện trong trình tự nucleotide Bằng cách so sánh trình tự nucleotide của một gen nào đó có thể xác định được khoảng cách di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu, thiết lập được sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa chúng Phương pháp này gồm các bước sau: Thu thập thông tin về

gen đích và thiết kế cặp mồi PCR nhân gen; Phân lập gen đích của các đối tượng nghiên cứu; Tách dòng và giải trình tự gen; So sánh trình tự gen, lập bảng ma trận

về hệ số tương đồng và hệ số khác nhau Thiết lập sơ đồ hình cây giữa các đối tượng dựa trên dữ liệu về gen; So sánh trình tự protein của gen, lập bảng ma trận về

hệ số tương đồng và hệ số khác nhau; Thiết lập sơ đồ hình cây giữa các đối tượng dựa trên dữ liệu về protein (Chu Hoàng Mậu, 2008)

1.3.2 Một số loại chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền ở cây sen

Chỉ thị ADN được sử dụng rộng rãi nhất do số lượng chỉ thị không hạn chế Chỉ thị ADN được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại, trong chọn tạo giống gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất thuận, năng suất và phẩm chất giống Các chỉ thị đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền trên cây sen gồm RAPD, AFLP, SSR và ISSR

Kỹ thuật RAPD sử dụng các mồi ngẫu nhiên khoảng 10 nucleotide, nhiệt độ kéo dài mồi 34-37 oC Trình tự mồi RAPD ngẫu nhiên nhưng tỷ lệ GC tối thiểu đạt 40% (thường là 50-80%) và không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau Sản phẩm PCR-RAPD được phân tách trên gel agarose 1,5-2,0% Kỹ thuật RAPD đơn giản, dễ thực hiện nhưng sản phẩm PCR không ổn định và tạo ra các chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể dị hợp tử với cá thể đồng hợp tử RAPD sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật, nghiên cứu đặc điểm của giống, đánh giá biến đổi di truyền trong xác định loài và xác định con lai (Nguyễn Đức Thành, 2014)

Kỹ thuật AFLP: đầu tiên ADN genome được cắt bởi enzyme cắt không thường xuyên (EcoRI hoặc PstI) và cắt thường xuyên (MseI hoặc TaqI) để tạo ra các phân đoạn Các đoạn cắt được gắn với các đoạn kết nối ở cả hai đầu, được nhân bản bằng PCR với mồi tương ứng có thêm và 1 đến 3 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ Phản ứng PCR lần đầu (tiền nhân) được tiến hành với tổ hợp mồi chứa một

nucleotide chọn lọc Phản ứng PCR lần hai (nhân chọn lọc) được tiến hành với các cặp mồi có 1 đến 3 nucleotide chọn lọc Sản phẩm PCR-AFLP chọn lọc được, được phân tách bằng gel polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc (AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động Kỹ thuật này có độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin

về trình tự ADN của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh Tuy nhiên AFLP phải qua nhiều bước, ADN cần phải sạch, không có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn chế; đòi hỏi công sức và giá thành cao Kỹ thuật tạo

ra chỉ thị trội, không phân biệt được đồng hợp, dị hợp tử AFLP được sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ genome, đa dạng di truyền quan hệ chủng loại giữa các kiểu gen có mối quan hệ gần, nghiên cứu cấu trúc di truyền nguồn gen, đánh giá phân hóa di truyền trong quần thể (Nguyễn Đức Thành, 2014)

Kỹ thuật SSR- chuỗi lặp lại đơn giản: là sự lặp lại các chuỗi nucleotide ngắn

từ 2-6 nucleotide SSR rất đa hình do đột biến tác động lên số đơn vị lặp lại Sự đa hình của SSR là kết quả khác nhau về độ dài các đoạn lặp lại trong genome do quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép

Sự khác nhau allen của SSR là kết quả của sự thay đổi số lượng đơn vị lặp lại trong cấu trúc tiểu vệ tinh Các chuỗi lặp lại thường đơn giản và cấu tạo bởi 2, 3 hoặc 4 nucleotide Sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc (AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động Kỹ thuật SSR cho nhiều allen trong một locus; Phân bố đều trong genome, SSR cho thông tin cụ thể hơn so với di truyền ty thể theo đường mẹ (vì có mức đột biến cao) và di truyền theo cả bố và mẹ;

Là chỉ thị đồng trội; Có tính đa hình và đặc thù cao; Có thể lặp lại ở các thí nghiệm,

sử dụng ít ADN, rẻ và dễ tiến hành, có thể phân tích bán tự động, không sử dụng phóng xạ SSR có thể phân biệt các cá thể có mối quan hệ gần nhưng hạn chế là cần phải đọc trình tự genome để dựa vào đó có thể thiết kế các cặp mồi đặc thù và tối

ưu hóa điều kiện các mồi cho từng loài trước khi sử dụng Ở thực vật, SSR được sử

dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn cặp lai, xác định con lai và lập bản

đồ liên kết (Nguyễn Đức Thành, 2014)

Kỹ thuật ISSR là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR với một mồi bổ trợ với tiểu vệ tinh (microsatellite) đích Mỗi băng tương ứng với chuỗi ADN được giới hạn bởi các tiểu vệ tinh đảo ngược Kết quả dẫn đến đa locus, có sự đa hình cao và tạo ra các chỉ thị trội ISSR-PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đắt; sự

đa hình dựa trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh Kỹ thuật này không cần thông tin về trình tự, tạo được nhiều locus, có tính đa hình cao và tạo ra chỉ thị trội Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn ADN nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt và ngược chiều nhau Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong

kỹ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài từ 15-30 nucleotide, nên sản phẩm PCR có kích thước 200-2000 bp có thể phân tách trên cả gel agarose và polyacrylamide Kỹ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gen, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định

sự thay đổi genome và đánh giá con lai Kỹ thuật ISSR có thể phân biệt được các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu nhanh, dễ tiến hành và có thể lặp lại ở các thí nghiệm nhưng chỉ thị này tạo ra các chỉ thị trội

và sự dị đồng nhất của các sản phẩn nhân bản (Nguyễn Đức Thành, 2014)

1.3.3 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền cây sen

Trong những năm gần đây, đánh giá đa dạng di truyền trên cây sen bằng cả chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử ADN được nhiều tác giả trên thế giới tập trung nghiên cứu và thu được những kết quả nhất định, góp phần phân loại thực vật học, xác định cấu trúc quần thể, sự tiến hóa và làm cơ sở cho việc xây dựng tạo lập tập đoàn hạt nhân của cây sen phục vụ công tác bảo tồn

Đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các tính trạng hình thái nông học và tương quan di truyền của cây sen được các tác giả Nguyen Q (2001b); Qichao and Xingyan (2005); Gou, H.B (2009, 2010) thực hiện

Theo Nguyen Q (2001b); Qichao và Xingyan (2005), giữa các nhóm sen lấy

củ, lấy hoa và lấy hạt có sự khác biệt về một số tính trạng đặc trưng Nhóm sen lấy củ: cho năng suất củ rất cao, chất lượng tốt nhưng không có hoa hoặc ra rất ít hoa; Nhóm sen lấy hoa: Cho hoa to, nhiều hoa, màu sắc hoa đẹp nhưng không có củ Hoa có một, hai hay nhiều tầng cánh, có giống có đến 1000 cánh Màu sắc của hoa rất đa dạng, từ màu trắng, vàng, tím, đỏ hoặc có 2 màu trên 1 cánh, thường màu trắng ở phần dưới và màu tím ở trên Nhóm sen cho hoa cũng có gương nhưng hạt nhỏ, năng suất rất thấp Nhóm sen lấy hạt: cho nhiều hoa với tỷ lệ hạt chắc cao, hạt

to, có hương vị thơm ngon Những giống này thường chỉ có một tầng cánh, màu đỏ,

rễ thường mảnh và không có củ

Dựa vào sự khác biệt về đặc điểm nông sinh học, Guo, H.B (2009) đã phân nhóm 572 mẫu giống sen trong tập đoàn được bảo tồn tại vườn Quốc gia về Thực vật thủy sinh tại tỉnh Hồ Bắc ra 310 giống sen lấy củ, 229 giống sen lấy hoa và 33 giống sen lấy hạt

Đánh giá đa dạng di truyền thông qua 19 tính trạng hình thái của 40 mẫu giống sen tại Vườn Quốc gia Trung Quốc về cây thủy sinh cho thấy: các đặc điểm kiểu hoa (Ff), số lượng cánh hoa (NP), đặc điểm nhụy, chức năng của nhụy và màu sắc củ (RC) thể hiện mối tương quan thuận với số nụ hoa (FB) Đồng thời mối tương quan giữa số nụ hoa với kiểu hoa, số lượng cánh hoa và màu sắc củ là tương quan thuận Kết quả cũng cho thấy số ngày nụ hoa đầu tiên xuất hiện (DB) có tương quan thuận với số nụ hoa là cao nhất (0,552) tiếp đến là số lượng cánh hoa (0,516)

và màu sắc củ (0,368) Các đặc điểm có tương quan nghịch chặt tới số nụ hoa là độ dài của cánh hoa (-0,801), số ngày hoa đầu tiên nổi trên mặt nước (- 0,558) và chiều rộng lá (- 0,451) (Guo Hongbo, 2010b)

Bên cạnh việc đánh giá đa dạng về hình thái, các chỉ thị phân tử như RAPD,

ISSR, SSR, AFLP, SRAP cũng đã được tác giả Gou Hongbo et al (2005, 2007), Zou Li et al (2010), Jie Fu et al (2011), Jiong Hu et al (2012); F Zheng et al

(2015)… sử dụng để nghiên cứu về kiểu gen trên cây sen

Chỉ thị phân tử RAPD được Guo Hongbo et al.,(2005) sử dụng để phân loại

29 giống sen lấy hoa (gồm cả loài N nucifera Gaertn và N lutea) Với 17 cặp mồi

đã thu được 207 băng, trong đó 122 băng đa hình Các kết quả cho thấy: (1) Có hai phân nhóm chính, phân nhóm 1 gồm các giống sen có hoa lớn hơn và phân nhóm 2 các giống sen có loại hoa nhỏ; (2) Không có sự khác biệt di truyền rõ rệt giữa các

giống thuộc loài N lutea và các giống sen thuộc loài N nucifera Dường như loài N

lutea gần giống với các giống hoa nhỏ của các giống sen thuộc nhóm N Nucifera

Sau đó nhóm tác giả này tiếp tục sử dụng chỉ thị phân tử RAPD nhằm phân tích đa dạng di truyền và xác định mối tương quan di truyền giữa kiểu hình và kiểu

gen của 65 nguồn gen hoa sen thuộc chi Nelumbo, được thu thập chủ yếu ở Trung

Quốc Với 17 cặp mồi đã xuất hiện 195 băng trong đó có 173 băng đa hình Tỷ lệ đa hình trung bình 88,72%, biến động từ 66,7-100,0%, trong đó có 5 cặp mồi khác gồm OPC05, OPG10, OPN20, OPP09 và OPS17 cho đa hình đạt 100% Như vậy đa dạng về di truyền tương đối cao đã được xác định ở tất cả các mẫu với hệ số tương đồng từ 0,45-0,85, chỉ số đa dạng về gen Nei(h) là 0,30 và chỉ số Shannon (I) là 0,46 Phân nhóm sơ đồ hình cây của 65 mẫu giống được chia làm 4 nhóm, mỗi

nhóm lại chia làm 2 phân nhóm phụ, N nucifera ssp nucifera đó là các mẫu giống

có liên quan đến nhóm sen Mỹ và một vài giống đặc biệt, giống bản địa, dòng lai và sen Mỹ Phương pháp PCA cho thấy đa dạng di truyền của các nguồn gen thuộc chi

Nelumbo không đều, mà thực tế nó được thay thế do sự phân bố của mẫu Tương tự

như kết quả đã đề cập bởi sơ đồ hình cây, hai nhóm đại diện chính là 2 loài phụ của

N nucifera gồm một số mẫu giống bản địa, giống sen Trung Quốc, sen Nhật Bản

và các dòng lai của hai nhóm đã quan sát được Sơ đồ hình cây UPGMA cũng không thể hiện đúng mối quan hệ với sự phân bố địa lý và số lượng kiểu hình của

các mẫu giống (Guo Hongbo et al., 2007)

Tác giả Zuo Li (2010) sử dụng chỉ thị RAPD và dấu chuẩn ISSR để đánh giá mối quan hệ di truyền của 87 giống sen, trong đó có 70 giống sen cảnh của Trung

Quốc, 7 giống sen Thái Lan hoang dại, 2 giống sen Mỹ và 8 dòng lai giữa loài N

nucifera và loài N lutea Khi sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR cho thấy mức độ đa

dạng di truyền cao tương ứng là 96,4% và 91,2% Cả hai chỉ thị RAPD và ISSR đều

có 2 phân nhóm, kết quả này cho phép dẫn đến 3 kết luận sau đây:

(1) Kiểu gen của loài N nucifera và N lutea có nguồn gốc địa lý khác nhau

đã được tập hợp lại trong các nhóm riêng biệt Sự khác biệt di truyền có ý nghĩa là

do hai loài sen cách ly về nguồn gốc địa lý, đồng thời không có trao đổi di truyền;

(2) Nguồn gen sen Thái Lan hoang dại đã được tách ra từ nguồn gen sen của Trung Quốc Có thể vị trí địa lý đã ảnh hưởng đến tính đa dạng di truyền của các giống sen do chúng thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau;

(3) Đặc điểm hình thái về kích thước cây, hình dạng cánh hoa và màu sắc hoa cho thấy: chỉ có số liệu về kích cỡ cây là phù hợp với sơ đồ hình cây đã được xây dựng các số liệu phân tử Kết quả này cho thấy cần kết hợp các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái để đánh giá mối quan hệ di truyền và cải tiến hệ thống phân loại các giống hoa sen hiện nay Việc phát hiện nguồn gốc các nguồn gen chưa được biết đến trước đây trong nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của kỹ thuật RAPD và ISSR trong việc xác định và quản lý các nguồn gen cây sen Hai kỹ thuật này có tiềm năng hữu ích trong việc định hướng hiện nay về chiến lược chọn tạo giống và bảo tồn nguồn gen nhằm tăng cường giá trị hoa cảnh và giá trị kinh tế của cây sen

Chỉ thị SSR đã được nhiều nhà khoa học sử dụng để nghiên cứu đa dạng di

truyền các nguồn gen sen (Pan et al., 2011; Jihong Hu et al., 2012; Mei Yang et al., 2012; Zheng et al.,2015) Tác giả Mei Yang và cs (2012) đã sử dụng 38 cặp mồi

SSR và 16 cặp mồi SRAP để so sánh và đánh giá 43 mẫu giống sen nhằm xác định

mối quan hệ di truyền giữa N nucifera và N lutea cũng như mối quan hệ di truyền

giữa các nhóm giống sen lấy hoa, sen lấy hạt và sen lấy củ