THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO E. COLI TRÊN HEO Ngành học: BÁC SĨ THÚ Y Niên khoá: 20032008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh 03

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CHĂN NI – THÚ Y [\ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO E COLI TRÊN HEO Ngành học: BÁC SĨ THÚ Y Niên khoá: 2003-2008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh -03/2009- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CHĂN NI – THÚ Y [\ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO E COLI TRÊN HEO Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Th.S NGUYỄN THỊ THU NĂM NGUYỄN VĂN ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh -03/2009i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Trung Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp phịng Quản Trị - Đời Sống tạo điều kiện giúp đỡ vừa học vừa làm suốt năm qua Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y tất quý Thầy Cô truyền đạt cho em suốt trình học tập trường Em cảm ơn PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải ThS.Nguyễn Thị Thu Năm nhiệt tình hướng dẫn để em hoàn thành đề tài Anh xin cảm ơn em Dư, Thoa, Vy, Uyên, Nhân, Châu chia sẻ, giúp đỡ anh gặp khó khăn Cuối cùng, anh cảm ơn em bên cạnh lo lắng, chăm sóc, chia sẻ niềm vui nỗi buồn với anh Em niềm tình thần vơ q báu anh Sinh viên thực Nguyễn Văn Đức ii TÓM TẮT Đề tài “thử nghiệm auto – vaccine phòng bệnh E coli heo” Thời gian thực từ 01/11/2008 đến 01/03/2009 phịng thí nghiệm vi sinh, Bộ Mơn Vi Sinh Truyền Nhiễm, trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM trại thực tập thực nghiệm trường Trung Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Q.9 TP.HCM Chúng tơi thu kết quả: • Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch tốt • Hiệu phòng ngừa tiêu chảy E coli auto-vaccine thực nghiệm tương đương với vaccine phòng bệnh E coli Mỹ • Tiêm auto-vaccine làm giảm rõ rệt lượng vi khuẩn E coli/gr phân heo so với tiêm vaccine Mỹ (P=0,005) • Auto-vaccine thực nghiệm khơng ảnh hưởng đến sức ăn, vận động hô hấp heo • Auto-vaccine khơng gây phản ứng phụ ói mửa, ủ rủ, run rẩy hồn hồn không gây phản ứng cục nơi tiêm iii MỤC LỤC TRANG Trang tựa i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ x DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xi Chương PHẦN MỞ ĐẦU U 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ lược E coli 2.1.1 Hệ thống phân loại 2.1.2 Đặc điểm sinh vật học 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái .3 2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa 2.1.2.4 Sức đề kháng 2.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên .4 2.1.2.6 Độc tố 2.1.2.7 Sự kết dính 2.1.2.8 Tính chất gây bệnh vi khuẩn E coli 2.1.2.9.Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Miễn dịch heo 2.2.1 Miễn dịch thụ động 2.2.2 Miễn dịch chủ động .9 iv 2.3 Cơ chế sinh bệnh tiêu chảy E coli 2.4 Triệu chứng – bệnh tích 10 2.4.1 Triệu chứng 10 2.4.2 Bệnh tích 10 2.4.3 Chẩn đoán bệnh 10 2.5 Phòng trị bệnh 11 2.5.1 Phòng bệnh 11 2.5.2 Vệ sinh .12 2.5.3 Miễn dịch 13 2.5.4 Điều trị .14 2.6 Vaccine E coli Mỹ 14 2.7 Auto-vaccine 15 2.7.1 Định nghĩa auto-vaccine 15 2.7.2 Quy trình sản xuất auto-vaccine 15 2.7.3 Ưu điểm nhược điểm việc sản xuất auto-vaccine 15 2.7.3.1 Ưu điểm .15 2.7.3.2 Nhược điểm 16 2.8 Chất bổ trợ 16 2.8.1 Định nghĩa chất bổ trợ 16 2.8.2 Tác dụng chất bổ trợ .17 2.8.3 Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ sử dụng đề tài này) .17 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1.2 Địa điểm 18 3.2 Vật liệu thí nghiệm 18 3.2.1 Đối tượng khảo sát .18 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 18 3.2.3 Hóa chất .18 3.2.4 Môi trường nuôi cấy 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Đối tượng nghiên cứu 19 3.5 Phương pháp tiến hành 19 v 3.5.1 Qui trình phân lập giám định vi khuẩn E coli 19 3.5.1.1 Cách lấy mẫu 19 3.5.1.2 Phân lập vi khuẩn E coli 20 3.5.1.3 Tiêu chí đánh giá heo bị tiêu chảy nghi E coli 21 3.5.2 Điều chế auto-vaccine 21 3.5.3 Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể phản ứng ngưng kết chậm ống nghiệm 24 3.5.3.1 Cách lấy mẫu máu bảo quản 24 3.5.3.2 Chuẩn bị dịch kháng nguyên 26 3.5.3.3 Tiến hành phản ứng .27 3.5.3.4 Đọc kết .27 3.6 Đếm tổng số vi khuẩn E coli/gam phân heo 28 3.6.1 Cách lấy mẫu .28 3.6.2 Cách pha loãng mẫu 29 3.6.3 Cách thực .29 3.6.4 Cơng thức tính số lượng E coli/gam phân 29 3.7 Bố trí thí nghiệm để đánh giá hiệu vaccine .30 3.7.1 Đối với heo nái: 30 3.7.2 Đối với heo theo mẹ chủng auto-vaccine 30 3.7.3 Đối với heo con: Đếm số lượng E coli .30 3.7.4 Đối với heo tiêu chảy lấy mẫu phân cấy phân lập 31 3.8 Các tiêu theo dõi .31 3.9 Xử lý số liệu 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết lựa chọn chủng E coli làm auto – vaccine 32 4.2 Theo dõi phản ứng heo sau tiêm vaccine 32 4.3.Tỷ lệ tiêu chảy 32 4.4 Tỷ lệ heo tiêu chảy nghi E coli .33 4.5 Tỷ lệ ngày tiêu chảy .34 4.6 Hiệu giá kháng thể heo nái sau chủng ngừa loại vaccine 35 4.7 Hiệu giá kháng thể heo sau chủng auto – vaccine lần lần .36 vi 4.8 Số lượng E coli /gram phân 37 4.8.1 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli heo lần lần sau tiêm vaccine Mỹ heo nái 37 4.8.2 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli sau tiêm auto – vaccine lần lần .38 4.8.3 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân sau sử dụng hai loại vaccine 39 4.8.4 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine .40 4.8.5 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine .41 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 44 PHỤ LỤC 48 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 3.1 Khuẩn lạc E coli môi trường EMB .21 Hình 3.2: E coli mơi trường KIA 22 Hình 3.3 Trắc nghiệm IMViC E coli 22 Hình 3.4 Hình thái E coli nhuộm Gram 23 Hình 3.5 Khuẩn lạc E coli môi trường TSA .23 Hình 3.6 Cách lấy máu heo 25 Hinh 3.7 Phản ứng ngưng kết .28 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chẩn đoán phân biệt bệnh rối loạn tiêu hóa heo 11 Bảng 3.1 Phân lô, tiêm vaccine lấy mẫu máu 30 Bảng 3.2 Ngày tiêm liều tiêm auto-vaccine cho heo theo mẹ chủng autovaccine 30 Bảng 3.3 Lịch lấy mẫu máu để kiểm tra hàm lượng kháng thể heo 30 Bảng 3.4 Phân lô đếm số lượng E coli 30 Bảng 4.1:Tỷ lệ tiêu chảy heo sau sử dụng loại vaccine 32 Bảng 4.2 Tỷ lệ tiêu chảy nghi E coli heo sau sử dụng loại vaccine .33 Bảng 4.3 Tỷ lệ ngày tiêu chảy sau sử dụng loại vaccine 34 Bảng 4.4 Hiệu giá kháng thể heo nái sau chủng ngừa loại vaccine (log2) 35 Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể heo lần lấy máu sau sử dụng auto – vaccine (log2) 36 Bảng 4.6 Kết đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần lần tiêm vaccine Mỹ (log10) .37 Bảng 4.7 Kết đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần lần tiêm autovaccine (log10) .38 Bảng 4.8 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gram phân sau sử dụng hai loại vaccine 39 Bảng 4.9 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine .40 Bảng 4.10 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine .41 ix Log 10 10 8.47 8.74 lần lần Số lần Biểu đồ 4.6 Kết đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần lần tiêm vaccine Mỹ 4.8.2 Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli sau tiêm auto – vaccine lần lần Bảng 4.7 Kết đếm số lượng vi khuẩn E coli/gram phân lần lần tiêm auto-vaccine (log10) Nái Lấn Lần 8,69 8,43 8,47 8,14 8,73 8,18 8,44 8,19 8,53 8,32 8,44 8,12 8,81 8,21 8,47 8,44 8,08 9,04 10 8,46 8,96 Trung bình 8,55 8,37 P 0.02 Log 10 8.55 8.37 lần lần Số lần Biểu đồ 4.7 Kết đếm số lượng vi khuẩn E coli/gr phân lần lần tiêm auto-vaccine 38 Trong thí nghiệm tiêm auto-vaccine, số lượng vi khuẩn E coli/ gram phân đếm lần lần lần lược 8,55 log10 8,27 log10 Sau phân tích số liệu phương pháp thống kê sinh học, tiêm auto- vaccine lần lấy mẫu thứ số lượng khuẩn lạc E coli/gr phân đếm cao so với lần lấy mẫu thứ 2, nhiên không cao so với số lượng vi khuẩn E coli/gr phân đếm lần tiêm vaccine Mỹ Số lượng vi khuẩn E coli đếm được/gr phân lần thấp nhiều so với lần Giữa lần lấy mẫu, khác biệt số lượng E coli/gr phân có ý nghĩa với P = 0,02 < 0,05 Điều chứng tỏ sau tiêm auto – vaccine lần có đáp ứng miễn dịch heo kéo dài từ gây ức chế phát triển vi khuẩn E coli, giảm tỉ lệ tiêu chảy E coli gây cho heo 4.8.3 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân sau sử dụng hai loại vaccine Bảng 4.8 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gram phân sau sử dụng hai loại vaccine Loại vaccine 10 Nái Auto – 8,56 8,3 8,64 vaccine Vaccine Mỹ 8,58 8,62 8,57 Trung bình 8,31 8,43 8,28 8,51 8,27 8,73 8,71 8,46 8,31 8,44 8,75 8,63 8,58 8,78 8,75 8,6 P 0,005 Log 10 10 8.46 8.6 auto-vaccine vaccine Mỹ Vaccine Biểu đồ 4.8 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân sau sử dụng hai loại vaccine 39 Ở quy trình tiêm auto- vaccine số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli đếm 8,46 log10 so với quy trình tiêm vaccine Mỹ 8,6 log10 Sự khác biệt có ý nghĩa với P = 0,005 < 0,05 Điều chứng tỏ đáp ứng miễn dịch kháng nguyên auto-vaccine ức chế mạnh phát triển E coli so với vaccine Mỹ 4.8.4 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Bảng 4.9 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Auto - vaccine 8,69 Vaccine Mỹ 8,71 Loại vaccine 8,47 8,73 8,44 8,53 8,44 8,65 8,7 8,01 7,84 8,71 10 Trung bình 8,81 8,47 8,44 8,46 8,55 8,5 8,57 8,47 Nái Log 10 8,2 8,84 P 0,347 8.55 8.47 auto-vaccine vaccine Mỹ Vaccine Biểu đồ 4.9 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Qua bảng 4.9 biểu đồ 4.9 cho thấy số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân đếm lần sau chủng ngừa loại vaccine gần tương đương Điều cho thấy kháng thể heo mẹ truyền sang heo loại vaccine ngang (P=0,347>0,05) 40 4.8.5 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/ gram phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Bảng 4.10 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Auto – vaccine 8,43 8,14 8,18 8,19 8,32 Vaccine Mỹ 8,79 8,58 8,44 8,52 9,05 Loại vaccine 10 8,12 8,21 8,08 9,04 8,96 8,37 8,8 8,73 8,96 8,74 Nái 8,76 8,93 Trung bình P 0,000 Log 10 10 8.37 8.74 auto-vaccine vaccine Mỹ Vaccine Biểu đồ 4.10 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Qua bảng 4.10 biểu đồ 4.10, sau phân tích số liệu phương pháp thống kê sinh học Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli/gr phân đếm lần lấy mẫu thứ sau chủng ngừa loại vaccine có khác biệt có ý nghĩa (P=0,000) Việc type kháng ngun auto-vaccine có tính đặc hiệu vi khuẩn dùng để tạo vaccine lấy trại thử nghiệm động vật cần thí nghiệm Cịn vaccine Mỹ có type kháng ngun không giống với type kháng nguyên vi khuẩn E coli trại nên gây đáp ứng miễn dịch Điều cho thấy đáp ứng miễn dịch auto-vaccine kéo dài bảo hộ heo sau cai sữa 41 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch tốt Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm, không ảnh hưởng đến sức khỏe heo nái heo Hiệu phòng ngừa tiêu chảy E coli auto-vaccine thực nghiệm tương đương với vaccine phòng bệnh E coli Mỹ Tiêm auto-vaccine làm giảm rõ rệt lượng vi khuẩn E coli/gr phân heo so với tiêm vaccine Mỹ (P=0,005) 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu sử dụng auto- vaccine nhiều lần để có kết xác - Đảm bảo điều kiện chăm sóc ni dưỡng tốt cho heo nhằm tránh nguyên nhân khác gây tiêu chảy E coli để heo khỏe mạnh nhằm đáp ứng miễn dịch đồng với auto-vaccine - Nghiên cứu đánh giá hiệu giá kháng thể tương ứng với yếu tố kết bám 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO u TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Ngọc Hải Phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu heo sau cai sữa khảo sát khả nhạy cảm chúng số kháng sinh Luận án Thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, 1999 Tủ sách ĐH Nông Lâm Tp HCM Thái Quốc Hiếu Ảnh hưởng việc bổ sung kháng sinh chế phẩm sinh học vào thức ăn để phòng tiêu chảy E coli heo tỉnh Tiền Giang Luận án Thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, 2002 Tủ sách ĐH Nơng Lâm Tp HCM Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn Thị Kim Hương Vaccine & chế phẩm miễn dịch phòng & điều trị NXB Y Học, 2003 Nguyễn Đình Giậu Sinh lý học người động vật NXB Đại Học Quốc Gia Tp HCM, 2000 u TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI “Vắc-xin”, Wikipedia, 08/03/2007 “E coli”, Wikipedia, 13/03/2007 “Escherichia coli”, Wikipedia, 17/05/2007 ”Vaccine”, Wikipedia “Diarrhea”, Wikipedia, 09/07/2007 10 “Autovaccination”, Wikipedia, 14/05/2007 11 “Immunologic adjuvant”, Wikipedia, 28/07/2007 12 “Montanide for antibodies production”, SEPPIC company 43 KẾT QUẢ THỐNG KÊ Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli heo lần lần sau tiêm vaccine Mỹ heo nái ( log10 ) One-way ANOVA: Vaccin My versus Lan lần Two-sample T for SLE.coli lan1 vs SLE.colilan2 SLE.coli SLE.coli N 30 30 Mean 8.477 8.736 StDev 0.375 0.251 SE Mean 0.069 0.046 Difference = mu SLE.coli lan1 - mu SLE.colilan2 Estimate for difference: -0.2587 95% CI for difference: (-0.4242, -0.0931) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -3.14 P-Value = 0.003 DF = 50 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli heo lần lần sau tiêm auto-vaccine heo nái heo ( log10 ) Two-sample T for SLE.coli lan1 vs SLE.colilan2 SLE.coli SLE.coli N 30 30 Mean 8.552 8.370 StDev 0.218 0.353 SE Mean 0.040 0.065 Difference = mu SLE.coli lan1 - mu SLE.colilan2 Estimate for difference: 0.1820 95% CI for difference: (0.0297, 0.3343) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 2.40 P-Value = 0.020 DF = 48 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli lần lần sau sử dụng hai loại vaccine ( log10 ) Two-sample T for autovaccine vs vaccine autovacc vaccine N 30 30 Mean 8.458 8.602 StDev 0.192 0.185 SE Mean 0.035 0.034 Difference = mu autovaccine - mu vaccine Estimate for difference: -0.1438 95% CI for difference: (-0.2415, -0.0462) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -2.95 44 P-Value = 0.005 DF = 57 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Two-sample T for autovaccine vs vaccine autovacc vaccine N 30 30 Mean 8.552 8.477 StDev 0.218 0.375 SE Mean 0.040 0.069 Difference = mu autovaccine - mu vaccine Estimate for difference: 0.0753 95% CI for difference: (-0.0841, 0.2348) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 0.95 P-Value = 0.347 DF = 46 So sánh số lượng khuẩn lạc vi khuẩn E coli lần lần sau sử dụng hai loại vaccine Two-sample T for autovaccine vs vaccine autovacc vaccine N 30 30 Mean 8.370 8.736 StDev 0.353 0.251 SE Mean 0.065 0.046 Difference = mu autovaccine - mu vaccine Estimate for difference: -0.3653 95% CI for difference: (-0.5241, -0.2066) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -4.62 P-Value = 0.000 DF = 52 Kết ngưng kết chậm ống nghiệm heo nái với auto-vaccine vaccine Mỹ One-way ANOVA: KQ1 versus Khoi Analysis of Variance for HGKT Source DF SS MS Vaccine 0.80 0.80 Error 18 40.40 2.24 Total 19 41.20 Level N 10 10 Pooled StDev = Mean 7.700 7.300 StDev 1.350 1.633 1.498 F 0.36 P 0.558 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -( -* -) ( -* ) + -+ -+ -7.00 7.70 8.40 Kết ngưng kết chậm ống nghiệm heo với auto-vaccine lần lấy máu One-way ANOVA: KQ2 versus Khoi Analysis of Variance for HGKT Source DF SS lan lap 58.04 chuong 186.19 Interaction 86.45 Error 40 63.21 Total 59 393.89 MS 58.04 20.69 9.61 1.58 F 36.73 13.09 6.08 45 P 0.000 0.000 0.000 lan lap Mean 5.75 7.72 chuong 10 Mean 7.47 7.15 7.99 4.38 7.99 3.88 8.15 4.05 8.49 7.82 Individual 95% CI -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ -5.60 6.30 7.00 7.70 Individual 95% CI -+ -+ -+ -+ -( * -) ( * -) ( * -) ( -* ) ( * -) ( -* ) ( * -) ( -* ) ( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+ -3.20 4.80 6.40 8.00 So sánh tỷ lệ tiêu chảy nghi E coli heo sau sử dụng loại vaccine Chi-Square Test: TCK E coli, TC E coli Expected counts are printed below observed counts TCKdoE.c TCdoE.co Total Chi-Sq = Total 23 18 20.50 20.50 41 18 23 20.50 20.50 41 41 0.305 + 0.305 + 0.305 + 0.305 = 1.220 41 82 DF = 1, P-Value = 0.269 So sánh tỷ lệ tiêu chảy heo sau sử dụng loại vaccine Chi-Square Test: TC, KTC Expected counts are printed below observed counts Total Chi-Sq = TC KTC Total 41 54 95 42.11 52.89 41 49 39.89 50.11 82 0.029 + 103 90 185 0.023 + 0.031 + 0.025 = 0.108 DF = 1, P-Value = 0.743 46 10 Tỷ lệ ngày tiêu chảy sau sử dụng loại vaccine Chi-Square Test: NTC, NKTC Expected counts are printed below observed counts NTC Total Chi-Sq = NKTC Total 95 64 31 69.84 25.16 72 18 66.16 23.84 136 49 90 185 0.488 + 1.354 + 0.515 + 1.430 = 3.787 DF = 1, P-Value = 0.052 47 PHỤ LỤC ™ CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA a) Phản ứng Indol: Cách thực hiện: dùng que cấy trịn vơ trùng lấy vi khuẩn từ môi trường giữ giống TSA cấy vào môi trường NB Điều kiện: ủ ấm 370C/24 Đọc kết quả: sau 24 nuôi cấy, ta nhỏ – giọt thuốc thử Kowacs vào môi trường, lắc • Dương tính (+): vịng đỏ xuất phía • Âm tính (-): vịng xuất khơng có màu đỏ Vi khuẩn E coli cho phản ứng Indol dương tính (+) b) Phản ứng MR (Methyl red): Cách thực hiện: dùng que cấy trịn vơ trùng lấy vi khuẩn từ môi trường TSA cấy vào môi trường canh Clark-lubs Điều kiện: ủ ấm 370C/24 Đọc kết quả: sau 24 nuôi cấy, ta nhỏ – giọt thuốc thử methyl red vào môi trường, lắc • Dương tính (+): mơi trường có màu đỏ • Âm tính (-): mơi trường khơng có màu đỏ Vi khuẩn E coli cho phản ứng MR dương tính (+) c) Phản ứng VP (Voges Proskauer): Cách thực hiện: dùng que cấy trịn vơ trùng lấy vi khuẩn từ môi trường TSA cấy vào môi trường canh Clark-lubs Điều kiện: ủ ấm 370C/24 Đọc kết quả: sau 24 nuôi cấy ta nhỏ – giọt KOH 10 % hay NaOH 40 %, sau nhỏ tiếp – giọt – napthol 10 % Hơ đèn cồn, lắc đều, sau để yên – 10 phút • Dương tính (+): mơi trường xuất màu đỏ nhạt • Âm tính (-): mơi trường màu vàng nhạt Vi khuẩn E coli cho phản ứng VP âm tính (-) 48 d) Phản ứng phân giải citrate: Cách thực hiện: dùng que cấy trịn vơ trùng lấy vi khuẩn từ môi trường TSA, ria vi khuẩn mặt thạch nghiêng môi trường Simmons citrate Điều kiện: ủ ấm 370C/24 Đọc kết quả: • Dương tính (+): mơi trường có màu xanh dương • Âm tính (-): mơi trường có màu xanh cây, không đổi màu Vi khuẩn E coli cho phản ứng phân giải citrate âm tính (-) ± THÀNH PHẦN CÁC MƠI TRƯỜNG – HĨA CHẤT EMB (pH: 7,2) Pepton Lactose Succrose K2HPO4 Agar Eosin Methylen Blue Nước cất KIA (pH: 7,4 +/- 0,2) 10 g 5g 5g 2g 13,5 g 0,4 g 0,065 g 1000 ml Polypepton peptone Lactose Dextrose NaCl Ferric ammonium citrate Sodium thiosulfate Agar Phenol red Nước cất TSA (pH: 7,3 +/- 0,2) 20 g 20 g 1g 5g 0,5 g 0,5 g 15 g 0,025 g 1000 ml Soya peptone Tryptone peptone NaCl Agar Nước cất 15 g 5g 5g 18 g 1000 ml Soya peptone Tryptone peptone 15 g 5g TSB 49 NaCl Nước cất Canh tryptone 5g 1000 ml Cao thịt Peptone NaCl Nước cất Clark – Lubs 5g 10 g 5g 1000 ml Peptone Glucose Phosphate buffer Nước cất Simmons Citrate Agar (pH: 6,9) 5g 5g 5g 1000 ml Sodium citrate K2PO4 MgSO4 Bromothymol NaCl NH4H2PO4 Agar Nước cất Nước muối sinh lý 2g 1g 0,2 g 0,08 g 5g 1g 18 g 1000 ml NaCl Nước cất Thuốc thử Kowac’s 9g 1000 ml p-Dimethylaminobenzaldehyde Isoamyl alcohol HCl đậm đặc 10 Thuốc thử Methyl Red 10 g 150 ml 50 ml Methyl red Ethanol 95% Nước cất (vừa đủ) 11 Crystal violet 0,1 g 300 ml 500 ml Crystal violet Cồn 960 Phenol Nước cất 12 Lugol 0,4 g 10 ml 1g 100 ml KI Iod tinh thể Nước cất 2g 1g 300 ml 50 13 Fuxchine Fuxchine kiềm Cồn 960 Phenol Nước cất 14 EMB (pH: 7,2) 0,3 g 10 ml 5g 35 ml Pepton Lactose Succrose K2HPO4 Agar Eosin Methylen Blue Nước cất 15 KIA (pH: 7,4 +/- 0,2) 10 g 5g 5g 2g 13,5 g 0,4 g 0,065 g 1000 ml Polypepton peptone Lactose Dextrose NaCl Ferric ammonium citrate Sodium thiosulfate Agar Phenol red Nước cất 16 TSA (pH: 7,3 +/- 0,2) 20 g 20 g 1g 5g 0,5 g 0,5 g 15 g 0,025 g 1000 ml Soya peptone Tryptone peptone NaCl Agar Nước cất 15 g 5g 5g 18 g 1000 ml Soya peptone Tryptone peptone NaCl Nước cất 18 Canh tryptone 15 g 5g 5g 1000 ml Cao thịt Peptone NaCl Nước cất 19 Clark – Lubs 5g 10 g 5g 1000 ml 17 TSB Peptone 5g 51 Glucose Phosphate buffer Nước cất 20 Simmons Citrate Agar (pH: 6,9) 5g 5g 1000 ml Sodium citrate K2PO4 MgSO4 Bromothymol NaCl NH4H2PO4 Agar Nước cất 21 Nước muối sinh lý 2g 1g 0,2 g 0,08 g 5g 1g 18 g 1000 ml NaCl Nước cất 22 Thuốc thử Kowac’s 9g 1000 ml p-Dimethylaminobenzaldehyde Isoamyl alcohol HCl đậm đặc 23 Thuốc thử Methyl Red 10 g 150 ml 50 ml Methyl red Ethanol 95% Nước cất (vừa đủ) 24 Crystal violet 0,1 g 300 ml 500 ml Crystal violet Cồn 960 Phenol Nước cất 25 Lugol 0,4 g 10 ml 1g 100 ml KI Iod tinh thể Nước cất 26 Fuxchine 2g 1g 300 ml Fuxchine kiềm Cồn 960 Phenol Nước cất 0,3 g 10 ml 5g 35 ml 52 ... NI – THÚ Y [\ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM AUTO – VACCINE PHÒNG BỆNH DO E COLI TRÊN HEO Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Th.S NGUYỄN THỊ THU NĂM NGUYỄN VĂN ĐỨC... anh Sinh viên thực Nguyễn Văn Đức ii TÓM TẮT Đề tài ? ?thử nghiệm auto – vaccine phòng bệnh E coli heo? ?? Thời gian thực từ 01/11/2008 đến 01 /03/ 2009 phịng thí nghiệm vi sinh, Bộ Môn Vi Sinh Truyền... coli g? ?y bệnh heo Kháng nguyên F5 tìm th? ?y chủ y? ??u E coli g? ?y bệnh bê, th? ?y nhiều E coli g? ?y bệnh heo Sự hình thành kháng nguyên pili độc tố đường ruột kiểm soát di truyền plasmid truyền lan