THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA

THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Đề tài nghiên cứu này tuy Con làm còn nhiều thiếu sót và chƣa tốt nhƣng Con cũng xin dành tặng ba mẹ. Đây là kết quả mà 22 năm ba mẹ làm lụng để nuôi dạy con. Con hy vọng món quà bé nhỏ này sẽ làm vui và vơi bớt phần nào nỗi khổ cực, lo âu của ba mẹ. Con trai của ba mẹ yêu ba mẹ nhiều lắm. Em xin chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Và ngƣời có ảnh hƣởng rất lớn đến sự hoàn thành đề tài này là thầy Hải (TS. Nguyễn Ngọc Hải). Em cám ơn thầy rất nhiều về những gì mà thầy đã dành cho em. Em đến với thầy trong một hoàn cảnh rất khác với các bạn, nhƣng với sự quan tâm hƣớng dẫn ân cần của thầy đã giúp em có nhiều nghị lực và niềm vui mà vƣợt qua các giai đoạn khó khăn. Khi làm việc với thầy, em không chỉ học hỏi đƣợc ở thầy kiến thức, kỹ năng mà em còn thấy ở thầy nhiều đức tính cao đẹp để em học tập. Thầy có lối sống thật đơn giản, nhƣng thầy rất giàu tình cảm và đức hy sinh. Thầy là một Nhà Giáo mẫu mực đầu tiên mà em đƣợc gặp. Em xin cảm ơn TS. Lê Anh Phụng, ThS. Trần Thị Bích Liên, cô Lê Thị Hà và BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và cho em điều kiện thực hiện đề tài này. Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị ở công ty Gia Nam đã nhiệt tình giúp em hoàn thành đề tài này. Và các bạn của tôi (Uyên, Thái, Phi, Linh, Vy), những ngƣời đã chia sẻ, giúp đỡ tôi khi gặp khó khăn. Cuối cùng, anh cám ơn Em. Em luôn bên cạnh cổ vũ khi anh mệt mỏi và động viên khi anh cảm thấy chán. Em là nguồn tinh thần vô cùng quý báu của anh. CAO VĂN HÒA Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007 iv TÓM TẮT CAO VĂN HÕA. Đề tài: “Thử Nghiệm Điều Chế Auto-Vaccine Phòng Bệnh Tiêu Chảy Do E. coli Trên Heo Con Sau Cai Sữa”. Thời gian: 01/05/2007 - 02/08/2007. Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM và công ty TNHH Gia Nam, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Bƣớc 1, phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân tiêu chảy ở trại heo, các chủng E. coli này sẽ đƣợc kiểm tra sinh hóa bằng nghiệm pháp IMViC và đƣợc định type kháng nguyên F4, F5, F6. Bƣớc 2, lựa chọn 5 chủng E. coli có kết quả phản ứng rõ ràng để sản xuất auto- vaccine. Bƣớc 3, bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine: Lô 1: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 1 lần. Lô 2: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 2 lần. Lô đối chứng: 2 bầy heo con, đƣợc tiêm chất bổ trợ. Việc đánh giá hiệu quả auto-vaccine dựa vào hiệu giá kháng thể, tỷ lệ heo tiêu chảy, tăng trọng trung bình tuyệt đối và các phản ứng phụ sau tiêm, Kết quả: Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch cao và kéo dài. Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm và không ảnh hƣởng đến tăng trọng heo con. Chƣa thể đánh giá chính xác đƣợc hiệu quả bảo hộ tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine. v SUMMARY CAO VAN HOA, Nong Lam University, HCM city. Graduating thesis topic: “The experiment of auto-vaccine production to protect the post – weaning piglet from the diarrhoea caused by E. coli”. The thesis was carried out at Microbiology lab, Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam University and Gia Nam Ltd. Company, Binh Duong province from 5/2007 to 8/2007. Supervisor: Dr. NGUYEN NGOC HAI First, isolate E. coli from the diarrhoea feces and identify them by IMViC test, then serotype with F4, F5, F6 antiserum. Second, selecte 5 E. coli isolates of serotype F4 or F5 to produce the auto- vaccine. Third, set up the experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the experiment was repeated in 2 times): The first group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection one times. The second group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection two times with 10 days interval. The control group: 2 litters (22 piglets, from 14 to 20 days aged), adjuvant injection two times with 10 days interval. The efficacy of auto-vaccine was evaluated by antiody titers, medium daily gain and the side effects. Result: The auto-vaccine made a high antibody titers and long immunization. The auto-vaccine did not bring neither the bad effects to piglets vaccinated health nor the gain weight of piglet. The results could not conclude exactly the efficacy of auto-vaccine on E. Coli diarrhoea control. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 i Trang bìa 2 . ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt tiếng Việt . iv Tóm tắt tiếng Anh v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt xii Danh sách các hình xiii Danh sách các bảng . xiv Danh sách các biểu đồ xv Danh sách các sơ đồ xvi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích và yêu cầu . 2 1.2.1. Mục đích . 2 1.2.2. Yêu cầu . 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 vii 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli . 3 2.1.1. Định nghĩa 3 2.1.2. Đặc tính sinh hóa 4 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên . 4 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O 4 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K . 5 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) . 5 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) 6 2.2. Bệnh tiêu chảy . 6 2.2.1. Khái niệm . 6 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy 7 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi . 7 2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật . 7 2.2.2.3. Vi sinh vật . 8 2.3. Sự miễn dịch 9 2.3.1. Khái niệm miễn dịch 9 2.3.2. Phân loại miễn dịch 9 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu . 9 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu 10 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) 11 viii 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) 11 2.3.3.2. Kháng thể (antibody) . 13 2.4. Auto-vaccine . 16 2.4.1. Định nghĩa vaccine . 16 2.4.2. Phân loại vaccine 16 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) 16 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) . 16 2.4.2.3. Các “toxoid” 17 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) . 17 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu 17 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine 18 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vacine 18 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine 18 2.4.5.1. Ƣu điểm . 18 2.4.5.2. Nhƣợc điểm . 19 2.5. Chất bổ trợ . 19 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ 19 2.5.2. Tác dụng của chat bổ trợ 20 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong đề tài này) . 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 21 ix 3.1. Thời gian và địa điểm 21 3.1.1. Thời gian 21 3.1.2. Địa điểm . 21 3.2. Vật liệu 21 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu . 21 3.2.2. Vật liệu và thiết bị 21 3.3. Nội dung 22 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 22 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu . 22 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật . 23 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập 23 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa 23 3.4.3. Điều chế auto-vaccine 28 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine 30 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine . 30 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm 30 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm 30 3.4.6. Phƣơng pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm . 32 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản 32 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên . 33 x 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng . 34 3.4.6.4. Đọc kết quả . 34 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 35 3.6 Xử lý số liệu . 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 37 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine . 37 4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 38 4.3. Hiệu giá kháng thể 39 4.3.1. Thí nghiệm 1 39 4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất . 40 4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai . 40 4.3.1.3. Lần rút máu thứ ba 41 4.3.2. Thí nghiệm 2 43 4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất . 43 4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai . 44 4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba 44 4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể . 46 4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy 47 4.4.1. Thí nghiệm 1 47 4.4.2. Thí nghiệm 2 48 [...]... “THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E coli TRÊN HEO SAU CAI SỮA” 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích Thử điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E coli trên heo con sau cai sữa cho trại chăn nuôi 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập thành công chủng E coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con - Sản xuất auto-vaccine và tiêm thử nghiệm trên heo con sau cai sữa - Theo dõi đáp ứng miễn dịch trên. .. của tiêu chảy: Tính đàn hồi của da kém, khô niêm mạc hầu họng Huyết áp hạ Nƣớc tiểu có ít Cl- và Na+ 7 Giảm thể tích huyết tƣơng Máu đặc, huyết tƣơng có hàm lƣợng Cl- và Na+ giảm, hàm lƣợng urea tăng Tiêu chảy có 4 cơ chế chính, đó là: tiêu chảy do phân tiết, tiêu chảy do thẩm thấu, tiêu chảy do rối loạn vận động ruột và tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột Tiêu chảy do vi khuẩn E coli thƣờng theo... hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E coli chủ yếu dựa vào thuốc kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế nhƣ hiện tƣợng đề kháng kháng sinh và có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng Nghiên cứu tìm kiếm vaccine hiệu quả cho việc phòng tiêu chảy trên heo sau cai sữa do E coli là hết sức cần thiết Vi khuẩn E coli có nhiều type kháng nguyên nên việc nghiên cứu điều chế một loại vaccine phù... ở đƣờng tiêu hóa, thú đi phân lỏng, đôi khi có máu, bọt khí, chất nhầy… Hậu quả quan trọng của tiêu chảy là suy dinh dƣỡng và gây thiệt hại về kinh tế, vì khi bị tiêu chảy bệnh súc sẽ ăn ít; đồng thời, khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng cũng giảm và có thể chết thú Tiêu chảy xảy ra trên mọi lứa tuổi heo Tuy nhiên, bệnh thƣờng gặp và gây nguy hiểm ở giai đoạn heo con theo mẹ, heo vừa mới cai sữa hoặc... giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) 39 Bảng 4.2 Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) 43 Bảng 4.3 Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm 46 Bảng 4.4 Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 47 Bảng 4.5 Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 48 Bảng 4.6 Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm 49 Bảng 4.7 Kết quả thống kê tăng... những dòng E coli di động Hiện nay, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H 2.2 Bệnh tiêu chảy trên heo 2.2.1 Khái niệm Tỷ lệ nƣớc trong phân bình thƣờng chiếm 80%, phân táo bón dƣới 70%, phân nhão 85%, phân lỏng trên 85% (tiêu chảy) Roux đã định nghĩa: tiêu chảy là một hội chứng đặc trưng bởi sự tống phân nhanh và phân nhiều nước” (Nguyễn Thị Minh An và ctv, 2001) Trên thực tế, tiêu chảy là... thể đặc hiệu và là cơ sở cho việc chẩn đoán huyết thanh học và xác định type huyết thanh của các dòng E coli, cũng nhƣ xác định các 6 kháng thể bảo vệ Vì vậy, các kháng nguyên này đƣợc dùng để chế tạo vaccine phòng bệnh E coli trên heo con Các tiêm mao liên quan đến E coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con là F4, F5, F6 và F41 2.1.3.4 Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) Kháng nguyên H có... thứ hai (thí nghiệm 2) 44 Biểu đồ 4.7 Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ ba (thí nghiệm 2) 44 Biểu đồ 4.8 Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (TN2) 45 Biểu đồ 4.9 Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 47 Biểu đồ 4.10 Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 48 Biểu đồ 4.11 Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 1)... nhân gây tiêu chảy Tiêu chảy là một hiện tƣợng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy phân biệt thật rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy không giản đơn Đa số các nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đề nghị phân chia các nguyên nhân gây tiêu chảy thành 3 nhóm chính nhƣ sau: 2.2.2.1 Điều kiện ngoại cảnh bất lợi Chủ yếu do thời... Escherichia coli EMB: Eosin Methylene Blue Lactose KIA: Kligler Iron Agar TSA: Tryptone Soya Agar TSB: Tryptone Soya Broth SCA: Simmons Citrate Agar TN: Thí Nghiệm KT: Kháng Thể IMViC: Indol – Methyl Red – Voges Proskauer – Citrate xii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 3.1 Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con 22 Hình 3.2 Phân lập E coli trên môi trƣờng EMB 23 Hình 3.3 Vi khuẩn E coli lên men . gây bệnh tiêu chảy cho heo con. - Sản xuất auto-vaccine và tiêm thử nghiệm trên heo con sau cai sữa. - Theo dõi đáp ứng miễn dịch trên heo thí nghiệm. experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the experiment was repeated in 2 times): The first group: 3 litters (28 piglets,