29 5 chủng E. coli đƣợc chọn lọc Môi trƣờng canh TSB Li tâm bỏ dịch nổi 4000 vòng/phút trong 15 phút. 2 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý Hòa trong nƣớc muối chứa 0,3% formalin Hòa trong nƣớc muối sinh lý, điều chỉnh để đạt nồng độ 2.10 9 tế bào/ml Sơ đồ 3.2. Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo Ørskov, 1977) Đếm số lƣợng trên môi trƣờng EMB Ủ qua đêm ở 4 0 C Làm chết vi khuẩn Ủ 37 0 C, 24 giờ Rửa trong 10ml nƣớc muối sinh lí. Thu dịch rửa. 3 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý 30 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine Vaccine đƣợc kiểm tra trên các môi trƣờng: thạch máu, thạch thƣờng, thạch nuôi cấy nấm, nƣớc thịt đƣờng, nƣớc thịt yếm khí. Lắc kĩ lọ chứa vaccine trƣớc khi lấy, hút 0,1ml cho vào mỗi môi trƣờng. Mỗi loại môi trƣờng dùng hai ống. Sau đó đem ủ ấm 37 o C, riêng môi trƣờng nấm ủ ở nhiệt độ phòng để kiểm tra kết quả. Đọc kết quả sau 7 ngày nuôi cấy. Vaccine đƣợc xem là vô trùng khi tất cả ống của các loại môi trƣờng nuôi cấy không mọc bất kì loại sinh vật nào. Nếu có mặt của vi sinh vật phải kiểm tra đợt 2 và xác định kết quả. 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto – vaccine 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố (số lần tiêm) với 2 mức độ : tiêm 1 lần vào lúc bắt đầu thí nghiệm (14 – 20 ngày tuổi) và tiêm 2 lần: lần 1 lúc bắt đầu thí nghiệm (14 – 20 ngày tuổi) và lần 2 sau lần 1 mƣời ngày (24 – 30 ngày tuổi). Ngoài ra, chúng tôi còn bố trí thêm một lô heo đối chứng, lô heo này chỉ tiêm chất bổ trợ 2 lần. 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm Chọn 8 bầy heo con khỏe mạnh, 14 – 20 ngày tuổi. Phân thành 3 lô: Lô thứ nhất: 3 bầy. Lô thứ hai: 3 bầy. Lô đối chứng: 2 bầy. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. 31 Sơ đồ 3.3. Tóm tắt bố trí thí nghiệm Chọn 8 bầy heo con khỏe mạnh, 14 – 20 ngày tuổi Lô 2 (3 bầy) Tiêm vaccin 2 lần Lô 1 (3 bầy) Tiêm vaccin 1 lần Lô đối chứng (2 bầy) Tiêm chất bổ trợ Lấy máu theo dõi biến động hàm lƣợng kháng thể Theo dõi các phản ứng phụ trên heo Tỉ lệ tiêu chảy. Tăng trọng tuyệt đối Heo thí nghiệm Liều tiêm Số lần tiêm Vị trí tiêm Lô 1 3 bầy 2 ml 1 Dƣới da vùng cổ Lô 2 3 bầy 2 ml 2 Lô đối chứng 2 bầy 2 ml 2 Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con ngày Bắt đầu thí nghiệm Ngày thứ 10 Ngày thứ 20 Rút máu, tiêm vaccine lần 1 Rút máu, tiêm vaccine lần 2 Rút máu Sơ đồ 3.4. Lịch trình thực hiện của 1 lần thí nghiệm Kết thúc thí nghiệm Ngày thứ 40 32 3.4.6. Phƣơng pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản Thời điểm lấy : bắt đầu thí nghiệm, ngày thứ 10 và ngày thứ 20 của thí nghiệm. Mỗi thời điểm, lấy máu 3 heo con ở mỗi bầy. Lật ngửa heo cần lấy máu sao cho đầu hƣớng về phía ngƣời kĩ thuật viên. Tiến hành sát trùng vị trí hõm tam giác phía trƣớc xƣơng đòn. Sau đó, sử dụng ống tiêm rút ra một cách từ từ 2 – 3 ml máu. Rút kim ra, sát trùng và day chặt nơi tiêm tránh sƣng và phản ứng cục bộ. Rút hết pittông về phía sau, đặt ống tiêm nằm ngang để máu đông tự nhiên ở nhiệt độ thƣờng khoảng 30 phút. Vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4 o C. Về đến phòng thí nghiệm bảo quản mẫu qua đêm ở 4 o C để thu đƣợc nhiều huyết thanh hơn (Phạm Kim Ngọc, 2002) Tách phần huyết thanh nổi phía trên cục máu đông trong ống chích cho vào các ống nghiệm vô trùng, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Chiết huyết thanh sang các eppendof vô trùng, ly tâm lần 2 cũng với tốc độ và thời gian nhƣ trên. Chiết huyết thanh sang các ống nghiệm sạch để thực hiện phản ứng ngƣng kết. Hình 3.9: Rút máu heo con 33 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên Quy trình và phƣơng pháp chuẩn bị kháng nguyên tƣơng tự nhƣ chuẩn bị kháng nguyên sản xuất auto-vaccine. Dịch kháng nguyên sử dụng cho phản ứng ngƣng kết có nồng độ từ 10 8 – 10 9 tế bào/ml và từ những chủng sản xuất auto-vaccine. Sau sản xuất, dịch kháng nguyên đƣợc bảo quản ở 4 o C đến khi sử dụng. Làm chết vi khuẩn Ủ 37 0 C, 24 giờ 5 chủng E. coli đƣợc chọn lọc Môi trƣờng canh TSB Li tâm bỏ dịch nổi 4000 vòng/phút trong 15 phút. 2 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý Hòa trong nƣớc muối chứa 0,3% formalin Hòa trong nƣớc muối sinh lý, điều chỉnh để đạt nồng độ 10 9 tế bào/ml Sơ đồ 3.5. Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo Ørskov, 1977) Đếm số lƣợng trên môi trƣờng EMB Ủ qua đêm ở 4 0 C Rửa trong 10ml nƣớc muối sinh lí. Thu dịch rửa. 3 lần li tâm và rửa trong nƣớc muối sinh lý 34 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng Chuẩn bị 9 bộ ống nghiệm có nắp đậy, mỗi bộ 10 ống. Mỗi ống cho vào 500 µl nƣớc muối sinh lý, riêng ống đầu tiên của mỗi bộ cho vào 800 µl. Sau đó, cho vào ống đầu tiên của mỗi bộ ống nghiệm 200 µl dịch huyết thanh của mỗi mẫu máu tƣơng ứng. Trộn đều rồi hút 500 µl cho vào ống tiếp theo. Cứ nhƣ vậy đến ống thứ 8 thì hút bỏ 500 µl dịch đã trộn. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 500 µl dịch kháng nguyên, để ở 37 o C trong 2 giờ và để qua đêm ở 4 o C. Ngoài ra, chúng tôi còn bố trí một ống đối chứng âm chứa 200 µl dịch kháng nguyên và 800 µl nƣớc muối sinh lí. Nƣớc muối sinh lí (µl) 800 500 500 500 500 500 500 500 500 500 Huyết thanh 200 Hiệu giá 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 Kháng nguyên (µl) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 Hiệu giá mới 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 3.4.6.4. Đọc kết quả Qua một đêm ủ ở 4 o C, chúng tôi tiến hành đọc kết quả phản ứng ngƣng kết, xác định ở độ pha loãng nào có kết quả âm tính thì độ pha loãng trƣớc là hiệu giá kháng huyết thanh của mẫu máu tƣơng ứng. Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc: 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl Sơ đồ 3.6. Cách tiến hành phản ứng ngƣng kết xác định hiệu giá kháng huyết thanh 35 Ống đối chứng âm: kết quả âm tính, có lắng tụ kháng nguyên dƣới đáy ống nghiệm Kháng nguyên lắng mạng lƣới đều khắp ống nghiệm: phản ứng dƣơng tính. Kháng nguyên lắng tụ giữa đáy ống nghiệm: phản ứng âm tính. 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi tăng trọng tuyệt đối của heo trong khoảng thời gian theo dõi (14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi) - Theo dõi tỉ lệ tiêu chảy - Theo dõi phản ứng của heo. Run rẩy, ói mửa, ủ rủ, bỏ bú. Theo dõi trong 2 giờ sau khi tiêm (Lê Văn Hùng, 2002). Theo dõi phản ứng cục bộ tại chỗ tiêm (sƣng, nóng, đỏ, đau) sau khi tiêm. Theo dõi heo: sức ăn, vận động, hô hấp trong suốt thí nghiệm. Heo/lô Tỷ lệ heo dị ứng/lô(%) Heo có triệu chứng dị ứng/lô = x 100 = Tăng trọng trung bình tuyệt đối (gam/ngày/con) Tổng trọng lƣợng kết thúc TN – Tổng trọng lƣợng bắt đầu TN Số heo x Số ngày nuôi x 100 Tỷ lệ heo tiêu chảy/lô (%) Heo có triệu chứng tiêu chảy của lô Heo của lô = 36 - Theo dõi hiệu giá kháng thể ngƣng kết. Hiệu giá kháng thể đƣợc tính bằng hệ số chuyển dƣơng hay trung bình hình học MGT (Medium Geometry Titer): 3.6. Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý theo trắc nghiệm F và trắc nghiệm χ 2 trong phần mềm Minitab. MGT ∑ Mẫu số của hiệu giá kháng thể ngƣng kết ∑ Mẫu xét nghiệm = 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine Trong quá trình thu hoạch mẫu, chúng tôi đã lấy đƣợc 60 mẫu phân tiêu chảy trên heo con. Sau khi phân lập trên môi trƣờng EMB, chúng tôi lựa chọn đƣợc 20 khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli. 20 chủng vi khuẩn này đƣợc kiểm tra bằng phản ứng lên men đƣờng và nghiệm pháp IMViC thì đều cho kết quả dƣơng tính của E. coli. 20 chủng E. coli này tiếp tục đƣợc kiểm tra định type F4, F5, F6 thì cho kết quả: 7 chủng là F4. 6 chủng là F5. 2 chủng là F4 + F5. 5 chủng âm tính. Qua kết quả định type, chúng ta thấy đƣợc rằng heo con ở trại bị nhiễm E. coli type F4 và F5 với tỷ lệ khá cao. Mà F4 và F5 là kháng nguyên rất mạnh. E. coli có yếu tố bám F4, F5 là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên heo con. Từ kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc 5 chủng E. coli có phản ứng định type dƣơng tính rõ ràng để sản xuất auto-vaccine. Bao gồm: 2 chủng F4, 1 chủng F5, 2 chủng F4 + F5. . chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi tăng trọng tuyệt đối của heo trong khoảng thời gian theo dõi (14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi) - Theo dõi tỉ lệ tiêu chảy - Theo dõi phản ứng của heo. . – Tổng trọng lƣợng bắt đầu TN Số heo x Số ngày nuôi x 100 Tỷ lệ heo tiêu chảy/ lô (%) Heo có triệu chứng tiêu chảy của lô Heo của lô = 36 - Theo dõi hiệu giá kháng thể ngƣng kết lô heo này chỉ tiêm chất bổ trợ 2 lần. 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm Chọn 8 bầy heo con kh e mạnh, 14 – 20 ngày tuổi. Phân thành 3 l : Lô thứ nhất: 3 bầy. Lô thứ hai: 3