THỬ NGHIỆM NUÔI TRỨNG HEO IN VITRO

Nhân bản vô tính (cloning) đã ra đời từ khá lâu là một kỹ thuật không còn xa lạ với công nghệ y sinh học ngày nay

THỬ NGHIỆM NUÔI TRỨNG HEO IN VITRO Tóm tắt. Nhân bản vô tính (cloning) đã ra đời từ khá lâu là một kỹ thuật không còn xa lạ với công nghệ y sinh học ngày nay. Từ đó có rất nhiều phương pháp để nâng cao hiệu quả nhân bản nói chung và nhân bản heo nói riêng, trong đó có phương pháp IVM (in vitro maturation) là phương pháp dùng để nuôi chín trứng trong ống nghiệm với tỉ lệ chín trứng cao và đạt chất chất lượng trứng tốt. Ở đây tôi sử dụng TCM – 199: môi trường nuôi chín trứng, sử dụng môi trường thương mại do Nhật sản xuất, thành phần gồm các muối vô cơ cùng một số acid amin. Để nâng cao hiệu quả nuôi chín trứng, ở đề tài này tôi sử dụng đĩa 4 ngăn thay vì đĩa 4 giếng. Trong đĩa 4 giếng, mỗi vi giọt có thể tích 100µl, nuôi từ 10-15 trứng với tổng số trứng nuôi là 791, số trứng chín 422 chiếm 52,26±6,27(%). Trong đĩa 4 ngăn, mỗi vi giọt có thể tích 10µl, nuôi 1 trứng với tổng số trứng nuôi là 770, số trứng chín 447 chiếm tỉ lệ 58,40±5,50(%). Với tỉ lệ trứng chín này nếu có điều kiện tôi sẽ tiến hành bước tiếp theo tạo phôi heo. Từ khóa: TCM-199, pig cloning, IVM. 1. Mở đầu Heo là đối tượng thực hiện nhân bản vô tính có nhều tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn như tạo ra những đàn heo nhiều thịt, ít mỡ, chất lượng cao; với độ tương đồng về cơ quan rất cao so với người, heo là đối tượng lý tưởng cho việc cung cấp các cơ quan dị ghép cho người, thông qua việc biến đổi di truyền ( kết hợp với knock-out gen gây phản ứng thải loại trong dị ghép giúp tạo ra những cơ quan sẵn sang phục vụ cho quá trình dị ghép); hay tạo heo mang gen người sản xuất các protein người trong thịt hay sữa. Ngoài ra, còn giúp bảo tồn giống lợn ỉ quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng. Đây còn là tiền đề để tiếp tục phát triển kỹ thuật nhân bản ở các loài khác, cung cấp nguồn tế bào gốc đầy tiềm năng từ phôi nhân bản. Công đoạn đầu tiên của nhân bản heo là nuôi chín trứng heo trong ống nghiệm. Ngoài các yếu tố nhiệt độ, lưu lượng khí thì môi trường là thành phần quan trọng ảnh hưởng đến kết quả nuôi chín trứng. Trong luận văn này tôi sử dụng môi trường nuôi chín trứng là TCM-199. Môi trường phức tạp TCM-199 đệm bicarbonate hoặc HEPES và có bổ sung các loại huyết thanh khác nhau và/ hoặc gonadotropin và/hoặc hormone steroid là môi trường nuôi cấy mô được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nuôi trứng heo chín nhân tạo. Các tế bào sinh dưỡng 1 nang có mặt trong môi trường có thể ảnh hưởng đến khả năng của trứng. Ở đây, tôi khảo sát ảnh hưởng của đặc tính đĩa nuôi trong quá trình IVM, đó là sử dụng loại đĩa khác: đĩa 4 ngăn và thể tích giot nuôi cùng số trứng trong một cũng khác. Tỷ lệ trứng chín khi nuôi trên đĩa 4 giếng là 52,26 ± 6,27% cao hơn so với tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003) là 16% nhưng lại thấp hơn so với các tác giả Mariana Groke Marques và cs., (2006) là 65%; Kazuhiro và cs., (1999) là 68%. Kết quả xử lý thống kê cho thấy khi thực hiện IVM trong đĩa 4 ngăn ta thu được tỷ lệ trứng chín đạt được nhiều hơn và sự đạt được này có ý nghĩa thống kê. Do đó, tôi thực hiện IVM trong đĩa 4 ngăn để chuẩn bị nguồn trứng cho thao tác. Tham khảo các kết quả từ các tài liệu liên quan đến nuôi chín trứng cho nhân bản và kết quả thực nghiệm từ sinh viên Lâm Tuấn Anh cho thấy môi trường có bổ sung hormone (PMSG và hGC), kết hợp với chuyển trứng sau 20-22 giờ nuôi, cho tỷ lệ trứng chín cao (73,74 ± 6,24%), chín về nhân và tốt về hình thái của tế bào chất. Do đó, chúng tôi sử dụng kết hợp cách nuôi trong đĩa 4 ngăn, thay đổi thành phần trong môi trường nuôi ( bổ sung PMSG và hGC) cùng với việc chuyển trứng sau 20-22 giờ nuôi, để chuẩn bị nguồn trứng tốt cho chuyển nhân. 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng thí nghiệm Trong thí nghiệm này, đối tượng được sử dụng là buồng trứng heo, lấy từ công ty TNHH một thành viên Việt Nam Kỹ nghệ súc sản ( VISSAN). Địa chỉ 240 Nơ Trang Long, phường 13, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh. Hình 1: Buồng trứng heo 2.1.2. Dụng cụ 2 Hình 2: Một số hình ảnh dụng cụ: A. Dây truyền nước biển, B. Ống mao quản, C. Kim tiêm 18G, D. Syringe 5ml, E. Đĩa 4 ngăn Φ90, F. Đĩa 4 giếng, G. Đĩa petri nhựa Φ35 2.1.3.Hóa chất, môi trường Môi trường thu nhận và rửa trứng mDPBS Môi trường nuôi chín trứng (IVM): TCM-199 sử dụng môi trường thương mại do Nhật sản xuất, thành phần gồm các muối vô cơ cùng một số acid amin. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Thu nhận buồng trứng Buồng trứng được lấy từ lò mổ về, chứa trong dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh, giữ ấm ở nhiệt độ 37 – 38 o C. Rửa buồng trứng hai lần bằng nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh, trước khi đưa vào khu vực thao tác. Cần lưu ý là buồng trứng luôn được ủ trong bể ổn nhiệt ở 37 o C. 2.2.2. Phân loại trứng Những trứng sau khi thu được phân chia và sắp xếp sao cho hợp lí quan sát dưới kính hiển vi. Trứng được phân loại gián tiếp từ trước(Johnston et al., 1989). Miêu tả tóm tắt, trứng cấp 1: tốt nhất, trứng được bao quanh ít nhất 2 lớp tế bào cumulus, tối và tế bào chất đồng nhất. Trứng cấp 2: tạm được, lớp tế bào cumulus không hoàn chỉnh, tối nhạt và tế bào chất đều. Những trứng thu được rửa lại 2 lần trong m-DPBS, rửa tiếp 2 lần bằng môi trường nuôi. Sau đó chuyển vào đĩa môi trường nuôi IVM1 đã được chuẩn bị sẵn trước đó. Nuôi trong tủ ấm 38,5 o C, 5%CO2 trong 20 – 22 giờ, sau đó chuyển sang đĩa nuôi IVM2 không bổ sung 2 loại hormone hCG và PMSG tiếp tục nuôi trong 20 – 22 giờ ở 38,5 o C, 5% CO2. 3 Hình 3: Trứng được chọn để IVM 2.2.3. Nuôi chín trứng Chuẩn bị môi trường cho việc nuôi trứng: môi trường mDPBS để thu và rửa trứng và môi trường IVM. Khảo sát hai phương pháp nuôi trứng trong hai loại đĩa khác nhau. Đĩa 4 giếng: mỗi vi giọt có thể tích 100µl, nuôi từ 10 – 15 trứng. Đĩa 4 ngăn, Φ90: mỗi vi giọt có thể tích 10µl, nuôi một trứng trong một giọt. Môi trường được phủ dầu khoáng, ủ trong tủ ấm trước khi cho trứng vào nuôi tối thiểu 2 giờ. Thực hiện thu trứng trong tủ cấy vô trùng. Buồng trứng được chọn là những buồng trứng với các nang từ 3 – 7 mm, nang đồng đều, màu sắc hơi hồng, không chọn các buồng có nang quá nhỏ hay quá to, bị thâm đi. Buồng tứng được đặt trong đĩa Φ35 có sẵn một ít dung dịch mDPBS, dùng syringe 5ml và kim 18G hút các nang trứng. Sử dụng pipette Pastuer và pipette mouth để thu trứng. Pipette Pastuer cần được kéo đúng kích thước để đảm bảo không quá nhỏ làm mất các lớp cumulus bao quanh trứng, nhưng cũng không được quá to tránh hút nhiều môi trường khác vào môi trường nuôi. Chỉ các trứng có từ 3 lớp cumulus trở lên mới được chọn cho IVM. Những trứng thu được, được rửa lại 2 lần trong mDPBS, rửa tiếp hai lần bằng môi trường nuôi. Sau đó chuyển vào vi giọt trong đĩa môi trường nuôi đã được chuẩn bị từ trước. Chuyển trứng sau mỗi 20 – 22 giờ nuôi. Đánh giá, chọn lựa, xử lý trứng cho cloning sau 40-44 giờ nuôi. Hình 4: Trứng chín có xuất hiện thể cực 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thống kê được xử lý bằng hệ thống Student t-test. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả nuôi chín trứng trong hai loại đĩa khác nhau 4 Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ trưởng thành của trứng trong điều kiện in vitro, sử dụng cùng một loại môi trường nhưng dụng cụ nuôi khác nhau. Trong đĩa 4 giếng, mỗi vi giọt có thể tích 100µl, nuôi từ 10-15 trứng.Trong đĩa 4 ngăn, mỗi vi giọt có thể tích 10µl, nuôi 1 trứng. Kết quả thể hiện trong bảng 4.1, bảng 4.2 và biểu đồ 4.1 dưới đây: Bảng 4.1. Kết quả IVM sử dụng đĩa 4 giếng Lô thí nghiệm Số trứng nuôi (n) Số trứng có thể cực n % 1 98 47 47,96 2 31 13 41,94 3 100 50 50,00 4 76 45 59,21 5 81 42 51,85 6 89 51 57,30 7 78 43 55,13 8 48 21 43,75 9 88 49 55,68 10 102 61 59,80 Tổng 791 422 Trung bình (%) 52,26 ± 6,27 Bảng 4.2. Kết quả IVM sử dụng đĩa 4 ngăn Lô thí nghiệm Số trứng nuôi (n) Số trứng có thể cực n % 1 81 42 51,85 2 34 21 61,76 3 83 49 59,04 4 89 60 67,42 5 92 51 55,43 6 90 48 53,33 7 76 39 51,32 8 50 31 62,00 9 79 51 64,56 10 96 55 57,29 Tổng 770 447 Trung bình (%) 58,40 ± 5,50 Dựa theo kết quả trung bình vừa tính toán ở trên, ta có thể thấy phần trăm trứng chín ở các lô thí nghiệm nuôi chín trứng trong đĩa 4 ngăn (58,40 ± 5,50%) cao hơn đĩa 4 giếng (52,26 ± 6,27%). Bảng 4.3. So sánh thống kê giữa hai cách IVM trong 2 loại đĩa Phần trăm số trứng chín khi IVM trong đĩa 4 giếng Phần trăm số trứng chín khi IVM trong đĩa 4 ngăn 52,26 ± 6,27 58,40 ± 5,50 Dựa trên kết quả thống kê với độ tin cậy 95%, P < 0,05, do đó sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, phần trăm trứng chín khi IVM trong đĩa 4 ngăn cao hơn trong đĩa 4 giếng. 3.2. Biện luận Tỷ lệ trứng chín khi nuôi trên đĩa 4 giếng là 52,26 ± 6,27% cao hơn so với 5 tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003) là 16% nhưng lại thấp hơn so với các tác giả Mariana Groke Marques và cs., (2006) là 65%; Kazuhiro và cs., (1999) là 68%. Điều này là do một số nguyên nhân sau: Chất lượng mẫu không ổn định, heo đưa vào lò mổ không luôn ở trạng thái tốt, đồng đều như nhau. Môi trường TCM thương mại sử dụng từ lâu, chất lượng, nồng độ thành phần, áp suất thẩm thấu có thể thay đổi, cũng ảnh hưởng xấu đến sự trưởng thành của trứng. Nguồn đĩa tái sử dụng nhiều lần, ảnh hưởng đến sự phát triển của trứng. Tủ nuôi được sử dụng cho nhiều mục đích, số lượt mở ra nhiều, ảnh hưởng đến nồng độ CO 2 của tủ. 4. Kết luận Bằng phương pháp sử dụng dụng cụ IVM mới và môi trường cải tiến có thể nuôi chín trứng heo đạt tỷ lệ cao, với độ chín nhân và chín tế bào chất ( chu yếu dựa trên quan sát hình thái) cao,chuẩn bị tốt nguồn trứng nhận cho quy trình nhân bản. Lời cám ơn Tài liệu tổng hợp từ luận văn tốt nghiệp. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt 1. Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003). Thiết lập quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở heo và xác định giới tính phôi. Luận văn Thạc sĩ Đại học Khoa Học TỰ Nhiên, Tp Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Mộng Hùng (2004). Công nghệ tế bào phôi và động vật. NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. 3. Phan Kim Ngọc, Phạm VăN Phúc (2007). Công nghệ sinh học người và động vật. NXB Giáo dục. Tài liệu nước ngoài 6 4. Akira Onishi, Masaki Iwamoto, Tomiji Akita, Satoshi Mikawa, Kumiko Takeda, Takashi Awata (2000). Pig cloning by Microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science vol 289. 5. Andras Dinneys and Agnes Szmoleszky (2005). Animal cloning by nuclear transfer: state-of-the-art and future perspective. Acta Biochimica Polonica, Vol.52 No 3, 585-588. 6. A. Ruvinsky (1990). Basics of Gametic Imprinting. Journal of Animal Science.77:228-237. 7. Hiroshi Kanagawa, Itsuo Shimohira (1995). Manual of bovine embryo transfer. Japan Livestock Technology Association. 8. H. Schatten. Germ Cell Protocols, Volume 2: Molecular Embryo Analysis, Live Amaging, Transgenesis and Cloning. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 9. H. Tamada and N. Kykio (2004). Nuclear reprogramming in mammalian somatic cell nuclear cloning. Cytogenet Genome Res; 105 (2-4): 285-291. 10. Lisa M.Martin (2006). Thesis: Morphologic and histologic comparions between in vivo and nuclear transfer derived porcine embryo. 7