PHÁT HIỆN VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ********* KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ THUẬT PCR Họ tên sinh viên: LÊ THỊ CẨM TRINH Ngành: THÚ Y Niên khóa: 2004 – 2009 Tháng 09/2009 PHÁT HIỆN VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ THUẬT PCR Tác giả LÊ THỊ CẨM TRINH Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ ngành Thú Y Giáo viên hướng dẫn PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSTY BÙI THỊ THU TRANG Tháng 09/2009 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường Con xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuân – người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt cho thực hoàn thành đề tài tốt nghiệp Tơi cảm thấy thật may mắn giúp đỡ nhiệt tình quan tâm động viên chị Bùi Thị Thu Trang, với tất lòng thành em xin cảm ơn chị Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị viện Công nghệ sinh học Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc, bạn phòng Thực hành Kiểm nghiệm thú sản Môi trường sức khỏe vật ni giúp đỡ tơi hồn thành tốt đợt thực tập Cảm ơn kỉ niệm mà tơi có bạn lớp Thú Y 30 suốt năm năm học Cảm ơn bạn bè thân hữu phòng 211 thật nhiều, người chia sẻ vui buồn năm học thời gian thực tập tốt nghiệp Con khắc ghi công ơn Nội động viên giúp vượt qua khó khăn năm tháng xa nhà Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dưỡng dục nên người, để ngày hơm ii TĨM TẮT Sinh viên Lê Thị Cẩm Trinh, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 09/2009 “PHÁT HIỆN VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ THUẬT PCR” Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang Đề tài tiến hành nhằm phát vi khuẩn E coli O157:H7 Salmonella thực phẩm kỹ thuật PCR Phản ứng PCR thực với hai cặp primer FliC RfbE E coli O157:H7, Salmonella gồm hai cặp SUL SGX Hai vi khuẩn gây nhiễm thực nghiệm sản phẩm rau, thịt, xúc xích, sữa thịt hộp nồng độ 10 tế bào / 25 gam sản phẩm Sau đó, tiến hành tăng sinh mơi trường peptone đệm Sau 16 giờ, hút 500 µl dung dịch tăng sinh cho vào eppendorf 1,5 ml đem ly trích DNA phương pháp nhiệt, sau thực phản ứng PCR Kết ghi nhận sau:  10 mẫu rau 10 mẫu thịt thu thập từ siêu thị không phát E coli O157:H7 PCR Bằng phương pháp gây nhiễm thực nghiệm E coli O157:H7 nồng độ 10 tế bào / 25 gam sản phẩm, mPCR1 phát E coli O157:H7 trừ gây nhiễm tế bào sản phẩm thịt  m PCR2 phát Salmonella tất nồng độ gây nhiễm 10 / 25 gam sản phẩm rau, thịt, xúc xích, sữa thịt hộp  Nuôi cấy đồng thời hai loại vi khuẩn mơi trường peptone m - PCR phát Salmonella, E coli O157:H7 khơng có kết iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình sơ đồ ix Danh sách bảng x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli 2.1.1 Đặc điểm 2.1.2 Đặc tính ni cấy sinh hóa 2.1.3 Phân loại vi khuẩn Escherichia coli 2.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng EHEC 2.1.3.2 Cách sinh bệnh 2.1.3.3 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh EHEC iv 2.1.4 Giới thiệu E coli O157:H7 2.2 Vi khuẩn Salmonella 2.2.1 Lịch sử phân bố 2.2.2 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 2.2.2.1 Kháng nguyên 2.2.2.2 Độc tố 2.2.3 Đặc điểm hình thái, ni cấy, sinh hóa Salmonella 2.2.4 Dịch tễ 10 2.2.5 Cách sinh bệnh 11 2.2.6 Triệu chứng gây ngộ độc 12 2.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam giới Salmonella E coli 12 2.3.1 Tại Việt Nam 12 2.3.2 Trên giới 13 2.4 Kỹ thuật PCR 14 2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật 15 2.5.1 Phương pháp đếm trực tiếp 15 2.5.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc 15 2.5.3 Phương pháp màng lọc .18 2.5.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number) 19 2.5.5 Phương pháp đo độ đục 20 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 3.1 Thời gian địa điểm thực 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp tiến hành 21 3.3.1 Nguyên vật liệu dụng cụ thí nghiệm 21 3.3.2 Khảo sát diện E coli O157:H7 rau thịt tươi 21 3.3.3 Chuẩn bị dung dịch E coli O157:H7 Salmonella chuẩn .22 3.3.4 Đếm số lượng vi khuẩn E coli O157:H7 Salmonella 22 3.3.5 Gây nhiễm thực nghiệm E coli O157:H7 Salmonella 23 3.3.6 Phát E coli O157:H7 Salmonella kỹ thuật PCR 26 3.3.7 Xử lý số liệu .27 v Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết phát E coli O157:H7 rau thịt tươi .29 4.2 Kết phát E coli O157:H7 sau gây nhiễm thực nghiệm .29 4.2.1 Kết tăng sinh gốc E coli O157:H7 29 4.2.2 Kết đếm tế bào vi khuẩn E coli O157:H7 30 4.2.3 Kết gây nhiễm thực nghiệm E coli O157:H7 .30 4.2.4 Kết phát E coli O157:H7 gây nhiễm thực nghiệm PCR 32 4.3 Kết phát Salmonella sau gây nhiễm thực nghiệm PCR 34 4.3.1 Kết xây dựng quy trình PCR phát Salmonella .34 4.3.2 So sánh hiệu PCR phương pháp ly trích DNA 35 4.3.3 Kết đếm tế bào Salmonella để chuẩn bị gây nhiễm thực nghiệm .36 4.3.4 Kết phát Salmonella sau gây nhiễm thực nghiệm PCR 36 4.4 Kết xây dựng quy trình phát đồng thời E coli O157:H7 Salmonella PCR 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị .39 5.3 Tồn 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 46 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT pmol picomol µl microgram µM micromol/ lite ATCC American type Culture Collection A/E Attaching and effacing BHI Brain Heart Imfusion Broth BGA Brilliant Green Agar bp base pair CDC Center for Disease Control and Prevention CFU Colony forming unit CIDRAP Center for Infectious Disease Research & Policy DNA Deoxyribonucleotic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Eae Escherichia coli attaching and effacing EAEC Enteroaggregative Escherichia coli EHEC Enterohemorrhagic Escherichia coli EIEC Enteroinvasive Escherichia coli EMB Eosin Methylen Blue EPEC Enteropathogenic Escherichia coli FDA Food and Drug Administration FAO Food and Agriculture Organization FSIS USA Department of Agriculture’s Food Safety and Inspection Service HC Haemorrhagic colitis HUS Haemolytic uraemic syndrome IMViC Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simmon Citrate LT heat labile MAC MacConkey NA Nutrient agar NDDIC National Digestive Diseases Information Clearinghouse vii NIAID National Institute of Allergy and Infectious Diseases OD Optical density PCR Polymerase chain reaction STEC Shiga toxin – producing Escherichia coli Stx Shiga toxin SMAC Soritol MacConkey ST heat stable XLD Xylose – Lysine – Deoxy Cholate Agar TBE Tris Borate EDTA TSA Trypticase Soy Agar TSI Triple Sugar Iron Agar TBE Tris borate EDTA UV Ultra violet VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO World Health Organization viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 4.1: Kết điện di multiplex – PCR Salmonella (SUL, SGX) 33 Hình 4.2: Kết điện di mPCR1 để phát E coli O157:H7 35 Sơ đồ 3.1 Quy trình định lượng E coli phương pháp MPN 25 ix thực phẩm phải zero Do vậy, đề tài bỏ qua giai đoạn định lượng Salmonella rau, thịt, sữa, xúc xích, thịt hộp, đồng thời không định lượng sau gây nhiễm Đề tài tiến hành đếm số lượng tế bào gốc Salmonella chuẩn để ước lượng nồng độ cho việc gây nhiễm Bảng 4.8 Kết đếm tế bào vi khuẩn Salmonella (vsv/ml) Lần đếm 10-5 10-6 10-7 145 x 106 140 x 106 150 x 106 151 x 106 150 x 106 150 x 106 159 x 106 160 x 106 100 x 106 150 x 106 ± 10 x 106 133,3 x 106 ± 28,9 x 106 151,67 x 106 ± 7,02 x X ± SE 10 4.3.4 Kết phát Salmonella sau gây nhiễm thực nghiệm PCR Sau gây nhiễm thực nghiệm Salmonella rau, thịt, sữa, xúc xích thịt hộp, kết thu thể Bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết phát Salmonella sau gây nhiễm thực nghiệm PCR Sản phẩm Salmonella (tế bào / 25 gam sản phẩm) 10 Rau + + Thịt + + Sữa + + Xúc xích + + Thịt hộp + + Qua Bảng 4.9 cho thấy sản phẩm gây nhiễm thực nghiệm vào rau, thịt, sữa, xúc xích, thịt hộp cho kết mPCR2 dương tính tất nồng độ 1, 10 tế bào / 25 gam sản phẩm Theo Moganedi ctv (2007), PCR phát Salmonella giới hạn từ đến 10 tế bào / ml sau tiền tăng sinh Tương tự, Lin Tsen (1999) cho biết mức độ phát thấp PCR 10 CFU / g phân, sữa thực phẩm có qua bước tăng sinh khoảng -12 môi trường canh lactose - tetrathionate 37 Như vậy, hai tác giả cho biết phát Salmonella nồng độ cao so với nghiên cứu đề tài Hơn nữa, cơng trình họ thành công dựa việc sử dụng môi trường tăng sinh chuyên biệt cho Salmonella Rappaport Vassiliadis lactose - tetrathionate, hai loại môi trường tăng sinh tương đối đắt tiền Trong đó, đề tài sử dụng môi trường tăng sinh peptone, rẻ tiền hơn, hiệu quả, kinh tế Có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng mơi trường peptone để tăng sinh Salmonella Jeníková ctv (2000) Vi khuẩn Salmonella nguyên nhân gây bệnh thương hàn người động vật, gây ngộ độc thực phẩm người, lây nhiễm động vật người Vì thế, việc kiểm sốt nguồn nhiễm Salmonella thực phẩm, nước uống, môi trường,…là cần thiết, tiến hành chặt chẽ, nhằm ngăn ngừa nguy gây bệnh, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng Hiện nay, việc chẩn đoán vi khuẩn Salmonella theo phương pháp thường quy gặp khó khăn số lượng vi khuẩn Salmonella diện ít, khả mọc chúng môi trường thường yếu Thêm vào đó, Salmonella có 2500 kiểu huyết thanh, việc định danh chúng thường không dễ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Với kết PCR này, việc phát Salmonella thực phẩm khả thi độ xác cao, đồng thời tiến hành lúc với số lượng mẫu lớn có 24 cho việc tăng sinh PCR Và hầu hết phản ứng PCR thực thơng qua bước tiền tăng sinh – (Moganedi, 2007) Kết góp phần làm tăng khả tầm sốt, điều tra tình hình vấy nhiễm Salmonella mơi trường, đối tượng gia súc người, góp phần chẩn đốn kịp thời, để điều trị hiệu ca bệnh nghi ngờ Salmonella gây 4.4 Kết xây dựng quy trình phát đồng thời E coli O157:H7 Salmonella PCR Như đề cập, E coli O157:H7 Salmonella tác nhân gây bệnh thường gặp gia súc, gia cầm, dễ gây ngộ độc cho người (Hoàng Thị Thắng, Chi Cục phó Chi cục Thú y Hà Nội, 2003) Hai lồi vi khuẩn thường gây bệnh kết hợp nguy hiểm người (Mohle-Boetani ctv, 1998; www.wormsandgermsblog.com cập nhật ngày 27/03/2009) Vì thế, phát loài vi khuẩn phản ứng PCR điều ý nghĩa Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành kết 38 hợp mPCR1 mPCR2 thành phản ứng multiplex – PCR để lúc phát E coli O157:H7 Salmonella Tuy nhiên, kết phát Salmonella, E coli O157:H7 cho kết PCR âm tính Đây hạn chế đề tài Nếu có điều kiện, nên tiến hành thêm thí nghiệm để xây dựng thành cơng quy trình multiplex – PCR vừa phát Salmonella, vừa phát E coli O157:H7 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau trình gây nhiễm thực nghiệm E coli O157:H7 Salmonella loại sản phẩm rau, thịt, sữa, xúc xích, thịt hộp, ly trích DNA tiến hành PCR, kết luận sau: (1) Kiểm tra sản phẩm rau thịt siêu thị Co.op Mart chưa thấy có diện E coli O157:H7 (2) Gây nhiễm thực nghiệm E coli O157:H7 Salmonella nồng độ 10 tế bào cho kết tăng sinh lên gấp 104 107 ứng với nồng độ (3) mPCR1 phát E coli O157:H7 dương tính tất nồng độ gây nhiễm (1 10 tế bào / 25 gam sản phẩm rau, thịt, sữa, xúc xích, thịt hộp) sau 16 tăng sinh môi trường peptone, ngoại trừ nồng độ tế bào / 25 gam thịt cho kết âm tính (4) mPCR2 phát Salmonella dương tính tất nồng độ gây nhiễm (1 10 tế bào / 25 gam sản phẩm rau, thịt, sữa, xúc xích, thịt hộp) sau 16 tăng sinh môi trường peptone (5) Khi nuôi cấy chung E coli O157:H7 Salmonella peptone đệm Kết m - PCR phát Salmonella 5.2 Đề nghị Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán phát vi khuẩn Salmonella E coli O157:H7 thông qua bước tăng sinh riêng lồi mơi trường peptone 5.3 Tồn Chưa thiết lập m – PCR để phát lúc E coli Salmonella mẫu gây nhiễm thực nghiệm 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Văn Thiên Bảo, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Salmonella phân thịt bò, heo, gà thành phố Hồ Chí Minh số tỉnh phía nam Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP HCM Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục thành phố Hồ Chí Minh Huỳnh Văn Điểm, 2005 Phân lập định danh vi khuẩn Salmonella phân, thịt bò heo số tỉnh miền Tây Nam Bộ Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP HCM Nguyễn Ngọc Hải, 2005 Giáo trình Thực hành vi sinh Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nông Nghiệp Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gen độc lực Escherichia coli phân lập từ phân thịt bò, heo kĩ thuật multiplex – PCR Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Dương Thanh Liêm, 2004 Bài giảng độc chất học Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Tơ Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP HCM 10 Ngơ Văn Bắc Trương Quang, 2008 Khảo sát tình trạng ô nhiễm vi khuẩn thịt lợn sữa, lợn choai xuất số sở giết mổ địa bàn Hải Phòng Tạp chí Khoa học phát triển, tập VI, số 1, trang 21-25 11 Trần Linh Thước, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo Dục 12 Nguyễn Ngọc Tuân, 2002 Vệ sinh thịt NXB Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh TIẾNG NƯỚC NGỒI 41 13 An V T T., Duijkeren E V., Fluit Ad C., Wannet W J B Verbruggen A J., Maas H M E, Gaastra W., 2006 Antibiotic resistance, integrons and Salmonella genomic island among non – typhoidal Salmonella serovars in the Nertherlands International Journal of Antimicrobial Agents 28: 172 – 179 14 An V T T., 2007 Antibiotic resistance in Salmonella Thesis phD Utrecht University, the Netherlands 15 Anderson G G et al., 2003 Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections Science 301: 105–107 16 Arimi, S.M., Koroti, E., Kang'ethe, E.K., Omore, A.O., McDermott, J.J., Macharia, J.K., Nduhiu, J.G and Githua, A.M., 2000 Risk of infection from E coli O157:H7 through informally marketted raw milk in Kenya Paper rd prepared for Oral Presentation at the All Africa Conference on Animal Agriculture – November 2000 17 Avery S M, Liebana E., Reid C A., Woodward M J and Buncic S., 2002 Combine use of two genetic fingerprinting methods, Pulsed – field gel electrophoresis and ribotyping, for characterization of Escherichia coli O157 Isolates from food animal, retail meat, and cases of human disease Journal of Clinical Microbiology 40(8): 2806 – 2812 18 Benjamin, M.M and Datta, A.R., 1995 Acid tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli Appl Environ Microbiol 61: 1669–1672 19 Beutin, L., Montenegro M A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S., and Stephan R.,1989 Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli J Clin Microbiol 27:2559–2564 20 Boyce, T.G., Swerdlow, D.L., and Griffin, P.M 1995 Escherichia coli O157:H7 and the hemolytic uremic syndrome N Engl J Med 333: 364– 368 21 Brian, M J., Frosolono M., Murray B E., Miranda A., Lopez E L., Gomez H F., and Cleary T G., 1992 Polymerase chain reaction for diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli infection and hemolytic-uremic syndrome J Clin Microbiol 30:1801–1806 22 Buchanan, R.L and Edelson, S.G., 1996 Culturing enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple means of evaluating the acid tolerance of stationary-phase cells Appl Environ Microbiol 62: 4009–4013 42 23 Buchanan R L and Doyle M P., 1997 Foodborne Disease Significance of Escherichia coli O157:H7 and Other Enterohemorrhagic E coli The Society for Food Science and Technology 51(10): 69 – 76 24 Buzby J.C., Roberts J.A., Roberts T., And Upton P.A., 2000 Foodborne Escherichia O157:H7 Disease Costs in the United States and Scotland 25 Cebula, T A., W L Payne, and P Feng 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR J Clin Microbiol 33:248–250 26 Cegelski L., Marshall G R., Eldridge G R & Hultgren S J., 2008 The biology and future prospects of antivirulence therapies Nature Reviews Microbiology 6: 17 – 27 27 Chiu C H and Jonathan T Ou, 1996 Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virullence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture – multiplex PCR combination assay Journal of Clinical Microbiology 34(10): 2619 – 2622 28 Cooley M., Carychao D., Crawford-Miksza L., Jay M T., Myers C., Rose C., Keys C., Farrar J., Mandrell R E., 2007 Incidence and Tracking of Escherichia coli O157:H7 in a Major Produce Production Region in California www.scivee.tv 29 Giannella R A., 1996 Medical Microbiology Edited by Samuel Baron 30 Griffin P M., 1995 Escherichia coli O157:H7 and other enterohemorrhagic Escherichia coli In infections of the gastrointestinal tract Eds New York NY: Raven Press: 739 – 761 31 Hennessy T W., Hedberg C W, Slutsker L., White K E, Besser – Wiek J M., Moen M E., Feldman J., Coleman W W., Edmonson L M., MacDonald K L., Osterholm M T., 1996 A National Outbreak of Salmonella enteritidis Infections from Ice Cream The New England Journal of Medicine 334(20): 1281 – 1286 32 Jay J M., 2000 Modern food microbiology An aspen publisher, Maryland P 531 – 543 33 Jeníková G., Pazlarová J., Demnerová K., 2000 Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay Internatl Microbiol 3: 225–229 43 34 Karmali, M A., Steele B T., Petric M., and Lim C., 1983 Sporadic cases of hemolytic uremic syndrome associated with fecal cytotoxin and cytotoxinproducing Escherichia coli Lancet 1:619–620 35 Liebisch B and Schwarz S., 1996 Molecular typing of Salmonella enterica subsp Enterica serovar enteritidis isolates J Med Microbiol., 44(1996): 52 – 59 36 Lin J S and Tsen H Y, 1999 Development and use of polymerase chain reaction for the Specific detection of Salmonella typhimurium in stool and food sample Journal of food protection 62(10): 1103 – 1110 37 Malorny, B., Hoorfar J., Bunge C and Helmuth R., 2003 Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard Appl Environ Microbiol., 69: 290 – 296 38 Moganedi, Goyvaerts, Venter and Sibara, 2007 Optimisation of the PCR – InvA primers for the detection of Salmonella in drinking and surface waters following a pre – cultivation step Water SA 33(2): 195 – 201 39 Mohle-Boetani, MD, MPH; Jeff A Farrar, DVM, PhD; Werner S B., MD, MPH; Minassian D., MPH; Bryant R., Abbott S., Slutsker L., MD, MPH, Vugia D J., MD, MPH, for the Investigation Team, 2001 Escherichia coli O157 and Salmonella Infections Associated with Sprouts in California, 1996–1998, 135 (4): 239-247 40 Morin N J., Gong Z., and Li X F., 2004 Reverse Transcription-Multiplex PCR Assay for Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae O1, and Salmonella Typhi Clinical Chemistry 50: 2037-2044 41 Nataro J P and Kaper J B., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli J Clin Microbiol Rev 11(1): 142 - 201 42 Neill, M.A., Tarr, P.I., Taylor, D.N., and Trofa, A.F 1994 Escherichia coli In “Foodborne Disease Handbook, Diseases by Bacteria,” Vol 1, ed Y.H Hui, J.R Gorham, K.D Murrell, and D.O Cliver: 169–213 43 Pan T M and Liu Y J., 2002 Identification of Salmonella isolates by polymerase chain reaction and multiplex polymerase chain reaction J Microbiol Immunol Infect 35: 147 – 151 44 Paton J C and Paton A W., 1998 Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin – Producing Escherichia coli Infections Clinical Microbiology Reviews 11(3): 450 – 479 44 45 Rowbury, R.J 1995 An assessment of environmental factors influencing acid tolerance and sensitivity in Escherichia coli, Salmonella spp and other enterobacteria Lett Appl Microbiol 20: 333–337 46 Riley, L.W., Remis, R.S., Helgerson, S.D., McGee, H.B.,Wells, J.G., Davis, B.R., Hebert, R.J., Olcott, H.M., Johnson, L.M., Hargrett, N.T., Blake, P.A., and Cohen, M.L., 1983 Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype N Engl J Med 308: 681– 685 47 Rusul G., Khair J., Radu S., Cheah C T., Yassin R M., 1996 Prevalence of Salmonella in broiler at retail outlets, processing plants and farms in Malaysia Int J Food Microbiol 33: 183 – 194 48 Smith H R., and Scotland S M., 1998 Verocytotoxin producing strains of Escherichia coli J Med Microbiol 26: 77 – 85 49 Watanabe Y., Ozasa K., Mermin J H., Griffin P M., Masuda K., Imashuku S and Sawada T., 1999 Factory outbreak of Escherichia coli O157:H7 infection in Japan Emerging Infectious Diseases 5: 424-428 Internet 50 www.wormsandgermsblog.com 51 http://tim.vietbao.vn/E.coli/ 52 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Nhieu-loai-thuc-pham-o-cho-khong-antoan/62223289/248/ 53 http://www.vnchannel.net/news/suc-khoe/200804/la-mo-rau-ngo-o-vikhuan.69303.html 54 http://www.tienphong.vn/Tianyon/PrintView.aspx?ArticleID=163334&Channel ID=9 55 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suckhoe/20594_San_phu_de_tu_vo ng_do_nhiem_E_coli.aspx 56 http://www.chicucthuyhcm.org.vn/Download/ecoli.doc 57 http://www.pasteur-hcm.org.vn/ng_cuu/nckh.htm 58 http://vietnamfood.com.vn/news_list.asp?ncatID=CAT031225152400F&nsubc atID=SCA031225153753C&newsID=21&menuID=4 59 http://vfa.gov.vn/topic.asp?ID=41 45 60 http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch021.htm 61 http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5614a4.htm 46 PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ BGA (Brilliant Green Agar) Lab lemco powder 5g Pepton 10 g Yeast extract 3g Disodium hydrogen phosphate 0,6 g Sodium hydrogen phosphate 0,6 g Lactose BHI (Brain Heart Imfusion Broth) Calf brain, infusion from 200 g Beef heart, infusion from 250 g Proteose peptone 10 g Sodium chloride 5g Dipotassium phosphate 2,5 g Dextrose 2g Nước cất 1000 ml pH = 7,4 MR – VP Peptone 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất vừa đủ 800 ml pH = 6,9 ±0,2 47 NA Peptone 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 15 g pH = 7,4 ± 0,2 (25oC) Nước peptone đệm Peptone 10 g Sodium chloride 5g Disodium hydrogen phosphate 9g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = SIMMON CITRATE Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml 48 XLD (Xylose – Lysine – Deoxy Cholate Agar) Yeast extract 3g L – lysine HCl 5g Xylose 3,75 g Lactose 7,5 g Sucrose 7,5 g Sodium desoxycholate 1g Sodium chloride 5g Sodium thiosulfate 6,8 g Ferric ammonium citrate 0,8 g Phenol red 0,08 g Agar 12,5 g pH = 7,4 ± 0,2 TSA Trypticase peptone 15 g Phytone peptone 5g NaCl 5g Agar 15 g Nước cất 1000 ml TSI (Triple Sugar Iron Agar) Lab lemco powder 3g Yeast extract 3g Peptone 20 g Sodium chloride 5g Lactose 10 g Sucrose 10 g Glucose 1g Ferric citrate 0,3 g 49 Phenol red 9,8 g Agar 12 g pH = 7,4 ± 0,2 Thuốc thử MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha naphtho l5g Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml HÓA CHẤT ĐIỆN DI TBE (0,5 X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 g Na2EDTA 93,06 g Nước cất vừa đủ pH = 8,3 Agarose (1,5%) Loading dye Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% 50 TE 1X vừa đủ 100% HÓA CHẤT NHUỘM GEL TBE 1X Ethidum bromide 10 mg/ ml 51 ... Proskauer, Simmon Citrate LT heat labile MAC MacConkey NA Nutrient agar NDDIC National Digestive Diseases Information Clearinghouse vii NIAID National Institute of Allergy and Infectious Diseases OD... MacConkey ST heat stable XLD Xylose – Lysine – Deoxy Cholate Agar TBE Tris Borate EDTA TSA Trypticase Soy Agar TSI Triple Sugar Iron Agar TBE Tris borate EDTA UV Ultra violet VT Verotoxin VTEC... forming unit CIDRAP Center for Infectious Disease Research & Policy DNA Deoxyribonucleotic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Eae Escherichia coli attaching and effacing EAEC Enteroaggregative