KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CÁC NHÓM CHẤT CHỐNG OXY HÓA TRONG DÂY VÁC (CAYRATIA TRIFOLIA (L.))

Để bảo vệ sự tác động của các gốc tự do, cơ thể sẽ sản sinh ra chất chống oxy hóa như các hợp chất polyphenol, flavonoid, hợp chất caroten, vitamin C, vitamin E, giúp cơ thể chống lại sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Năm học 2016-2017

Đề tài: “KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CÁC NHÓM CHẤT

CHỐNG OXY HÓA TRONG DÂY VÁC (CAYRATIA TRIFOLIA

(L.))”

LỜI CAM ĐOAN

Lê Minh Đông

Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Hóa Học

Đã bảo vệ và được duyệt Hiệu trưởng:………

Trưởng Khoa:………

Trưởng Chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

TS Phan Thị Bích Trâm

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học - -

Cần Thơ, ngày…tháng….năm 2017 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 Cán bộ hướng dẫn: TS Phan Thị Bích Trâm 2 Tên đề bài: “Khảo sát hàm lượng các nhóm chất chống oxy hóa trong dây vác (Cayratia Trifolia (L.))” 3 Sinh viên thực hiện: Lê Minh Đông MSSV: B1304035 Lớp Cử nhân Hóa học 4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệp:

b) Nhận xét nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

* Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d) Đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

TS Phan Thị Bích Trâm

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng hòa Xã hội chủ nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học - -

Cần Thơ, ngày…tháng….năm 2017 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 Cán bộ hướng dẫn: TS Phan Thị Bích Trâm 2 Tên đề bài: “Khảo sát hàm lượng các nhóm chất chống oxy hóa trong dây vác (cayratia trifolia (l.))” 3 Sinh viên thực hiện: Lê Minh Đông MSSV: 1304035 Lớp Cử nhân Hóa học 4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệp:

b) Nhận xét nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

* Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d) Đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2017 Cán bộ phản biện -

LỜI CAM ĐOAN



Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung bài luận văn được tham khảo nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả thực nghiệm mà tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm thực nghiệm Tôi xin cam đoan về sự tồn tại và tính trung thực khi sử dụng những dữ liệu và số liệu này

Lê Minh Đông

LỜI CẢM ƠN



Để đạt kết quả như ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô

thuộc bộ môn Hóa Học–Khoa Khoa học Tự nhiên–Trường Đại học Cần Thơ,

những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu mà thầy cô truyền đạt đã

giúp em rất nhiều trong quá trình học tập

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phan Thị Bích Trâm,

người đã truyền đạt những kiến thức chuyên ngành quý giá, theo dõi và hướng

dẫn, giúp em hiểu rõ về công việc mà mình đang làm

Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Hoàng Sơn đã tạo điều kiện tốt nhất

cho em làm việc tại phòng thí nghiệm

Cảm ơn các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Hóa đã tận tình giúp đỡ,

chia sẻ cũng như động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ vẫn luôn quan tâm, động viên và là

chỗ dựa cả về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, tháng 3 năm 2017

Lê Minh Đông

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát các điều kiện chiết tách ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất chống oxy hóa trong dây vác Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng dung môi acetone : H2O với tỉ lệ 7:3 với 3 lần chiết, ở nhiệt độ 400C trong thời gian 4 giờ đạt hàm lượng phenolic tổng số cao nhất 17,92 mg GEA/g, flavonoid tổng số 8,32 mgQE/g và khả năng loại gốc tự do đạt 88,52% Giá trị IC50 qua thử nghiệm DPPH đạt thấp nhất là 367 µg/ml và khả năng khử sắt là 2,79 mg/ml

Kết quả đề tài có thể làm cơ sở nghiên cứu về hoạt tính các chất chống oxy hóa khác trong Dây vác cũng như so sánh với các nguyên liệu chứa chất chống oxy hóa khác trong tự nhiên

Từ khoá: Dây vác, phenolic tổng số, flavonoid tổng số, gốc tự do

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the effects of extraction conditions such as solvent, temperature and extraction time on the antioxidant activity of Cayratia Trifolia Results of study showed that total phenolic content, total flavonoid content and free radical scaveging ability by DPPH were the most effectiveness when using the rate of acetone : H2O was 7:3 with three cycles of extraction, temperature at 40 0C for 4 extraction hours Total phenolic content of about 17.92 mg GEA/g , total flavonoid content of about 8.32 mg QE/g, free radical scaveging ability of 88.52 % by DPPH assay The

IC50 value of free radical scaveging ability by DPPH assay reach the lowest at

367 µg/ml and these of Iron removal capacity was 2.79 mg/ml

The results of study can be used as a basis for further research in other

antioxidant capacity of Cayratia Trifolia with the purpose of comparison to

other rich antioxidant materials in nature

Keywords: Cayratia Trifolia, total phenolic content, total flavonoid

content, radical scavenging activity

MỤC LỤC

TÓM TẮT vi

MỤC LỤC viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

Quercetin equivalent xii

CHƯƠNG 1: PHẦN MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặc vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về dây vác [4] 3

2.1.1 Phân loại khoa học 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Mô tả 3

2.1.4 Thành phần hóa học và công dụng dược liệu 4

2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 5

2.3 Sự oxy hóa và sự chống oxy hóa 6

2.3.1 Gốc tự do[8] 6

2.3.2 Chất chống oxy hóa 9

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm làm luận văn 15

3.2 Nguyên liệu nghiên cứu 15

3.3 Phương tiện nghiên cứu 15

3.4 Phương pháp thí nghiệm 15

3.5 Phương pháp nghiên cứu 15

3.5.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 15

3.5.2 Xác định độ ẩm [25] 16

3.5.3 Xây dựng đường chuẩn 16

3.5.4 Khảo sát hàm lượng và hoạt tính các hợp chất chống oxy hóa trong dây vác 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Độ ẩm nguyên liệu 23

4.2 Kết quả của các đường chuẩn phân tích 23

4.2.1 Đường chuẩn acid gallic 23

4.2.2 Đường chuẩn quercetin 24

4.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng ly tích hàm lượng

TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa trên dây vác ba lá 24

4.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ đến khả năng chiết tách TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa 24

4.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết tách đến hàm lượng TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa 30

4.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến khả năng chiết tách TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa 31

4.3.4 Kết quả khảo sát loại gốc tự do DPPH 36

4.3.5 Kết quả khảo sát khả năng khử sắt 37

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC: Số liệu và kết quả phân tích thống kê 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Dây Vác 3

Hình 2 2: Phản ứng của Glutahione 10

Hình 2 3 Một số cấu trúc của hợp chất phenol 11

Hình 2 4 Các vùng cấu trúc thể hiện khả năng chống oxy hóa của polyphenol[18] 12

Hình 2 5 Cấu trúc cơ bản của flavonoid 12

Hình 2 6 Cấu trúc của một số loại flavonoid 13

Hình 2 7 Công thức cấu tạo của vitamin C 14

Hình 3 1 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 21

Hình 4 1 Đường chuẩn acid gallic để xác định TPC 23

Hình 4 2 Đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng TFC 24

Hình 4 3 Biểu diễn hàm lượng TPC theo nồng độ của từng dung môi chiết 25 Hình 4 4 Biểu diễn hàm lượng TFC theo nồng độ của từng dung môi chiết 27 Hình 4 5 Biểu diễn khả năng loại gốc tự do DPPH (%) theo nồng độ của từng dung môi chiết 29

Hình 4 6 Biểu diễn hàm lượng TPC theo nhiệt độ ứng với các thời gian chiết khác nhau 31

Hình 4 7 Biểu diễn hàm lượng TFC theo nhiệt độ ứng với các thời gian chiết khác nhau 33

Hình 4 8 Biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến khả năng loại gốc tự do DPPH (%) 34

Hình 4 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng TPC, TFC và khả năng loại gốc tự do DPPH 35

Hình 4 10 Biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ với khả năng loại gốc tự do của mẫu thử 36

Hình 4 11 Biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ với khả năng loại gốc tự do của acid ascorbic 37

Hình 4 12 Tương quan giữa TPC với khả năng loại gốc tự do của mẫu 37

Hình 4 13 Biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ với độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng 700 nm 38

Hình 4 14 Biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ acid ascorbic với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm 38

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Một số gốc tự do và ý nghĩa hoạt động của chúng[9] 6

Bảng 3 1 Xây dựng đường chuẩn acid gallic 17

Bảng 3 2 Xây dựng đường chuẩn quercetin 18

Bảng 4 1 Kết quả độ ẩm 23

Bảng 4 2 Kết quả ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa 30

Bảng 4 3: Kết quả thống kê anova 2 nhân tố đối với chỉ tiêu TPC 32

Bảng 4 4 Kết quả thống kê anova 2 nhân tố đối với chỉ tiêu TFC 33

Bảng 4 5 Kết quả thống kê anova 2 nhân tố đối với chỉ tiêu khả năng loại gốc tự do DPPH 35

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrozy

DNA Deoxyribonucleic acid

GAE Gallic acid equivalent

HSD Honest Significant differences

TFC Total flavonoid content: hàm lượng flavonoid tổng số TPC Total phenolic content: hàm lượng phenolic tổng số

UV-VIS Máy quang phổ

CHƯƠNG 1: PHẦN MỞ ĐẦU

1.1 Đặc vấn đề

“Stress oxy hóa” là kết quả của việc hình thành các gốc tự do vượt quá mức kiểm soát của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Điều này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ để trung hòa các gốc tự

do (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009)[1] Vì thế các gốc tự do sẽ tấn công các phân tử lipid, protein, acid nucleci của các tế bào bình thường dẫn đến tổn thương cục bộ và cuối cùng là gây ra sự hoạt động bất bình thường của các cơ quan trong cơ thể Stress oxy hóa dẫn đến hậu quả là phát sinh ra nhiều bệnh như Parkinson (Tappel, 1968), Alzheimer (Behl, 1997), suy giảm miễn dịch và các bệnh khác trong đó có bệnh ung thư, bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh và lão hóa sớm[2] Để bảo vệ sự tác động của các gốc tự do, cơ thể sẽ sản sinh ra chất chống oxy hóa như các hợp chất polyphenol, flavonoid, hợp chất caroten, vitamin C, vitamin E, giúp cơ thể chống lại sự Stress oxy hóa làm chậm hoặc ngăn cản các gốc tự do tấn công các tế bào của cơ thể Tuy nhiên, khi số lượng gốc tự do quá nhiều và cơ thể sản sinh chất chống oxy hóa không đủ để đáp ứng nhu cầu thì việc bổ sung các nhóm chất chống oxy hóa

có nguồn gốc tự nhiên từ bên ngoài là điều cần thiết để giúp cơ thể điều chỉnh lại sự cân bằng

Dây vác (Cayratia trifolia (L.) Domin) là loại thực vật dây leo thân gỗ có

nguồn gốc từ bản địa của Úc và châu Á Dây vác có thành phần hóa học giàu các chất chống oxy hóa như polyphenol, flavonoids (như cyanidin, delpyridin)

và vitamin E[3] Ở Việt Nam dây vác chủ yếu được sử dụng làm thực phẩm để phục vụ cho đời sống như dùng trái vác làm canh chua, kho cá và dùng trái vác chín để ngâm rượu Ngoài ra dây vác được dùng như là một nguồn dược liệu tự nhiên để điều trị các bệnh như trong đông y rễ dây vác có vị cay, tính mát, vì thế chúng có tác dụng để thanh nhiệt giải độc trong cơ thể, làm săn da, trị các đòn tổn thương do ngã, nhọt phổi, ghẻ lở, lá và quả dây vác được nấu

để lấy nước tắm trị rôm sảy, trị gẫy xương[4] Với Dây vác có nhiều cộng dụng thiết thực trong đời sống như vậy và có thành phần hóa học giàu các chất chống oxy hóa thì dây vác có thể là một nguồn dược liệu tự nhiên tốt trong tương lai để phòng trị các bệnh liên quan đến gốc tự do Vì vậy nên cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người trong dây vác

Do đó trong phạm vi luận văn tốt nghiệp, đề tài sẽ nghiên cứu “khảo sát

hàm lượng các nhóm chất chống oxy hóa trong dây vác (Cayratia trifolia (L.)

Domin)’’

1.2 Mục tiêu đề tài

Trong khuôn khổ đề tài luận văn tốt nghiệp đại học, mục tiêu chính của

đề tài: Ly trích và khảo sát hàm lượng các nhóm chất chống oxy hóa trên dây

vác (Cayratia trifolia (L.) Domin)

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về dây vác [4]

2.1.1 Phân loại khoa học

Dây vác còn được gọi là dây sạt có tên khoa học là carytia trifolia (L.)

Domino

Thuộc họ nho (Vitaceae)

Loài (Cayratia trifolia)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Loại dây vác (cayrtia) bao

gồm khoảng 45 loại thực vật, một

số trong đó có giá trị cho con

người Dây vác được tìm thấy ở

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

của châu Á, châu phi, Australia và

các đảo của Thái Bình Dương

Loài Dây vác (Cayratia

trifolia) là một dây leo thân gỗ ở

châu Á và ở Úc Đây là loài dây

leo mọc hoang dại trong tảng cỏ

và rừng thưa thuộc các nước châu Á như: Việt Nam, Lào, Thái Lan, Myanma, Indonesia, Malaysia, Philippines, Australia, Campuchia và Trung Quốc

Ở Việt Nam dây vác mọc hoang dại trong các quần thể thứ sinh và dọc các rào, bụi, từ các tỉnh Lào Cai, Hải Phòng qua các tỉnh miền Trung cho tới

An Giang, Kiên Giang

Gân lá hình lông chim, 6-8 cặp gân phụ, gân lá ở 2 mặt đều có lông dài màu đỏ

Hình 2 1 Dây Vác

Cuống lá chính hình trụ dài 5-6 cm, mặt trên có 1 rãnh nông; cuống lá chét mặt trên có 1 gân lồi ở giữa và 2 rãnh ở 2 bên, mặt dưới lồi tròn, dài 0,7-1,6 cm Cuống lá chính và cuống lá chét màu nâu đỏ hay màu xanh phớt đỏ,

có nhiều gân dọc và nhiều lông dài màu đỏ Lá kép rời, hình tam giác, màu nâu đỏ, cao 0,35 cm, rộng 2 cm, có nhiều lông dài màu đỏ, rụng sớm

Quả mọng, hình cầu dẹt, có màu tím đen khi chín, quả non màu xanh và đỉnh có gai nhọn màu nâu đỏ (vết tích vòi và đầu nhụy), chứa 1-4 hạt

Hạt có tiết diện đa giác, một mặt hình tim, 2 mặt còn lại phảng, màu xanh

2.1.4 Thành phần hóa học và công dụng dược liệu

Thành phần hóa học

Lá dây vác có chứa các nhóm steroid, tanin, flavonoide và acid béo Ngoài ra lá còn chứa nhóm stilbene như: piceide, resveratrol, viniferine và ampelopsine

Thân dây vác được ghi nhận có chứa các chất acid cyanhydrique, delphinidine và nhóm flavonoid (như cyaniding, delpyridin), acid hydrocyanic Ngoài ra trong thân, lá và rễ cũng có vitamin E

Hạt và trái của dây vác có chứa các hợp chất cyanogene, oxalate calcium

Công dụng và dươc liệu [4]

Theo đông y rễ dây vác có vị cay, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, làm săn da

Thân dây vác có khả năng giúp lọc máu, có tác dụng như thuốc tống hơi

và lon đờm

Lá dây vác có tác dụng làm đỏ da trương nở mạch máu, được sử dụng để cầm máu và vỏ dây vác cũng có tác dụng làm giảm đau nhức cơ

Tại Ấn độ, những rễ Dây vác được nghiền nhuyễn với tiêu đen và được

áp dụng như một thuốc dán đắp trên những mụn nhọt, cũng được sử dụng như một thuốc bổ kích thích trong tình trạng suy nhược cơ thể Ngoài ra dây vác còn được sử dụng cho những bệnh đau mắt (viêm giác mạc, đục thủy tinh thể

và triệu trứng quáng gà) Ngâm trong nước đun sôi của những hạt cũng được

sử dụng cho điều trị bệnh tiểu đường

Ở Philippine thường sử dung nước nấu sắc của lá hoặc nước ép của lá tươi được sử dụng để chữa lành bệnh hoại huyết

Ở Thái Lan và trong bán đảo Malaisia dây vác được dùng để giảm viêm

và hạ sốt cao Trong khi ở Moluque thường dùng lá non để ăn như rau cải

Một số bài thuốc dân gian [5]

Ở Việt Nam có nhiều loại dây vác được dùng như nhau Bộ phận thường dùng là toàn bộ dây và được sử dụng cùng với các dược liệu khác để điều trị các bệnh sau:

Nhiễm trùng: dây vác 30g, hoa kim ngân (hoặc dây lá)10g, hạt bí đau 20g Nấu sắc uống

Thuốc hạ nhiệt, ra mồ hôi: dây vác 30g, lá điều lộn hột 20g, lá chanh 20g, lá húng cây 20g Nấu sắc uống

Viêm thận, phù thận: dây vác 30g, cam thảo đất 30g, lá sa kê 30g, rau dừa nước 20g, lá mã đề 20g, nấu sắc uống

Tê thấp, đau nhức xương: dây vác 150g, rễ nhàu 150g, tô mộc 50g, rượu

1 lít Mỗi lần uống 30ml, mỗi ngày uống 2 lần

2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Xuất phát từ công dụng thực tế của dây vác rất phong phú trong đời sống,

từ đó nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân tích, khảo sát các thành phần mang tính sinh học tạo nên tác dụng dược lý của dây vác trong các ứng dụng của chúng

Ở Thái Lan các nghiên cứu về hoạt tính sinh học đã được thực hiện trên các chồi non của dây vác Chúng được trích ly với các dung môi khác nhau, sau đó được thử hoạt tính chống oxy hóa bằng cách nhặt các gốc tự do, và thử hoạt tính kháng khuẩn bằng cách sử dụng phương pháp khuếch tán thạch sau

đó đo đường kính vòng vô khuẩn đối với Echerichia coli, Staphylococcus

aureus, Candida albican và Aspergillus niger Tuy nhiên kết quả cho ra âm

tính khi thử hoạt tính kháng khuẩn[6]

Ở mức độ chuyên sâu hơn các nghiên cứu được tiến hành để khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính mạnh của các nhóm chất chống oxy hóa trong dây vác Trong số các nghiên cứu đó có liên quan đến các kỹ thuật phân tích hiện đại như trên tạp chí Journal of Applied Pharmaceutical Science có đăng bài về xác định một số hợp chất có trong dây vác bằng phương pháp GC-MS Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy trong dây vác có chứa các thành phần như các hợp chất cyclopentadecane, tetramethylheptadecan-4-olide, oxirane và vitamin

E[7]

Ngoài ra còn có một số nghiên cứu liên quan đến hoạt động chống oxy hóa như xác định tổng phenolic, flavonoid, alkaloid, tannin và saponin do Gopalakrishnan và cộng sự (2014) thực hiện Kết quả tổng quan cho thấy dây vác là loại nguyên liêu có hoạt tính chống oxy hóa khá tốt, chính vì vậy cần

thúc đẩy sự nghiên cứu chuyên sâu về khả năng dược lý của dây vác một cách lâu dài

Tại Ấn Độ liên kết với đại học Jai Narain Vyas đã tiến hành nghiên cứu

trên dây vác về lĩnh vực bệnh đái tháo đường trên chuột (Swamkar et al 2008)

và kết quả cho thấy khi so sánh với kiểm soát và thay đổi thuận lợi trong các thông số sinh hóa cũng được quan sát và có thể kết luận từ nghiên cứu rằng các chiết xuất etyl axetat của rễ dây vác có tác dụng bệnh lý đái tháo đường

Từ các nghiên cứu thực nghiệm trước đây cho thấy nguồn gốc, điều kiện sinh trưởng cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính sinh học Và đã chứng minh việc sử dụng dây vác như một nguồn dược liệu trong việc điều trị các bệnh nhân gian là hoàn toàn có cơ sở khoa học

2.3 Sự oxy hóa và sự chống oxy hóa

2.3.1 Gốc tự do[8]

Gốc tự do là tất cả các phân tử hóa học chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một phân tử có điện tử bị tách rời và phân tử đó trở thành một gốc tự do, với

số điện tử lẻ Do đó, các phân tử mang điện tử lẻ không cân bằng, không bền vững, dễ tạo ra phản ứng Các phân tử lẻ luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện

tử mà nó thiếu từ các phân tử khác và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự

do mới, gây rối loạn sự hoạt động của tế bào

Trong cấu trúc nguyên tử và phân tử, khi nói đến chuyển động của các điện tử ở dạng cặp đôi phải có số lượng tử spin đối nhau, nghĩa là một điện tử trong mỗi cặp điện tử có số lượng tử spin là +1/2 và điện tử còn lại có số lượng tử spin là -1/2 Gốc tự do là dạng xuất hiện không phụ thuộc, độc lập theo đúng nghĩa “tự do”, là một nguyên tử hoặc một mảnh phân tử chứa một hoặc nhiều hơn một điện tử không cặp đôi chỉ có một quỹ đạo

Bảng 2 1 Một số gốc tự do và ý nghĩa hoạt động của chúng [9]

Tên gốc tự do Công thức gốc Ý nghĩa

Hydroxyl OH•

Gốc có oxy ở trung tâm, phản ứng mạnh, có hoạt tính rất mạnh, tấn công hâu như tất cả các phân tử trong cơ thể

Gốc có oxy ở trung tâm, được hình thành trong quá trình phá vỡ peroxide hữu cơ, kể cả các con đường khác

Nitric oxide NO• Oxyde nitric (NO•) được hình

thành trong cơ thể từ amin arginin

L-Nitrogen dioxide NO2 Nitơ dioxide (NO2) được hình

thành khi cho NO• phản ứng với

O2 và xuất hiện trong không khí

bị ô nhiễm hoặc khói của các chất hữu cơ bị đốt cháy (khói thuốc lá)

Về mặt sinh hóa, được giải thích như sau: phần nhỏ nhất của vật thể gọi

là nguyên tử Mỗi nguyên tử có một nhân với một số chẵn điện tử xoay xung quanh Phân tử gồm một số nguyên tử dính với nhau do tác dụng của các đôi điện tử, khi một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở thành một gốc

tự do, với số lẻ điện tử, nó không cân bằng nên rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng, dẫn đến gây rối loạn các hoạt động của tế bào

2.3.1.1 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể[10],[11]

Các gốc tự do trong cơ thể sinh vật có 2 nguồn gốc, đó là nội sinh và ngoại sinh Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được chính cơ thể tạo ra Gốc tự

do có nguồn gốc ngoại sinh được hình thành trong cơ thể do các yếu tố bên ngoài tác động vào cơ thể như ô nhiễm môi trường, tác động của tia tử ngoại mặt trời, khối thuốc lá, rượu, thuốc chữa bệnh, căng thẳng…

a) Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Gốc tự do được hình thành trong cơ thể do những quá trình chuyển hóa

tự nhiên như hô hấp tế bào, quá trình trao đổi chất của tế bào Ty thể là nguồn tạo ra nhiều các gốc tự do nội bào Trong chuỗi dẫn truyền điện tử của hô hấp

tế bào một số điện tử bị rò rỉ dẫn đến hậu quả là chúng tương tác với các phân

tử oxy để hình thành gốc superoxid Khoảng 2-5% oxy sử dụng cho sự trao đổi chất hiếu khí trong ty thể bị chuyển thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt

động gọi là ROS (reactive oxygen species) bao gồm các gốc tự do như superoxide (O2 •-), hydroxyl (HO-), và các loại khác như hydrogen peroxide (H2O2), acid hyopchlorous (HOCl) và peroxy nitrite (ONOO-) Gốc tự do có nito hoạt động gọi là RNS (Reactive nitrogen species) bắt nguồn từ NO thông qua phản ứng với (O2 •-) để hình thành ONOO- hoặc dạng lưu huỳnh hoạt động

là RSS (Reactive sulfua species) dễ dàng hình thành từ các phản ứng của ROS Các gốc tự do khác được hình thành trong cơ thể như là vũ khí sinh học chống lại virus, vi khuẩn, tế bào ung thư…

Ion kim loại chuyển tiếp: Ion sắt đồng đóng vài trò quan trọng trong việc hình thành gốc tự do Các ion kim loại này tham gia trong phản ứng Haber-Weiss tạo ra HO• từ O•• và H2O2 Phản ứng này làm tăng thêm sự oxy hóa những phân tử không phải là enzyme như epinephrine và glutathione hình thành O2 •- và H2O2 từ HO- Bên cạnh đó, ion sắt và đồng có khả năng oxy hóa

và peroxide hóa lipid Chúng phân hủy lipid hydroperoxid thành peroxyl và alkoxyl, các gốc này tham gia vào phản ứng dây chuyền peroxide hóa lipid gây nguy hiểm cho tế bào Ion đồng là nhân tố quan trọng gây ra sự oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL)

b) Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh được hình thành do các yếu tố tác động từ môi trường, như tác động của không khí, tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thực phẩm của con người

Hút thuốc lá cũng như hít phải khói thuốc sẽ gây ra tổn thương đường hô hấp, trong khói thuốc lá có các chất aldehyl, epoxid, peroxid làm giảm các chất chống oxy hóa trong tế bào và trong nhựa thuốc có chứa các gốc tự do như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và hydroquinon Xạ trị ung thư cũng là một nguyên nhân sinh ra gốc tự do, các bức xạ được sử dụng trong xạ trị tác động và truyền năng lượng cho các thành phần của tế bào sinh ra các gốc tự

do, các gốc tự do này tiếp tục phản ứng với oxy hòa tan trong dịch tế bào sinh

ra các ROS Ngoài ra việc sử dụng thuốc có thể làm tăng gốc tự do trong cơ thể, những loại thuốc như thuốc kháng sinh cũng có nhóm quinoid và thuốc chống ung thư có chứa các nhóm như bleomycin, anthracyclin và loại thuốc cản trở sự phát triển tế bào có hoạt động chất tiền oxy hóa, những gốc là dẫn xuất của penicillamin, phenylbutazon, acid fenamic và aicd ascorbic và làm tăng nhanh sự peroxid hóa lipid

2.3.1.2 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể

a) Lợi ích của gốc tự do [8],[12]

Khi số lượng gốc tự do tồn tại trong vòng kiểm soát, các gốc tự do rất cần thiết cho các hoạt động sống của cơ thể

Chẳng hạn như trong hệ thống miễn dịch cơ thể người rất dễ bị các vi sinh vật từ môi trường bên ngoài xâm nhập, do đó một hệ thống miễn dịch nhằm bảo vệ cơ thể khỏi các vi sinh vật là rất cần thiết, đóng vai trò chính trong nhiệu vụ này là các tế bào lympho T và các gốc tự do phần lớn là các ROS được tạo ra bởi sự hoạt hóa của các đại thực bào góp phần tiêu diệt các vi sinh vật có hại Qúa trình hô hấp tế bào nhằm tạo ra năng lượng cho các hoạt động sống cũng phụ thuộc vào gốc tự do, qúa trình hô hấp có bản chất là chuỗi phản ứng oxy hóa khử và các gốc tự do là các sản phẩm trung gian trong chuỗi phản ứng Ngoài ra các gốc tự do còn có khả năng quét dọn các tế bào chết và già trong cơ thể, đồng thời các gốc tự do còn góp phần tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư

b) Tác dụng có hại của gốc tự do

Khi con người khỏe mạnh, các gốc tự do sinh ra trong các hoạt động sống thoát ra khỏi các quá trình hoạt động bình thường của cơ thể sẽ bị trung hòa bởi hệ thống chống gốc tự do của cơ thể Số lượng gốc tự do trong cơ thể tăng nhanh trong các trường hợp ảnh hưởng bởi chất độc hóa học như thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ… stress thể chất hay tâm lý như quá nóng, quá ồn, quá căng thẳng, quá lo âu sẽ dẫn đến hậu quả phát sinh một số bệnh về thần kinh,

xơ vữa động mạch, bệnh đái tháo đường, bệnh phổi, bệnh ung thư, suy giảm

hệ thống miễn dịch và đặc biệt liên quan đến nhiều loại bệnh của tuổi già như Parkinson, Alxheimer[12]

Ngoài ra các bệnh nhiễm khuẩn như bạch cầu bao quanh vi khuẩn, tăng chuyển hóa và năng lượng để làm nhiệm vụ thực bào, các cơ quan hoạt động quá tải tạo ra những gốc tự do

Làm hư hỏng protein dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể Các enzyme sẽ không được phục hồi vì nồng độ các gốc tự do quá cao dẫn đến làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể phá hủy DNA do các gốc tự do dễ dàng tấn công vào nhóm đường deoxyribise và base nitơ của nhóm purin và pirimidin hình thành thể đột biến gen do gốc tự do gây ra được tìm thấy nhiều trong mô ung thư[13]

2.3.2 Chất chống oxy hóa

2.3.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là chất trực tiếp hoặc gián tiếp ngăn cản, trung hòa hay loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do đối với cơ thể Chúng có thể trực

tiếp phản ứng với các gốc tự do, tạo nên sản phẩm mới kém hoạt động hơn nhằm ngăn phản ứng dây chuyền do gốc tự do gây ra Cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho quá trình hình thành gốc tự do, giúp ngăn cản sự hình thành các gốc tự

do[1],[14]

2.3.2.2 Các loại chất chống oxy hóa

a) Chất chống oxy hóa nội sinh

Trong cơ thể khỏe mạnh luôn có hệ thống chống oxy hóa nội sinh, có tác dụng vô hiệu hóa các gốc oxy hóa tự do có hại như các enzyme: glutathione peroxidase, superoxide, dismutase,… đặc biệt là vitamin C, vitamin E, β-caroten (tiền vitamin A), khoáng chất selen “nội sinh” có sẵn trong cơ thể, xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hóa gốc tự do giúp cơ thể khỏe mạnh

Chất chống oxy hóa hiệu quả nhất trong cơ thể là các enzyme như: glutathione peroxidase, catalase và superoxide dismutase[15]

• SOD enzyme xúc tác chuyển đổi O2 •- thành H2O2 và oxy

• Catalase là enzyme xúc tác sự phân hủy hydrogen peroxide thành nước

và oxy

• Gutathione peroxidase là một nhóm các enzyme có hoạt tính chống oxy hóa có trong tế bào Các chức năng sinh hóa của glutathione peroxidase là giảm hydroperoxide lipid và biến đổi hydrogen peroxide tự do thành nước

Hình 2 2: Phản ứng của Glutahione

Chất chống oxy hóa nội sinh đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì các chức năng tối ưu của tế bào và bảo vệ sức khỏe Tuy nhiên, trong trường hợp các quá trình oxy hóa sinh ra quá nhiều gốc tự do, chất chống oxy hóa nội

sinh có thể không đáp ứng đủ để giữ cân bằng cho cơ thể thì chế độ ăn uống hay chất chống oxy hóa ngoại sinh có thể cần để duy trì các hoạt động tối ưu

c) Chất chống oxy hóa ngoại sinh

Hiện nay, hướng đi tìm các chất chống oxy hóa ngoại sinh đang rất được quan tâm Với nguồn tài nguyên dược liệu sẵn có rất phong phú và đa dạng Một số nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng trái cây và rau quả luôn làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh liên quan đến quá trình lão hóa như ưng thư, bệnh tim mạch và bệnh Alzheimer[16].Trong thực tế thực vật có chứa các chất chống oxy hóa tự nhiên như: ascobates, catechins, flavonoids, phenolic,… giúp làm sạch các gốc

• Phân loại

Dựa vào thành phần và cấu trúc của phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol Phân loại này dựa trên khung carbon của các hợp chất trong đó C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế

có 4 carbon

Hình 2 3 Một số cấu trúc của hợp chất phenol

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm hợp chất đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Vùng cấu trúc thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của nhóm hợp chất này được thể hiện trên hình sau

Hình 2 4 Các vùng cấu trúc thể hiện khả năng chống oxy hóa của

polyphenol [18]

Các hợp chất polyphenol giúp bảo vệ thực vật trước tác hại của tia cực tím, chống lại sự tấn công của vi sinh vật gây hại cũng như chống lại sự oxy hóa Mặt khác chúng còn giúp gia tăng hiệu quả quang hợp thông qua việc điều chỉnh sự phân bố ánh sáng mặt trời ở lá Ngoài ra, các hợp chất polyphenol còn đóng vai trò chủ yếu trong việc quyết định màu sắc, hương vị của nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật

Trên phương diện chống oxy hóa, các hợp chất polyphenol có thể phản ứng trực tiếp với gốc tự do tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do, từ đó ngăn cản phản ứng dây chuyền gây hại cho cơ thể do gốc tự

do gây ra

• Flavonoid [19],[20]

Flavonoid là nhóm hợp chất khá quen thuộc trong tự nhiên có trong thực vật, hiện nay có khoảng 6000 hợp chất flavonoid trong tự nhiên Về cấu trúc hóa học, flavonoid có cấu trúc chung là diphenylpropan (C6-C3-C6), với 2 vòng benzen C6 (vòng A và B) gắn với dị vòng C3 có oxy

Hình 2 5 Cấu trúc cơ bản của flavonoid

Flavonoid trong tự nhiên thì rất đa dạng tồn tại trong tự nhiên bao gồm nhiều loại polyphenol như catechin kết tinh không màu anthocyanin, flavanone, flavone, flavonl, isoflavone,… các hợp chất flavonoid được tạo ra ở trong mô thực vật nhầm chống lại tia UV

Hình 2 6 Cấu trúc của một số loại flavonoid

Mang bản chất là polyphenol nên các flavonoid có tính chống oxy hóa mạnh, giúp trung hòa các gốc tự do, làm chậm sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipid, tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp giúp ngăn chặn quá trình peroxide hóa lipid Thông qua các nhóm hydroxyl nhân thơm, các flavonoid còn có thể tương tác với protein, tương tác đó có thể làm hoạt hóa hoặc ức chế hoạt động của một số enzyme Chẳng hạn như ức chế enzyme xanthin oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase, qua đó ức chế sự hình thành gốc tự do Nhờ vậy, flavonoid giúp cơ thể chống đỡ được phần lớn sự tấn công của gốc tự do

Flavonoid còn có khả năng chống ung thư một cách hiệu quả, tuy nhiên

cơ chế chính xác của tác động đó vẫn chưa được hiểu rõ, điều này tạo động lực thúc đẩy nhiều nghiên cứu về sự ức chế phát sinh ung thư của flavonoid thông qua khả năng loại gốc tự do

Ngoài ra ở cấp độ tế bào, các flavonoid có khả năng trung hòa các gốc tự

do là nhờ vào cấu trúc hóa học cũng như sự liên kết của chúng với màng tế bào Chẳng hạn như flavonoid giúp bảo vệ lipoprotein tỷ trọng thấp chống lại

sự oxy hóa bằng cách liên kết với bề mặt phân tử lipoprotein tỷ trọng thấp, hình thành liên kết ether làm giới hạn sự tấn công của các tác nhân oxy hóa và các gốc tự do, giúp hạn chế nguy cơ gây ra các bệnh tim mạch cho cơ thể

+ Carotenoid [21]

Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như tảo, một vài loài nấm và vi khuẩn Hiện nay đã có 600 loại carotenoid được tìm ra và chia thành 2 nhóm gồm xanthophylle và carotene Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp carotenoid cho

cơ thể, nên phải cung cấp carotenoid từ việc ăn thực vật nhằm bảo vệ cơ thể

Carotenoid không phải là tên riêng của bất ḱì một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có cấu tạo và tác dụng bảo vệ cơ thể tương tự nhau

Carotenoid có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi rất dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng cho màng tế bào Các carotenoid với khả năng hòa tan trong chất béo nên được tích lũy trong cơ thể,

dễ dàng xâm nhập vào các vị trí dễ bị tác động của gốc tự do như màng tế bào, qua đó có thể thấy hiệu quả chống oxy hóa của chúng khá cao Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các carotenoid là những thành phần quan trọng của hệ thống bảo vệ chống oxy hóa của da Những tác dụng trong việc chống oxy hóa và giảm peroxide lipid của carotennoids đã và đang được nghiên cứu[22]

+ Vitamin C [23]

Vitamin C (acid ascorbic) được tìm thấy nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây như bông cải xanh, tiêu, khoai tây, cà chua, chanh, quýt, bưởi, Vitamin C là chất kết tinh màu trắng hoặc màu vàng, rất dễ tan trong nước (300 g/lít)

Hình 2 7 Công thức cấu tạo của vitamin C

Vitamin C đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể Ở

mô, vitamin C giúp tổng hợp collagen, proteoglycan và các thành phần hữu cơ khác ở răng, xương, nội mô, mao mạch Vitamin C giúp ổn định cấu trúc collagen, một protein quan trọng trong việc liên kết các cấu trúc của cơ thể với nhau, thông qua kết nối một phần của phân tử amino acid proline để hình thành hydroxyproline, cần thiết cho việc làm lành vết thương và giúp tăng sức

đề kháng cho cơ thể Thêm vào đó, vitamin C còn có chức năng miễn dịch, tham gia sản xuất một số chất dẫn truyền thần kinh và hormon, tổng hợp carnitine Vitamin C còn là một chất chống oxy hóa rất quan trọng Hơn nữa, vitamin C còn giúp phục hồi và tái tạo vitamin E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể, qua đó tăng cường hiệu lực chống oxy hóa của vitamin E

Vitamin C (acid ascorbic) khi kết hợp với α-tocopherol có hiệu quả rất cao trong việc làm sạch quá trình oxy hóa [24]

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm làm luận văn

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Bộ môn sinh Lý - Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Cần Thơ

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2016 đến thánh 2/2017

3.2 Nguyên liệu nghiên cứu

Loại dây vác ba lá được thu nhận tại Huyện Lai Vung Tỉnh Đồng Tháp Sau đó được rửa sạch và phơi tự nhiên

3.3 Phương tiện nghiên cứu

Thiết bị:

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu khi được thu nhận thì tiến hành phơi khô tự nhiên Mẫu được xay nhuyễn và lược qua rây cho mẫu đồng nhất Sau đó trữ trong hộp kín để tiến

hành xác định độ ẩm và phân tích các thí nghiệm trên mẫu

3.5.2 Xác định độ ẩm [25]

Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi nước có trong mẫu Cân trọng

lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu

Tiến hành thí nghiệm: Sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C đến trọng lượng không đổi (2 lần cân liên tiếp không khác biệt qúa 5 mg) Dùng cân 4 số cân để xác định chính xác trọng lượng cốc m0 (g) Tiến hành cân 0,2 g mẫu, khi đó tổng khối lượng cốc và mẫu là m1 (g) Đặc cốc cân vào

tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C, sấy trong 6 giờ, lấy cốc mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm có chứa silica gel khoảng 15 phút Cân cốc mẫu đã sấy, sau đó tiếp tục sấy mẫu khoảng 1 giờ Lập lại việc cân và sấy cho đến khi trọng lượng cốc có mẫu có khác biệt không quá 5 (mg) giữa các lần cân liên tiếp Ghi nhận khối lượng m2 (g)

Tính toán kết quả:

Độ ẩm được quy về phần trăm (X) được tính theo công thức sau

(3.1)Trong đó:

m0: là khối lượng của cốc không có mẫu (g)

m1: là khối lượng cốc có mẫu chưa sấy

m2: là khối lượng cốc có mẫu đã sấy

Tiến hành với 5 lần lập lại đối với mẫu phân tích Kết quả độ ẩm được tính trung bình với 5 lần lập lại

3.5.3 Xây dựng đường chuẩn

3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn acid gallic để xác định TPC [26]

Nguyên tắc: Hàm lượng phenolic tổng số được xác định bằng phương

pháp Folin-Ciocalteu Trong quá trình phản ứng, những nhóm –OH của phenolic phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocaltue để tạo ra phức phosphotungstic-phosphomolybdic màu xanh, và có thể phát hiện nhờ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 760 nm Nồng độ của hàm lượng phenolic tổng số được xác định bằng việc so sánh với giá trị mật độ quang các nồng độ khác

nhau của một hợp chất phenolic chuẩn thường là acid gallic hoặc acid chlorogenic và đơn vị tính được biểu diễn tương đương theo acid gallic hay acid chlorogenic

Xây dựng đường chuẩn acid gallic

Pha dãy dung dịch acid gallic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 0,5 mg/ml và các hóa chất khác theo bảng 3.1 Sau khi ủ mẫu thì tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 760nm trên máy quang phổ UV-VIS heliox α Thí nghiệm được lập lại 2 lần và lấy kết quả trung bình, vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ acid gallic với độ hấp thụ A

Bảng 3 1 Xây dựng đường chuẩn acid gallic

STT Nồng độ

acid gallic

(mg/ml)

Thể tích acid gallic chuẩn nồng độ 0,5mg/ml

MeOH (µl)

Thuốc thử Folin 1N (µl)

Cách xác định hàm lượng tổng phenolic trong mẫu phân tích

Dịch chiết mẫu phân tích đo trực tiếp Tiến hành hút chính xác bằng pipetman 100 µl dịch mẫu, thêm lần lượt 3,5 ml nước cất, thêm tiếp 400 µl thuốc thử FolinCiocalteu 1N và 1 ml dung dịch Na2CO3 7,5% Hỗn hợp được

ủ trong điều kiện bóng tối trong vòng 2 giờ đến khi phản ứng xảy ra hoàn toàn Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 760 nm Kết quả tính toán hàm lượng tổng phenolic trong mẫu dựa vào đồ thị biểu diễn sự tuyến tính giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thụ A: y = ax + b Kết quả được biểu hiện bằng số mg acid gallic (GAE)/g mẫu

Tính toán kết quả

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng số trong mẫu đo theo công thức

(3.2) Trong đó:

P: Hàm lượng phenolic tổng số (mg GAE/g mẫu)

C: Nồng độ acid gallic được suy ra từ phương trình đường chuẩn (mg/ml)

Xây dựng đường chuẩn quercetin

Pha dãy dung dịch quercetin chuẩn nồng độ từ 0 đến 0,03 mg/ml Cho lần lượt các hóa chất vào ống nghiệm theo bảng 3.2 Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm trên máy quang phổ UV-Vis (Heliox α) Thí nghiệm được lập lại 2 lần để lấy kết quả trung bình và vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ quercetin với độ hấp thụ A

Bảng 3 2 Xây dựng đường chuẩn quercetin

quercetin (mg/ml)

Thể tích quercetin chuẩn (µl)

Thể tích MeOH (µl)

Thể tích AlCl3/MeOH 2% (µl)

Cách tính kết quả: Dựa trên đồ thị biểu hiện sự tuyến tính giữa nồng độ quercetin và độ hấp thụ A: y = ax + b (với x là trục hoành biểu thị nồng độ, y

là trục tung thể hiện độ hấp thụ)

Cách xác định hàm lượng tổng flavonoid trong mẫu phân tích

Dịch chiết mẫu phân tích được đo trực tiếp Tiến hành hút chính xác

1000 µl dịch mẫu, thêm vào 1000 µl dung dịch AlCl3/MeOH 2% Hỗn hợp được ủ ổn định 1 giờ trong điều kiện bóng tối để phản ứng hoàn toàn Sau đó, tiến hành đem đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 420 nm Kết quả tính toán hàm lượng flavonoid tổng số trong mẫu phân tích dựa vào đồ thị biểu diễn sự tuyến tính giữa nồng độ quercetin với độ hấp thụ A: y = ax + b Kết quả được biểu diễn dựa trên số mg quercetin (QE)/g mẫu

P: hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g mẫu)

C: nồng độ quercetin được suy ra từ phương trình đường chuẩn (mg/ml) V: thể tích dịch mẫu (ml)

m: khối lượng mẫu đem chiết (g)

3.5.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ đến khả năng chiết tách hàm lượng phenolic tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại gốc tự do DPPH

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 loại

dung môi tách chiết và tường nồng độ tách chiết khác nhau: ethanol, acetone

và methanol đều có dãy nồng độ từ 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 Tổng nghiệm thức

là 15, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Tiến hành thí nghiệm: Cân 0,25 gam mẫu đã được xay nhuyễn cho vào

ống nghiệm có nắp, tiếp tục cho từng loại dung môi và nồng độ như đã bố trí ở trên vào từng ống nghiệm Ngâm và lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, cứ 10 phút vortex một lần khoảng 10 giây Chiết 3 lần sau đó đem lọc thu mẫu và tiến hành lấy dịch chiết để xác định hàm lượng TPC, TFC và khả năng loại gốc tự do DPPH

Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng TPC (mg GAE/g mẫu), TFC (mg GE/g

mẫu) và khả năng loại gốc tự do DPPH của dây vác để chọn dung môi và nồng

độ chiết thích hợp cho các thí nghiệm sau

3.5.4.2 Khảo sát ảnh hưởng số lần chiết tách đến hàm lượng phenolic tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại gốc

tự do DPPH

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một

nhân tố theo số lần chiết 2, 3 và 4 lần chiết cho từng nghiệm thức Tổng số nghiệm thức là 3, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Tiến hành thí nghiệm: Cân 0,25 gam mẫu đã được xay nhuyễn cho vào

từng ống nghiệm có nắp, tiếp tục thêm dung môi và nồng độ được chọn từ 3.5.4.1 vào tường ống nghiệm Ngâm và lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, cứ

10 phút vortex một lần khoảng 10 giây Lấy dịch chiết riêng rẻ (được lần chiết thứ nhất), phần cặn thô sau khi lấy dịch được thêm dung môi vào các ống nghiệm này, chiết và lấy dịch chiết tương tự vào cùng 1 ống bi được lần thứ hai, sau đó đem lọc, làm tương tự với 3 lần chiết và 4 lần chiết

Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng TPC (mg GAE/g mẫu), TFC (mg QE/g

mẫu) và khả năng loại gốc tự do DPPH của dây vác để chọn số lần chiết thích hợp cho các thí nghiệm sau

3.5.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến khả năng chiết hàm lượng phenolic tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng

số (TFC) và khả năng loại gốc tự do DPPH

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố là

nhiệt độ và thời gian tách chiết ở các nhiệt độ 30 C0, 40 C0, 50 C0 và 60 C0

chiết trong thời gian 2, 3 và 4 giờ chiết với tổng nghiệm thức là 12, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Tiến hành thí nghiệm: Cân 0,25 gam mẫu cho vào từng ống nghiệm tiến