Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC (2018)

Ngoài ra trong hạt gấc còn có một số các hợp chất giá trị khác như saponin, ankaloit,…Tuy nhiên hiện nay ứng dụng của gấc ở nước ta mới chỉ dùng lại ở việc sử dụng cơm gấc và màng đỏ bao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

-

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

-

KIỀU THỊ LAN

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Hóa học phân tích

Hà Nội – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

Sinh viên thực hiện: Kiều Thị Lan Ngành học: Hóa học phân tích Cán bộ hướng dẫn: ThS Vũ Thị Kim Thoa

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Vũ Thị Kim Thoa, người đã tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận của mình

Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Hóa Học của trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ về mọi cơ sở vật chất và chỉ bảo em trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những đóng góp ý kiến của các bạn sinh viên lớp K40C – Sư phạm Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp

đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình và sự động viên, khích lệ của bạn bè, người thân đặc biệt là gia đình đã tạo niềm tin giúp

em phấn đấu học tập và hoàn thành khóa luận này

Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng chắc chắc không thể tránh khỏi thiếu sót.Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của quý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Kiều Thị Lan

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn khoa học của ThS Vũ Thị Kim Thoa.Các kết quả và số liệu trong

khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Kiều Thị Lan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC 3

1.1.1.Đặc điểm thực vật học 3

1.1.1.1 Khái quát 3

1.1.1.2 Mô tả thực vật 3

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái 4

1.1.2 Thành phần hóa học của quả gấc. 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT 5

1.2.1 Chọn dung môi chiết 5

1.2.2 Quá trình chiết 8

1.2.3 Phương pháp chiết 8

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN 10

1.3.1 Định nghĩa về chiết pha rắn 10

1.3.2 Các cơ chế chiết pha rắn 10

1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 11

1.4.1 Khái niệm 12

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc kí 12

1.4.3 Phân loại sắc kí hấp phụ 13

1.4.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ 14

1.4.5 Hệ thống HPLC 17

1.4.5.1 Bình đựng dung môi 18

1.4.5.2 Bộ phận khử khí 18

1.4.5.3 Bơm cao áp 18

1.4.5.4 Bộ phận tiêm mẫu 18

Cột sắc kí khí.

1.4.5.6 Đầu dò 19

1.4.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu 20

1.4.5.8 Thiết bị in dữ liệu 20

1.4.6 Các bước tiến hành sắc kí 20

1.4.6.1 Chuẩn bị dụng cụ, máy móc 20

1.4.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động 20

1.4.6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 21

1.4.6.4 Cách vận hành thiết bị 21

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22

2.1 Đánh giá qui trình chiết từ hạt gấc 22

2.1.1 Phổ hấp thụ các chất chứa gốc với 3 nối liên hợp 22

2.1.2 Sự phụ thuộc của mật độ quang A của dầu hạt gấc với nồng độ của dầu gấc (mg/ml) 22

2.1.3 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào các dung môi 23

2.1.4 Chiết tinh dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ 24

2.2 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH LÀM SẠCH TINH DẦU GẤC 30

2.2.1 Nghiên cứu quá trình làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn 31

2.2.1.1 Nghiên cứu quá trình hấp phụ của dầu trên cột chiết silicagel 31

2.2.1.2 Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ của dầu 33

2.3 ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN TRIGLIXERIT TRONG DẦU HẠT GẤC 40

2.3.1 Định tính các triglixerit trong dầu hạt gấc 40

2.3.2 Định lượng các triglixerit trong dầu hạt gấc 44

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

SPE Solid – Phase Extraction Chiết pha rắn

UV-VIS Ultraviolet-Visible Phổ tử ngoại khả kiến

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

RP-HPLC

Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo

NP-HPLC

Normal Phase High Performance Liquid Chromatography

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha thường

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín 5

Bảng 1.2 Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dược liệu (Houghton và Raman, 1998) 7

Bảng 2.1 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (tại = 270nm) 22

Bảng 2.2 Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mỗi lần chiết bằng dung môi n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 10ml 25

Bảng 2.3 Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mối lần chiết bằng dung môi n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 20ml 25

Bảng 2.4 Kết quả xác định tổng % chiết qua mỗi lần chiết bằng dung môi aceton 28 Bảng 2.5 Kết quả xác định 1 số đại lượng trong quá trình chiết dầu hạt gấc 30

Bảng 2.6 Kết quả khảo sát quá trình hấp thụ dầu hạt gấc trên cột DIAPAK C 32

Bảng 2.7 Phần trăm giải hấp chất phân tích bằng các hệ dung môi khác nhau 34

Bảng 2.8 Kết quả rửa giải dầu bằng phương pháp chiết pha rắn 34

Bảng 2.9 Các thông số trong sắc kí đồ khi phân tích dầu hạt gấc bằng RP-HPLC 41 Bảng 2.10 Kết quả xác định thành phần của các triglixerit chính trong dầu hạt gấc 46

Bảng 2.11 Kết quả xác định hàm lượng dầu và thành phần của các axit béo có trong dầu hạt gấc 47

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.a.b: Gấc nếp 3

Hình 1.2 Hoa và quả gấc 4

Hình 1.3 Màng gấc 4

Hình 1.4 Hạt gấc 4

Hình 1.5 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải 13

Hình 1.6 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B 13

Hình 1.7 Sắc kí đồ của chất A và chất B 14

Hình 1.8 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B 15 Hình 1.9 Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak 16

Hình 2.1 Sơ đồ bước chuyển năng lượng của dao động electron (A) và phổ hấp thụ phân tử của hợp chất chứa ba nối đôi liên hợp (B) 22

Hình 2.2 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (trong dm n-hexan) 23

Hình 2.3 Phổ hấp thụ phân tử eclectron của dầu hạt gấc trong các dung môi khác nhau 1-trong dung môi n-hexan, 2- trong dung môi CH2Cl2 24

Hình 2.4 Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi hexan (thể tích dung môi của mỗilần chiết 10 ml) 26

Hình 2.5 Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi hexan (thể tích dung môi của mỗi lần chiết 20 ml) 26

Hình 2.6 Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi diclometan 27

Hình 2.7 Dung dịch dầu gấc trong dung môi diclometan trong 6 lần chiết (thể tích mỗi lần 10ml) 28

Hình 2.9 Mô hình phân tử triglixerit và phospholipid có tròng dầu hạt thực vật 31

Hình 2.10 Quá trình hấp thu dầu trên cột chiết pha rắn DIAPAK C 32

Hình 2.11 Quá trình rửa giải cột chiết bằng các hệ dung môi khác nhau 33

Hình 2.12 Quá trính chiết là làm sạch dầu hạt gấc 35

Hình 2.13 Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải

bằng hệ n-hexan và diclometan (1:1, v/v) A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-8: các phân đoạn dầu thu được sau 1-8 ml rửa giải 36 Hình 2.14 Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải

bằng diclometan A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải 36 Hình 2.15.Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải

bằng aceton A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải 37 Hình 2.16 Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel 38 Hình 2.17 Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel theo thời

gian 39 Hình 2.18 Sắc ký đồ của dầu hạt gấc (A) trên nền dầu chuẩn momordica charantia

(B) 41 Hình 2.19 Ba dạng cấu hình của các acid liên hợp octadecatrienoic có trong thiên

nhiên và dạng phổ hấp thụ phân tử của chúng 43 Hình 2.20 Phổ hấp thụ electron trong dung môi 40% isopropanol và 60%

acetonitrin được đo trong cuvet của đầu dò diot quang (DAD) 44 Hình 2.21 Các mẫu gấc được thu hái từ các tỉnh khác nhau 45 Hình 2.22 Kết quả tách triglixerit có trong dầu hạt gấc 46

MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển khoa học, nhiều loại bệnh đã được phát hiện

và bước đầu nghiên cứu về phương pháp điều trị.Để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khoẻ người bệnh, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chế tạo nhiều loại thuốc đặc trị Tuy nhiên, sau một thời gian sử dụng thì một số loại thuốc gây ra các tác dụng phụ làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người bệnh chính vì vậy các nhà khoa học quay trở lại với thiên nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học, dược tính của các chất

có trong các loài thực vật với mong muốn sẽ tìm ra được phương thuốc mới an toàn hơn cho sức khỏe con người Việt Nam là đất nước nhiệt đới gió mùa với khí hậu nóng ẩm, cây cối phát triển thuận lợi, rất phong phú và đa dạng.Vì vậy, việc nghiên cứu, phân tích, giải mã các thành phần hóa học của thảo dược ngày càng phát triển

Gấc là một cây thực phẩm đặc biệt ở Việt Nam, có danh pháp khoa học là momordica cochinchinensis, thuộc chi mướp đắng.Ở Việt Nam có khoảng 3 loài thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai.Trái gấc được sử dụng trong ẩm thực, chăm sóc sắc đẹp và y học.Gấc là loại thực phẩm đã được sử dụng lâu đời ở nước ta, nhưng việc nghiên cứu cây này thì mới chỉ được nghiên cứu trong những năm gần đây Năm 1988-1989, TS Phan Quốc Kinh và các cộng sự đã nghiên cứu các chế phẩm từ quả gấc để làm các chất bổ sung chất dinh dưỡng Từ năm 1941, bộ môn dược liệu Đại học Dược Hà Nội đã bước đầu xác định màng đỏ bao quanh hạt gấc

có tác dụng giống như vitamin A và có tác dụng tăng trọng cho động vật và con người Ngoài -caroten thì phần màng đỏ của gấc còn chứa lycopene một chất chống lão hóa mạnh nhất hiện nay.Ngành dược Việt Nam đã sản xuất một số chế phẩm có chứa dầu màng gấc làm thuốc bổ, điều trị suy dinh dưỡng cho trẻ em và một số bệnh về mắt

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong dầu hạt gấc có chứa một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học Trong đó phải kể đến đầu tiên là hàm lượng triglixerit với gốc axit béo không no chứa 3 nối đôi liên hợp α - eleostearic, một loại axit béo với khả năng chống oxi hóa cao đã và đang được sử dụng để chế xuất thuốc

chống ung thư, chống giảm béo (CLA) Ngoài ra trong hạt gấc còn có một số các hợp chất giá trị khác như saponin, ankaloit,…Tuy nhiên hiện nay ứng dụng của gấc

ở nước ta mới chỉ dùng lại ở việc sử dụng cơm gấc và màng đỏ bao quanh hạt gấc là chủ yếu.Việc nghiên cứu để chiết xuất các hợp chất có giá trị trong hạt gấc hầu như chưa được đề cập và chưa đưa vào sản xuất.Chính vì vậy, việc nghiên cứu để chiết

và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc là nhu cầu cấp bách để tiến tới có thể tạo ra những sản phẩm thương mại có giá trị từ hạt gấc

Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu

từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC” với mục

tiêu nghiên cứu như sau:

- Tìm ra quy trình chiết thành phần glixerit từ hạt gấc

- Tìm ra quy trình tinh chế và làm sạch dầu gấc chiết được

- Sử dụng phương pháp trắc quang UV-VIS và phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để đánh giá hiệu quả chiết và làm sạch tinh dầu gấc đồng thời phân tích thành phần glixerit của nó

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC

Tên nước ngoài: Muricic (Pháp), Cochinchina Momordica (Anh)

Tên Việt Nam: gấc (Kinh), mộc miết tử, má kưâru (Thái), mác khẩu (Tày)

Ở Việt Nam có khoảng 3 loài thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai

1.1.1.2 Mô tả thực vật

Cây gấc thuộc họ bầu bí, là cây dây leo, đa niên, đơn tính khác gốc, có cây mang hoa đực, cây mang hoa cái Đây là cây sống nhiều năm, mỗi năm lụi một lần nhưng lại đâm chồi từ gốc cũ lên vào mùa xuân năm sau

Lá mọc so le, có 3-5 thuỳ màu lục sẫm, gốc hình tim, lúc đầu có lông ở mặt trên, sau nhẵn; gân hình chân vịt; cuống lá dài 2-3 cm

Hình 1.1.a.b: Gấc nếp

Hoa nở vào tháng 4 đến tháng 5, hoa đực và hoa cái riêng trên cùng một cây; hoa đực mọc ở kẽ lá; tràng 5 cánh, màu trắng hoặc ngà vàng, hình trứng thuôn, có lông dày ở mặt trong; hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì.

Quả to hình bầu dục dài từ 15 - 20cm, đuôi nhọn có nhiều gai mềm đỏ đẹp Quả non màu xanh, quả chín màu đỏ tươi Bổ đôi theo chiều ngang thấy

có 6 hàng hạt xếp đều nhau, mỗi hàng có từ 6 đến 10 hạt Quanh hạt có nhiều màng màu đỏ tươi Người ta còn dựa vào độ sai của quả (nhiều hay ít), kích thước của quả (to hay nhỏ), gai quả (dày hay thưa), màu sắc của ruột quả (đỏ hay vàng gạch), dầu (ít hay nhiều), số lượng hạt (nhiều hay ít) để phân loại: gấc tẻ, gấc nếp hay gấc lai

Hạt gấc có màng đỏ bao quanh lớp vỏ cứng đen, quanh mép có răng cưa tù và rộng, hạt dày 25 - 35mm, rộng 19 - 31mm trông gần giống con ba

ba nhỏ bằng gỗ trong hạt có nhân chứa dầu

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái

Chi Momordica L có khoảng 45 loài trên thế giới, đa số là cây trồng, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ Châu Á có 5-7 loài, trong đó Việt Nam có 4 loài (M Karaudren Aymonin, 1975 và Nguyễn Hữu Hiếu, 1994) Gấc được trồng nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Philippin, Lào và Việt Nam

Hình 1.4: Hạt gấc

Ở Việt Nam, gấc được trồng từ lâu đời trong nhân dân.Cây trồng có giống quả chín màu đỏ và giống quả màu vàng Giống quả vàng hiện thấy trồng ở một số vùng núi thuộc tỉnh Lai Châu và Sơn La Giống quả đỏ có 2 loại: quả to và quả nhỏ, đều được trồng nhiều ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ

1.1.2 Thành phần hóa học của quả gấc

Bảng 1.1 Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín.

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào thành phần hóa học có trong mẫu (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta có thể chọn các dung môi hay hệ dung môi chiết khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Thông thường các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau nên đôi khi để tạo ra độ phân cực thích hợp người có thể sử dụng một loại dung môi hoặc có thể phối hợp nhiều dung môi theo một tỉ lệ nhất định để tạo ra hệ thống dung môi mới Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn kỹ càng, cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải dễ thấm vào dược liệu, hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, phải dễ dàng bay hơi khi cần

cô đặc dung dịch chiết và trơ về mặt hóa học (không phản ứng với những chất nghiên cứu, không độc, không dễ bốc cháy) Những dung môi này cần phải được làm sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn những chất khác thì ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết

Methanol (CH3OH) và Chlorofom (CCl3) thường chứa chất diotyl phtalat [di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat].Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân tích trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, ngoài ra nó có thể làm bẩn dung dịch chiết của mẫu vật

Methanol (CH3OH) và Ethanol 80% (C2H5OH) là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế đó, các dung môi thuốc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn vào màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ Người ta cũng thường ít sử dụng nước để thu được dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Ví dụ về lựa chọn dung môi trong chiết xuất được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1.2: Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ

dược liệu (Houghton và Raman, 1998)

Người nghiên cứu cần có sự hiểu biết về thành phần hóa học cũng như đặc tính của các chất có trong mẫu vật được từ đó có thể lựa chọn các dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy bởi dung môi và quá trình tạo thành chất không mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất quay ở nhiệt độ không quá 30C - 40C với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

Thấp

Cao

Chlorofom Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,

Aglycogen Cyclohexan Sáp, chất béo Hexan Sáp, chất béo

Dicloromethan Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,

Aglycogen Diethylether Alcanoid, Aglycogen Ethylacetat Alcanoid, Aglycogen, Glycosid Aceton Flavonoid, Alcanoid, Aglycogen

Ethanol

Tannin, Polyphenol, Terpenoid, Flavonoid, Serol, Alcanoid, Polyacethylen

Methanol

Saponin, Tanin, Phenol, Flavon, Đường, Aminoacid,

Anthrocyanidin, Terpenoid, Xanthoxyllin, Totarol, Lactone, Polyphenol

Nước

Đường, Aminoacid, Saponin, Tanin, Lectin, Terpenoid, Anthrocyanin, Tinh bột, Polypeptid Trung bình

1.2.2 Quá trình chiết

Quá trình chiết xuất diễn ra lần lượt như sau:

− Dung môi thâm nhập vào bên trong dược liệu

− Dung môi hòa tan các chất bên trong dược liệu

− Khuếch tán các chất tan trong dung môi (khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu) bao gồm:

+ Khuếch tán các chất tan từ trong dược liệu qua màng tế bào ra mặt ngoài dược liệu (khuếch tán qua lỗ xốp và khuếch tán phân tử)

+ Khuếch tán các chất từ mặt ngoài dược liệu ra lớp dung môi xa hơn (khuếch tán phân tử)

+ Khuếch tán các chất theo dòng chuyển động của dung môi (khuếch tán đối lưu)

1.2.3 Phương pháp chiết

Phương pháp chiết xuất là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của quá trình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm các phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại

Phương pháp truyền thống sử dụng dung môi kết hợp với gia nhiệt và khuấy trộn Các phương pháp chiết xuất hay sử dụng như:

− Phương pháp lôi cuốn hơi nước

− Phương pháp chiết Soxhlet

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi lẽ phương pháp này không đòi hỏi nhiều thời gian,

công sức và rất dễ thực hiện Thiết bị sử dụng là một chiếc bình thủy tinh với một khóa ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc lạnh nhưng sẽ thu được hiểu quả cao hơn nếu dùng dung môi nóng

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng nhiều như phương pháp chiết liên tục bởi lẽ mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24h rồi chất chiết được lấy ra Quá trình chiết một mẫu được thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ: Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và

sự xuất hiện của các cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

Các flavonoid là những hợp chất màu.Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu đồng nghĩa với việc trong cặn chiết không còn flavonoid và quá trình chiết sẽ kết thúc

Các lacton của Sesquitecpen và các glicotid trợ tim, phản ứng kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrocacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết sẽ kết thúc.Hay khi chiết các ankaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragedroff và các tác nhân Maye

Như vậy, tùy thuộc vào mục đích của người nghiên cứu là cần lấy chất gì từ đó lựa chọn dung môi và các phương pháp chiết thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao nhất

Mặt khác, ta có thể dựa vào các mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

Ngoài ra, hiện nay có nhiều kĩ thuật chiết hiện đại mới được áp dụng với nhiều ưu việt trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên như:

− Chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Chiết siêu âm – UAE)

− Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng – MAE)

− Chiết xuất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn – SPE)

− Chiết xuất bằng dung môi dưới áp lực cao (Chiết dung môi nhanh – ASE)

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN

1.3.1 Định nghĩa về chiết pha rắn

Chiết pha rắn (SPE) (Solid – Phase Extraction) là quá trình phân bố chất tan giữa hai pha lỏng – rắn có thể là các hạt silicagel xốp, các polime hữu cơ hoặc các loại nhựa trao đổi ion hay than hoạt tính Quá trình chiết có thể thực hiện ở điều kiện tĩnh hay động Các chất bị giữ lại trên pha rắn có thể được tách ra bằng cách rửa giải với dung môi thích hợp Thông thường thể tích cần thiết để rửa giải hoàn toàn chất phân tích luôn nhỏ hơn rất nhiều so với thể tích của dung dịch mẫu ban đầu, vì thế có hệ số làm giàu cao

1.3.2 Các cơ chế chiết pha rắn

Về cơ bản, cơ chế chiết SPE giống với cơ chế tách trong phương pháp sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) gồm 3 cơ chế chính: cơ chế hấp phụ pha thường, cơ chế hấp phụ pha đảo và cơ chế trao đổi ion Tuy nhiên, SPE khác với HPLC là trong HPLC có sự tách chất phân tích ra khỏi nhau trong hệ dòng chảy liên tục của pha động, còn SPE giữ chất phân tích lại trên pha rắn sau đó rửa giải chất phân tích ra khỏi pha rắn với dung môi thích hợp Các chất phân tích sẽ được tách khỏi dung dịch ban đầu với nồng độ đậm đặc hơn và tinh khiết hơn

− Cơ chế hấp phụ pha thường (normal phase)

Là sự hấp thu các chất phân tích từ dung môi không phân cực lên bề mặt phân cực của pha rắn Cơ chế của quá trình tách dựa trên lực tương tác phân cực như: các liên kết hydro, các tương tác phân cực π – π, tương tác lưỡng cực hay tương tác lưỡng cực cảm ứng Cơ chế này liên quan đến sự hấp thu các nhóm chức của chất tan lên các vị trí phân cực của pha tĩnh để chống lại độ tan của các chất tan trong pha động

Trong SPE pha thường, thường sử dụng các loại pha tĩnh không liên kết như: silica, alumina và magie silica, nhưng phổ biến nhất vẫn là silica

Để rửa giải chất phân tích ra khỏi chất hấp thu, thường sử dụng dung môi phân cực có khả năng phá vỡ các liên kết giữa chất phân tích với bề mặt chất hấp thu

− Cơ chế hấp thụ pha đảo (reversed – phase)

Ngược với cơ chế hấp thụ pha thường, pha tĩnh ở đây là các chất không phân cực còn pha động là pha không phân cực Cơ chế là tương tác không phân cực còn gọi là tương tác Van Der Vaals, hiệu ứng phân tán hay sự phân tách

− Cơ chế trao đổi ion

Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi phân cực hay không phân cực với chất hấp thu trao đổi ion Cơ chế tương tác ion này có nang lượng cao (80Kcal/mol) Vì vậy, các chất tan phân cực có thể hấp thu hiệu quả từ dung môi phân cực cũng như tù dung môi không phân cực Trong quá trình hấp thu sẽ xuất hiện sự cạnh tranh để trao đổi ion Quá trình này phụ thuộc vào

độ chọn lọc của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí này Do vậy, chất chất tích được làm giàu sẽ phải cạnh tranh với các ion khác trong dung dịch mẫu Sự trao đổi ion là quá trình thuận nghịch

Các chất hấp thụ trao đổi thường có chứa các nhóm chức anion hoặc các cation liên kết với silica.Các chất trao đổi cation mạnh có chứa nhóm chức axit sulfonic và các chất trao đổi ion yếu thường là các nhóm axit cacboxylic Đối với các chất trao đổi anion mạnh là các nhóm chức chứa amin bậc 4, còn các chất trao đổi anion yếu thường là bậc 1,2 và 3

Pha tĩnh thường là silica liên kết với nhóm chức anion hay cation Nếu là các chất trao đổi cation mạnh thì dùng silica liên tiếp với nhóm sulfonic axit, còn là chất trao đổi yếu thường là liên kết với nhóm – COOH

Việc rửa giải các chất phân tích hấp thu trên pha tĩnh có thể tiến hành theo nhiều cách: nếu là trao đổi cation có thể dùng H+ của axit mạnh hoặc dùng các cation mạnh hơn, nếu là trao đổi anion thì dùng OH − hoặc các anion khác

1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc

kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc kí lỏng cao áp ( High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp

sắc kí cột cổ điển.Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong các ngành kiểm nghiệm thuốc và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

1.4.1 Khái niệm

Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoạc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc kí lỏng dựa

trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lí do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực

thực phẩm, dược phẩm, môi trường,…

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc kí

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí và loại sắc kí Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc kí trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc

kí phân bố hay sắc kí chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc kí gel hay sắc kí rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C,… vào cột phân tích, kết quả là các chất A,B,C,… sẽ được tách ra khỏi nhau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng hợp các tương tác

Hình 1.5.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột nước trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1,F2,F3 Trong đó, F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây, F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy, với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau khi ra khỏi cột như hình 1.16

Hình 1.6 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B

1.4.3 Phân loại sắc kí hấp phụ

Quá trình sắc kí dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này có hai kiểu hấp phụ:

+ Sắc kí hấp phụ pha thường (Normal Phase: NP-HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

+ Sắc kí hấp phụ pha đảo (Reverse Phase: RP-HPLC): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Trong đó, sắc kí hấp phụ pha đảo được ứng dụng nhiều nhất vì có thể tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các vitamin, các thuốc hạ nhiệt, giảm đau,…

Hiện nay, chủ yếu chúng ta sử dụng loại sắc kí pha đảo (RP-HPLC)

1.4.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ

t0: thời gian lưu chết

trA: thời gian lưu chất A trB: thời gian lưu chất B

t’rB: thời gian lưu thực chất A t’rB: thời gian lưu thực chất B

Hình 1.7 Sắc kí đồ của chất A và chất B a) Thời gian lưu thực

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc kí đã chọn.Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

− Bản chất sắc kí của pha tĩnh

− Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

− Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

− Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động

b) Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

𝐾′ = 𝑡𝑅 − 𝑡0

𝑡𝑜Nếu K’ nhỏ thì 𝑡𝑅 cũng nhỏ và sự tách kém.Nếu K’ lớn thì peak bị doãng.Trên thực tế, K’ từ 1 – 5 là tối ưu

c) Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí, khi hai chất A và B

có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α

α = 𝐾′𝐵𝐾′𝐴với ( K’B > K’A) với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

Hình 1.8 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B

d) Số đĩa lí thuyết

Số đĩa lí thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định Mỗi đĩa lí thuyết trong cột sắc kí giống như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

− Đường kính và độ hấp phụ của pha tĩnh

− Tốc độ và độ phân cực của pha động

− Hệ số khuếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với mỗi điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lí thuyết của cột cũng được xác định

Số đĩa lí thuyết được tính theo công thức sau:

𝑅 = 2𝑡′𝑟𝐵− 𝑡′𝑟𝐴

𝑊𝐵 + 𝑊𝐴Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R=1,0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

f) Hệ số không đối xứng

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của mức trên sắc

kí đồ thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 chiều

cao peak

𝑇 = 𝑎

𝑏

Hình 1.9 Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải

quan tâm đến hệ số không đối xứng T

Khi T ≤ 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận

Khi T > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc kí để làm cho peak cân đối hơn theo các cách sau:

− Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến detector

− Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

− Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể

1.4.5.1 Bình đựng dung môi

Hiện nay máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100%

Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết

và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết nguyên chất

1.4.5.2 Bộ phận khử khí

Mục đích của bộ phận khử khí là nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn

sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

− Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

− Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì

có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc kí sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng đều cho kết quả phân tích sai

1.4.5.3 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc kí Bơm phải tạo áp suất khoảng 3000 – 6000 PSI hoặc 250 – 500 atm (1 atm = 0,98 bar) và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút Hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar.Máy sắc kí lỏng của chúng ta

hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar

1.4.5.4 Bộ phận tiêm mẫu

Đưa mẫu vào cột theo phương pháp không ngừng dòng chảy với dung tích là

5 – 10 µl Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler)

1.4.5.5 Cột sắc kí khí

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống HPLC

Cột pha tĩnh thông thuồng được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đương kính trong 1 – 10 mm, hạt chất nhồi cỡ ∅ = 5 − 10 𝜇𝑚 Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt

Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt sau: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion

1.4.5.6 Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là một bộ phận phát hiện các chất khi chúng

ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc kí đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

𝐴 = 𝑘 𝐶 Trong đó: A là tín hiệu đo được

C là nồng độ chất phân tích

k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp phụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện thế; độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết xuất;…

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại detector sau:

− Detector quang phổ tử ngoại từ 200 – 380 nm

− Detector quang phổ khả kiến (UV-VIS): từ 190 – 900nm

− Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên Đây là loại detector có độ chọn lọc cao nhất

− Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất

theo độ hấp thu cực đại của các chất

Sau khi phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra

giấy để hoàn thiện hồ sơ

1.4.6 Các bước tiến hành sắc kí

1.4.6.1 Chuẩn bị dụng cụ, máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng định kì để bảo đảm máy hoạt động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỉ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn UV,…đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra

Đặc biệt cột sắc kí phải được kiểm tra về số đĩa lí thuyết theo định kì hay khi

có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc kí

Ví dụ, sắc kí pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol, không rửa bằng nước còn sắc kí pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch

Tỉ lệ methanol : nước = 50 : 50 v/v cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng dẫn đến không thể dùng được

1.4.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc kí là loại tinh khiết dành cho HPLC Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích.Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng

tỉ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu lọc dung môi qua màng lọc 0,2 – 0,45 µm