NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ KINETIN ĐẾN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarnius officinalis L.) in vitro

Mẫu lá sau khi đã khử trùng được cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau để khảo sát sự tạo mô sẹo từ lá cây hương thảo.. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ KINETIN ĐẾN

SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI CÂY

HƯƠNG THẢO (Rosmarnius officinalis L.) in vitro

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ NGÂN HÀ Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ KINETIN ĐẾN

SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI CÂY

HƯƠNG THẢO (Rosmarnius officinalis L.) in vitro

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 06/2013

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, thầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

Cô Trần Thị Lệ Minh cùng Cô Tô Thị Nhã Trầm đã hết lòng giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Các bạn của lớp DH09SH, bạn Nguyễn Thị Nhật Lệ và Huỳnh Phước cùng các bạn làm đề tài trong bộ môn đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Ngân Hà

TÓM TẮT

Rosmarnius officinalis L (họ Lamiaceae), thường được gọi là hương thảo, một

loại cây bụi thường xanh lâu năm bắt nguồn từ khu vực Địa Trung Hải Hương thảo thường có ba chức năng cơ bản Thứ nhất, lá cây được sử dụng làm gia vị trong thực phẩm và đồ uống Thứ hai, tinh dầu có thể được thêm vào trong sản xuất mỹ phẩm Cuối cùng, là nguyên liệu chữa bệnh đường tiêu hóa, trong đó có tác động rất lớn trong chữa trị co thắt khác nhau như đau bụng thận và đường mật Là một loại cây có giá trị kinh tế về mặt khai thác và sử dụng Chính vì lẽ đó, chúng thôi thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của BA, NAA và Kinetin đến sự tạo mô sẹo và khả năng nhân chồi cây hương

thảo (Rosmarnius officinalis L.) in vitro”

Lá hương thảo được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến cảm ứng mô sẹo và khả năng tái sinh chồi Sau khi được khử trùng bằng HgCl2 0,1 %, NaOCl 25%, mẫu lá được cấy vào môi trường MS có bổ sung NAA, BA và Kinetin với nồng độ khác nhau Sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu lá tạo sẹo hiệu quả trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,7 mg/l NAA Môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng kết hợp với hàm lượng sucrose cao (60 g/l) đã thúc đẩy tạo mô sẹo tốt Khi tái sinh chồi từ mô sẹo, môi trường MS có chứa 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l NAA thích hợp để tạo chồi với tỷ lệ tái sinh chồi cao Chồi hình thành tốt trên môi trường nhân chồi từ đốt thân MS có bổ sung 0,5 mg/l BA Ngoài ra, HgCl2 0,1% thích hợp để khử trùng mẫu cho tỷ lệ mẫu sống cao

SUMMARY

Rosmarinus officinalis L (Family Lamiaceae), which is known as Rosemary, is

a kind of perennial evergreen shrub It originates in Mediterranean region R officinalis L usually has three basic functions as raw materials Firstly, it is used as spice products in food and beverage Secondly, the essential oil can be added into cosmetic production Lastly, the plant or the essential oil is the materials of gastrointestinal ailments, which has great effect in various spasmodic conditions such

as renal and biliary colic It’s a kind of economic plant that has prosperous exploiting and utilizing value Therefore, Rosemary is the explants in this research “Effect of BA, NAA and Kinetin to callus induction and shoot propagation from Rosmarinus officinalis L in vitro”

Leaves were used as explants in the study to investigate factors affecting callus induction and plant regeneration Leaf explants were surface sterilized with HgCl2 0.1

%, NaOCl 25% Followed, surface sterilized leaf explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium with different concentrations of NAA, BA and Kinetin Callus was efficiently induced when leaf segments were cultured on MS medium supplemented with BA 0.5 mg/l and NAA 0.7 mg/l after 4 weeks It was found that the culture medium with higher concentration of sucrose (60 g/l) promoted callus induction When regenerated callus developed shoots, MS medium containing BA 1.5 mg/l, Kinetin 0.5 mg/l and NAA 0.5 mg/l showed good regeneration rate result The induction of multiple shoots from nodal segments was the highest in MS medium supplement with BA 0.5 mg/l Additionally, the study also showed that the explants were sterilized with HgCl2 would result well

Keyword: Rosmarinus officinalis L., callus, shoot, induction, regeneration, in vitro

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) 3

2.1.1 Đặc điểm sinh học của cây hương thảo 3

2.1.2 Giá trị và tác dụng của cây hương thảo 4

2.1.3 Một số công trình nghiên cứu 5

2.2 Nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô 6

2.2.1 Khái niệm phương pháp nuôi cấy mô 6

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật 6

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 6

2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 7

2.2.2.3 Nuôi cấy phôi 7

2.2.2.4 Nuôi cấy tế bào đơn 7

2.2.2.5 Nuôi cấy protoplast 8

2.2.2.6 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 8

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 8

2.2.3.1 Sự lựa chọn mẫu cấy 8

2.2.3.2 Môi trường nuôi cấy 9

2.2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 13

2.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào thực vật 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.3Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng, thời gian khử trùng mẫu cấy 15

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo lá 16

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của sucrose đến khả năng tạo mô sẹo lá 17

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA và Kinetin đến khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá 17 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đốt thân non 18

3.4 Phương pháp xử lí số liệu 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng, thời gian khử trùng mẫu cấy 19

4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo lá 22

4.3 Ảnh hưởng của sucrose đến khả năng tạo mô sẹo lá 25

4.4 Ảnh hưởng của BA, NAA và Kinetin đến khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá 27

4.5 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đốt thân non 29

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

HgCl2 Thủy ngân chlorua

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng chất khử trùng, thời gian khử trùng đến sự vô trùng mẫu lá 16

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA, NAA đến khả năng tạo mô sẹo lá hương thảo 16

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của sucrose đến khả năng tạo sẹo lá hương thảo 17

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA, NAA, Kinetin đến khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá 18

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đốt thân non cây hương thảo 18

Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng, thời gian khử trùng đến sự vô trùng mẫu lá 19

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của NAA, BA đến khả năng tạo sẹo từ lá cây hương thảo 22

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sucrose đến khả năng tạo sẹo từ lá cây hương thảo 25

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA, NAA và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 27

Bảng 4.5 Tạo chồi cây hương thảo từ đốt thân non cây hương thảo 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1Rosmarinus officinalisL 3

Hình 4.1Mẫu lá cây hương thảo nuôi cấy sau khi khử trùng 20

Hình 4.2 Mô sẹo lá cây hương thảo hình thành sau 30 ngày nuôi cấy 23

Hình 4.3 Mô sẹo lá cây hương thảo sau 20 ngày nuôi cấy 26

Hình 4.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo lá cây hương thảo 28

Hình 4.5 Chồi hương thảo hình thành từ đốt thân non cây hương thảo 30

Hình 4.6 Chồi hương thảo hình thành từ đốt thân có gốc thân phù sẹo 31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây hương thảo(Rosmarinus officinalis L.) thường được tìm thấy và ưa chuộng

ở các vùng biển, đặc biệt quanh vùng Địa Trung Hải Hiện nay, hương thảo xuất hiện

ở khắp các châu lục Là một giống cây mới du nhập vào Việt Nam, hương thảo mang giá trị kinh tế rất cao trong sản xuất cây làm cảnh với giá thành đắt đỏ Với nhu cầu ngày càng tăng trong chế biến thực phẩm, y tế, làm đẹp và chăm sóc sức khỏe, hương thảo không chỉ được tăng cường trong công nghiệp chế biến, mà còn được gia tăng canh tác hiệu quả và chất lượng trong trồng trọt Vì thế, trong nhân giống cây hương thảo đòi hỏi chất lượng cao hơn để tạo nguồn nguyên liệu ổn định cho sản xuất.Thông

thường, có ba phương pháp nhân giống: bằng hạt giống, cắt cành và nhân giốngin

vitro Tuy nhiên, tỷ lệ hạt giống nảy mầm là khá thấp (khoảng 13%) và cắt cành không

phải dễ dàng để tạo cành giâm có sức sống tốt Cho dù cành giâm có tỷ lệ sống cao thì vẫn không cung cấp đủ cây con cho diện tích trồng lớn (Chen và Kang, 2009) Theo kết quả điều tra, trên địa bàn tỉnh Hà Giang, thị trường tiêu thụ dược liệu trong những năm gần đây là khá sôi nổi, với nhiều chủng loại khác nhau trong đó có hương thảo Trên cơ sở hành lang pháp lý cho các doanh nghiệp, các nhà khoa học định hướng phát triển các loài cây dược liệu, hỗ trợ việc xây dựng thương hiệu, quảng bá sản phẩm tìm thị trường tiêu thụ ổn định cho các loại cây dược liệu như đối với cây hương thảo, Thảo quả tập trung xuất khẩu sang Trung Quốc, phục vụ cho tiêu dùng trong, ngoài tỉnh Là một loại cây mang nhiều giá trị kinh tế, hương thảo sẽ là nguồn nguyên liệu mới, mở ra những hướng đi mới trong các nghiên cứu ứng dụng cao về nhiều lĩnh vực

Vì vậy, hương thảo trở thành đối tượng nuôi cấy mô in vitro trong nghiên cứu

này Mô lá trải qua quá trình phản phân hóa trở thành mô sẹo, sau đó tái sinh thành chồi con và cuối cùng phát triển thành cây hoàn chỉnh Kĩ thuật này cho phép tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào trong canh tác quy mô lớn và cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm và đặc biệt là trong y dược học

1.2 Yêu cầu

Theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu của quá trình khử trùng mẫu cấy

Xác định được tỷ lệ chất điều hòa sinh trưởng tối ưu cho sự cảm ứng mô sẹo Xác định được tỷ lệ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp để tái sinh chồi

1.3 Nội dung thực hiện

Tiến hành khử trùng mẫu lá hương thảo bằng NaOCl 25% và HgCl2 0,1% để tạo nguồn mẫu sạch cho thí nghiệm sau

Mẫu lá sau khi đã khử trùng được cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau để khảo sát sự tạo mô sẹo từ lá cây hương thảo

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của sucrose đến khả năng tạo sẹo từ lá cây hương thảo trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác nhau

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá cây hương thảo

Tiến hành tạo chồi từ đốt thân non cây hương thảo trên môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)

2.1.1 Đặc điểm sinh học cây hương thảo

Giới (Kingdom): Plantae

Họ (Family): Lamiaceae

Bộ (Tribe): Asterids

Bộ phụ (Subtribe): Lamiales

Chi (Genus): Rosmarinus

Loài (Species): R officinalis

Tên thường gọi: Cây hương thảo (Rosemary)

Hình 2.1Rosmarinus officinalis L

(Köhler's Medicinal Plants, 1887)

Theo Kohler (1887) trong cuốn cây cỏ làm thuốc: Cây hương thảo (Rosmarinus

officinalis L.) xuất xứ từ vùng Địa Trung Hải, là dạng cây thân gỗ, thẳng đứng có phân

cành, chiều cao cây có thể đạt từ 1,5 - 2 m Lá thường màu xanh ở trên, phần dưới lá trắng giống như có lớp phấn lốm đốm bao phủ, chiều dài lá 2 - 4 cm và rộng 2 - 5 mm Hoa có màu trắng, hồng, tím hoặc màu xanh Hương thảo mọc thành bụi, lá kim và xanh quanh năm, thường nở hoa vào 2 mùa xuân và hạ Hương thảo nở hoa nhỏ li ti màu tim tím, xinh xắn nhẹ nhàng như tên gọi “hương thảo” Cây thuộc họ bạc hà, mùi thơm thoang thoảng hương cay Cây hương thảo dễ trồng và chăm sóc Đất trồng hương thảo đòi hòi phải tơi xốp, thoát nước, tốt nhất là trồng trên đất pha cát Cây thích hợp trồng ở nơi có nhiều ánh sáng (ít nhất phải có 6 - 8 giờ có ánh sáng mặt trời), phát triển mạnh trong môi trường ấm, ẩm và không thể chịu được nhiệt độ quá lạnh (hương thảo không thể chịu được mùa đông dưới -10C) Cây có khả năng chịu hạn nhưng không chịu được úng nước Ngoài ra, hương thảo mới trồng cần được tưới nước thường xuyên trong tuần đầu tiên hoặc tuần thứ 2 để giúp nó phát triển, nhưng sau khi

đã thích nghi, cây cần tưới ít nước hơn Trong giai đoạn phát triển, cây có thể chịu được điều kiện khô hạn trong một thời gian dài Cây thường bị thối rễ và sẽ chết khi đất trồng quá ẩm ướt Do đó, ở những nơi trồng hương thảo, người ta thường chọn

cách trồng cây trong các thùng, khay hoặc chậu Cây trồng trên các vật dụng này có thểđặt cách mặt đất một khoảng không gian để cây có thể thoát nước nhanh khi tưới, không duy trì độ ẩm cao dưới rễ cây và khi mùa đông đến có thể dễ dàng di chuyển vào nơi tránh lạnh

2.1.2 Giá trị và tác dụng của cây hương thảo

Giá trị văn hóa và tinh thần: Hương thảo nói đến lòng trung thành, tình yêu và trí nhớ, tượng trưng cho tình yêu phụ nữ vững bền, mạnh mẽ dù rằng tình yêu đến rất chậm.Ngày xưa, các chàng trai Hy Lạp thường tặng lá hương thảo cho người mình yêu Hiện nay, tại Anh cũng như tại một vài xứ ở châu Âu, cô dâu trong ngày cưới vẫn còn dắt lên tóc lá hương thảo Các bác sĩ thời La Mã khuyên bệnh nhân buộc một bó hương thảo đặt dưới gối khi cần phải quyết định, suy nghĩ những việc khó khăn Từ thời xưa, người cổ đại của nhiều nền văn hóa khác nhau coi hương thảo là một loại cây thiêng liêng, có thể kết nối sự sống và cái chết Người Hy Lạp và người La Mã đốt lá hương thảo tại các đền thờ và xem hương thảo như là biểu tượng của sự tri ân và ghi nhận lòng trung thành Trong suốt thời Trung Cổ, người ta đeo vòng hoa hương thảo

để mang lại may mắn và bảo vệ họ khỏi những linh hồn ma quỷ, ma thuật và phù thủy Hương thảo cũng giúp bảo vệ chống lại bệnh dịch và các bệnh truyền nhiễm Người Anh đeo hương thảo xung quanh cổ họ để ngăn ngừa cảm lạnh hoặc bao bọc xung quanh cánh tay phải họ để nâng cao tinh thần Ở Hoa Kỳ, nhiều người thường trồng hương thảo trong sân vườn gia đình vừa để làm cảnh, vừa để sử dụng như một loại gia

vị cho các món ăn

Sử dụng nấu ăn: Ngày nay, hương thảo là một loại thảo dược ẩm thực phổ biến được sử dụng trong nhiều món ăn ngon Lá tươi và khô thường được sử dụng trong các món ăn truyền thống ở Địa Trung Hải Trong cây hương thảo có hương vị cay, se và rất thơm, được bổ sung vào nhiều loại thực phẩm Khi bị đốt cháy, lá cây tạo ra một mùi mù tạt riêng biệt, mùi tương tự như gỗ đốt, có thể được sử dụng làm gia vị để ướp thực phẩm khi làm món nướng

Sử dụng trong y học: Hương thảo là một loại thảo dược có nhiều công hiệu với sức khỏe Cây được sử dụng như một loại thuốc đông y với các tác dụng chống viêm, chống béo phì, điều trị bệnh đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa, chống lại tình trạng co giật cơ dẫn đến co rút các bắp thịt sau mỗi lần gắng sức tập thể thao, làm ấm cơ thể, giúp cân bằng trí óc, giảm căng thẳng, làm tươi mát không khí và còn có tác dụng chống muỗi

Hương thảo chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm chất chống oxy hóa, chẳng hạn như axit carnosic và axit rosmarinic Các hợp chất hoạt tính sinh học khác bao gồm long não (lên đến 20% trong lá hương thảo khô), axit caffeic, axitursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol và rosmanol

Kết quả của một nghiên cứu cho thấy carnosic axit, được tìm thấy trong lá hương thảo, có thể bảo vệ não khỏi nguy cơ giảm trí nhớ, giảm nguy cơ đột quỵ và các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và teo cơ Cây hương thảo còn có đặc tính chống ung thư Một nghiên cứu khi tiến hành sử dụng dạng bột của lá hương thảo trên các con chuột thí nghiệm trong hai tuần cho thấy làm giảm sự tác động của một chất gây ung thư nhất định tới 76%, và giảm đáng kể sự hình thành các khối u vú

2.1.3 Một số công trình nghiên cứu trên đối tượng cây hương thảo

Trong công nghiệp thực phẩm, các loại tinh dầu từ thực vật tự nhiên, thường được sử dụng như là gia vị và phụ gia chống ăn mòn Năm 2003, kết quả nghiên cứu của Djenane và cộng sự đã cho thấy rằng chiết xuất của hương thảo kết hợp với vitamin C sẽ xuất hiện sự kháng oxy hóa mạnh mẽ Ngoài ra, hương thảo có thể được

sử dụng để bảo tồn đất và nước, cảnh quan thành phố và gia đình Năm 2006, Zhang

và cộng sự thực hiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tăng hệ số nhân giống nhanh chóng

hương thảo (Rosemarinus officinalis L.) Một phòng nuôi cấy mô ở Ấn Độ đã nghiên

cứu vi nhân giống hương thảo Vì vậy, nó là một loại cây có thể khai thác và sử dụng mang lại kinh tế cao (Li và cộng sự, 2006) Vào năm 2008, Rasooli và cộng sự đã chứng minh rằng các sản phẩm tự nhiên của hương thảo có thể ức chế sự aflatoins gây hại cho con người và vật nuôi được sản xuất bởi aspergillus flavus Trong lúc đó, Papageorgiou và cộng sự (2008) đã tiến hành khảo sát các hợp chất (như Phenolic, Flavonoid, Piperitone, alpha-pinen, Limoene và 1,8-cineole) của hương thảo có trong từng bộ phận khác nhau thu hoạch và thời gian thu hoạch, đặc biệt là trong giai đoạn

ra hoa Năm 2010, Gómez-Estaca và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về tính kháng khuẩn của tinh dầu hương thảotrên 18 loại vi khuẩn, kết quả cho thấy nó có

chức năng kháng khuẩn

Vào năm 2011, Rosa và cộng sự đã sử dụng chiết xuất ethanol từ hương thảo để nghiên cứu hoạt động chống co thắt trong mối quan hệ với chuyển đổi kênh canxi ở hồi tràng chuột Trong khi đó, Omri và cộng sự (2011) tiến hành tìm hiểu sự biểu hiện của nucleoside diphosphate kinase (NDPK) và protein sốc nhiệt (HSP) được điều

khiển bởi luteolin, acid carnosic, và acid rosmarinic Thật thú vị, kết quả nghiên cứu tinh dầu từ hương thảo có khả năng giết con ve được Martinez-Velazquez và cộng sự thực hiện vào năm 2011 Cùng năm này, Zegura và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất chống oxy hóa, antigenotoxic chiết xuất từ hương thảo trên Salmonella typhimurium TA98 và tế bào HepG2

2.2 Nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô

2.2.1 Khái niệm phương pháp nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không

bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay

mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

Nuôi cấy tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa cực kì quan trọng trong phát triển công nghệ sinh học Khi tiến hành các kĩ thuật chuyển gen tạo ra các giống mới cũng như tìm cách nhân nhanh các giống mới đó, đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy tế bào thực vật Sự phát triển kĩ thuật này đến nay đã góp phần quyết định vào sự thành công của công nghệ sinh học thực vật (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào thực vật

là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên)

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy

đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

Mẫu được đưa vào nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh, đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng, ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2.3 Nuôi cấy phôi

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong đất và nhân được cây nhưng là cây lùn Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom Raghavan (1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Auxin thường dùng ở nồng độ thấp Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi (Dương Công Kiên, 2002)

Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển

của phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn

phôi phát triển tự nhiên

2.2.2.4 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn Với các

cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng,

tế bào được tách ra và trải lên trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ

lệ auxin/cytokinin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2.5 Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh nhờ vào tính toàn thế ở thực vật Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2.6 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội (Dương Công Kiên, 2002) Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đẫ phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu trên cây thuốc lá (Bourgin và Nitsch, 1967) và cây lúa (Niixeki và Ono, 1968) Kết quả nghiên cứu cho thấy cây đơn bội được tạo ra từ việc nuôi cấy túi phấn hoặc hạt phấn theo 2 cách: phôi phân hóa trực tiếp từ hạt phấn và phát triển thành cây hoàn chỉnh (trực tiếp) hoặc hạt phấn phải qua giai đoạn mô sẹo sau đó hình thành phôi hay chồi bất định rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh (gián tiếp) Việc tạo ra thể đơn bội rồi sau đó nhân đôi nhiễm sắc thể của các thể đơn bội để tạo ra các cá thể nhị bội đồng hợp tử giúp rút ngắn thời gian trong các quá trình di truyền và chọn giống

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.2.3.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách, chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn

mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái

sinh rất tốt Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy in vitro phải có tỷ lệ lớn mô phân sinh

hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thế (Dương Công Kiên,

2002) Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gene, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

Kiểu gen: Ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được,

sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi

Chọn cơ quan: Hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi

cấy in vitro (Murashige, 1974) Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác

nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, còn theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt

Tuổi và sinh lý: Tuổi thật của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý Thành

phần cơ quan có cấu tạo thấp không thể nuôi cấy in vitro do không thể sử dụng thành

phần khoáng trong môi trường

2.2.3.2 Môi trường nuôi cấy

Công thức môi trường của Murasighe và Skoog (1962) là thích hợp cho các

trường hợp nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy để tạo chồi nách thường yêu cầu

nồng độ tương đối thấp của auxin và cytokinin Trong khi để tạo chồi bất định, môi trường nuôi cấy cần nồng độ cytokinin cao và thêm một lượng auxin thích hợp Để tạo

mô sẹo cần nồng độ cao auxin kết hợp với nồng độ thấp của cytokinin trong môi trường nuôi cấy

Sự lựa chọn môi trường rắn hay môi trường lỏng là thất cần thiết Agar đỡ cây

và cho phép sự thoáng khí, nhưng có thể làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm để hấp thu dinh dưỡng Có thể sử dụng môi trường lỏng trên máy lắc khoảng 30 vòng/phút hay sử dụng môi trường lỏng với dung tích nhỏ trong bình chứa có ác hoặc không lắc Môi trường lỏng có thể là giai đoạn cần thiết trong quá trình nhân giống vô tính Việc cảm ứng phôi dinh dưỡng từ các tế bào nuôi cấy sinh ra do mô sẹo được thực hiện trong môi trường lỏng có khuấy (Steward, 1958; Brown, 1976); đây cũng là trường hợp của hoa cẩm chướng, các cây con cẩm chướng sinh ra từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trong môi trường lỏng có khuấy sẽ thu được các chồi nách (Dương Công Kiên, 2002)

 Chất kích thích sinh trưởng thực vật

 Auxin

Auxin là thuật ngữ đại diện cho những hợp chất được đặc tính hóa bởi khả năng gây ra sự vươn dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh và giống như indole-3-acetic

acid (IAA) trong hoạt động sinh lý Trung tâm tổng hợp của auxin là ở các mô phân sinh, lá non, mầm hoa, hột đang phát triển, một lượng rất ít auxin được di chuyển đến các cơ quan Ngày nay, bên cạnh IAA nội sinh còn có nhiều auxin được tổng hợp với nhiều mục đích khác nhau Auxin tổng hợp là những hợp chất có hoạt tính tương tự như IAA, nhưng không hoàn toàn tương tự về cấu trúc

Auxins có thể được chia thành 6 nhóm sau:

Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA) Những benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6-

dichlorobenzoic acid (Dicamba)

Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)

và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay

Pichloram).Những naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β-NAA)

Những naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β-NOA)

IAA, NAA, IBA được dùng cho sự tượng rễ và sự đậu trái Những phenoxyacetic acid đặc biệt như 2,4-D và 2,4,5-T đã được dùng rất phổ biến để làm thuốc trừ cỏ lá rộng trong nhiều năm qua mặc dù hiện nay đã hạn chế và không sử dụng

Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây Vài ảnh hưởng quan trọng của auxin điều hòa các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sau:Vươn dài tế bào, quang hướng động, địa hướng động,ưu thế chồi ngọn, hình thành rễ IAA kích thích sự tượng rễ của cành giâm đã cho thấy khả năng ứng dụng trong thực tiễn Kích thích sản sinh ethylene gây ra do auxin được ghi nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wilcoxon (1935) Ngày nay, auxin đã được biết là chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự sinh tổng hợp ethylene trên nhiều loài thực vật như đậu xanh, lúa,

cỏ lồng vực…Auxin có liên quan đến sự nở rộng của tế bào và đóng vai trò cơ bản trong việc quyết định sự phát triển của trái Ví dụ ở dâu tây, nội phôi nhủ và phôi trong

bế quả sản xuất auxin, nó di chuyển ra ngoài và kích thích sự sinh trưởng Ở một số loài cây, việc xử lý auxin có thể làm thay đổi giới tính của hoa Khi xử lý auxin ngoại sinh đã làm tăng số lượng hoa cái trên họ bầu bí Đồng thời, các nghiên cứu của khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã ghi nhận được rằng auxin ngoại sinh làm tăng số lượng hoa đực trên chôm chôm

Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi của cây mẹ, vị trí thu mẫu cây, thời gian thu mẫu trong năm, khả năng tổng hợp auxin của mẫu cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Ngoài ra, auxin còn có những ảnh hưởng khác như ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái (sự tạo chồi hay rễ), ảnh hưởng lên phát sinh phôi soma Nồng độ của auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích

sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

 Cytokine

Cytokine là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (6-furfurylaminopurine) Hiện nay, nhiều cytokine tổng hợp được biết Có 3 chất thông dụng là kinetin (6-furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine), và BPA (6-benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) Cytokine có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng phát triển có hiệu quả liên tục bao gồm rễ, lá non, trái đang phát triển và hạt Cytokine ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và tạo thành cơ quan Vai trò chính của cytokine trong cây là kích thích sự phân chia tế bào Callus có thể được tạo thành ban đầu chỉ cần auxin hoặc cytokine riêng lẽ Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin và cytokine tỏ ra cần thiết Tỉ lệ auxin/cytokine sẽ ảnh hưởng lên sự tạo callus, rễ hay chồi Cytokine kích sự nảy mầm, sự mở rộng của tế bào

và cơ quan Kinetin có thể giúp hạt rau diếp nảy mầm vượt qua ảnh hưởng ức chế của ánh sáng đỏ xa Cytokine kích thích sự mở rộng tế bào trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí rợ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác và có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý Trong sự phát triển

nụ và chồi: Cytokine có khả năng kích thích chồi bên tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn Cytokine trì hoãn

sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển các chất dinh dưỡng và những hợp chất hữu cơ, giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm sự lão hóa

 Gibberelline (GA)

Gibberelline là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật kích thích sự phân chia tế bào hoặc sự vươn dài tế bào Ngoài ra chúng còn có những chức năng điều hòa khác tương tự như gibberellic acid (GA3) GA3 là gibberelline được thương mại hóa đầu tiên và đã được dùng cho một hệ thống sinh trắc nghiệm chuẩn Chính vì vậy nó được xem như là chất đại diện cho 136 gibberelline đã được phát hiện Gibberelline ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hạt, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa

 Ethylen

Ethylen là một hydrocarbon không no đơn giản, nó kích thích sự chín của trái Ethylen có cấu trúc đơn giản nhất so với những chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã biết Ethylen cũng đóng một vai trò thiết yếu trong sự chín của trái đã già của trái Quá trình rụng rất quan trọng trong nông nghiệp bởi vì sự rụng hoặc không rụng của hoa, trái và lá ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả của quá trình thu họach Ethylen được xem là có vai trò tự nhiên trong việc điều hòa tốc độ rụng Ethylen cũng có liên quan đến quang hợp, hô hấp, vận chuyển, miên trạng, sự nẩy mầm của hạt, nhú chồi, ưu thế chồi ngọn, sinh trưởng tế bào, nuôi cấy mô, thành lập phôi, sự nghiêng, sự khởi sinh

rễ, những cơ quan dự trữ, sự thành lập gỗ, sự ức chế mầm hoa, sự phát triển giới tính, địa hướng động, sự rỉ nhựa và sự thành lập nhựa mủ của cây

 Chất ức chế sinh trưởng thực vật

 Abscisic acid (ABA)

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định Trong nuôi cấy tế bào thực vật, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật (Dương Công Kiên, 2002)

 Các chất ức chế có thành phần phenol

Các chất này có rất nhiều ở thực vật, chúng là các chất ức chế sự chuyển hóa, chúng sẽ can thiệp trong nhiều quá trình hoặc như là các chất đối kháng của các chất tăng trưởng, hoặc như là chất ức chế của các phản ứng chuyển hóa Các chất này sẽ

tham dự vào hiện tượng ngủ của các chồi non hoặc các mầm giống, ít nhất bởi sự làm chậm, kế đến sự làm ngừng tăng trưởng mà chúng đã gây ra, kế tiếp hoạt động chúng rất biết Người ta cũng không biết có phải các chất này có tham gia vào hiện tượng ngủ của cây nói theo một cách đặc biệt nào đó

Trong nuôi cấy in vitro, các chất phenol đôi lúc được phóng thích ra trong môi

trường nuôi cấy và gây ra hiện thượng oxy hóa, chất này đã gây ra hiện tượng hóa nâu cho môi trường và thường dẫn đến sự chết của các mô thực vật Chính vì vậy, trong một vài sự nuôi cấy, người ta thường sử dụng các chất chống oxy hóa hoặc các chất hấp thụ để khử độc môi trường nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.3.3 Điều kiện nuôi cấy

 Ánh sáng

Mẫu cấy ở trên môi trường chứa một nguồn năng lượng sẵn có là đường, sử dụng ít hay nhiều là tùy khả năng quang hợp của cây Tuy nhiên, nhiều nghiện cứu cho

thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng tạo hình cây nuôi cấy in vitro Ánh sáng

đỏ và xanh của quang phổ ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro Các công trình nghiên

cứu đáng lưu ý của Seibert (1975), chứng tỏ là trên mô sẹo thuốc lá thì cần ánh sáng xanh (giải phổ giữa khoảng 467 nm) hoặc tím (giải phổ giữa khoảng 419 nm) kích thích việc tạo chồi và ánh sáng đỏ (giải phổ 660 nm) cảm ứng việc sinh tạo rễ Cũng như các ông trình nghiên cứu khác cho thấy quá trình sinh tạo hình thể của thực vật dường như được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các chất khác Như vậy, người ta sẽ có lợi nếu trộn hai loại đèn huỳnh quang: một loại có nhiều tia xanh hơn, còn loại kia có nhiều tia đỏ (Dương Công Kiên, 2002)

Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000 lux Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ ánh

sáng tăng khoảng từ 3000 lux đến 10000 lux

 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in

vitro Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây trồng trong khoảng 20 - 250C Bởi vì nhiệt độ thật của các mô trong bình nuôi có thể cao hơn từ 2 đến 40C đối với nhiệt độ của phòng nuôi cấy nên thông thường người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy thấp hơn 20C đối với nhiệt độ người ta muốn cho mô cấy

 Môi trường in vitro

Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy,

có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển hình thái của cây in vitro Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức quang hợp thấp, không cân bằng CO2, mức hấp thu và

vận chuyển chất dinh dưỡng hạn chế…Vì vậy, cây con in vitro thường sinh trưởng

chậm, xuất hiện biến dị về hình thái và chất lượng mẫn cảm với stress ở giai đoạn

thuần hóa Do đó cần kiểm soát môi trường in vitro để điều khiển sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật Một cải tiến cần thiết để nâng cao chất lượng và hạ thấp chi phí

sản xuất cây in vitro là kiểm soát môi trường cho thực vật sinh trưởng theo con đường

quang tự dưỡng (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ được hình thành từ đầu thế

kỉ XX, nhưng đã đóng góp nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực chọn giống, nghiên cứu tính di truyền của thực vật, cơ chế sinh tổng hợp thực vật, vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nhiều vấn đề cơ bản khác Ở nước ta, nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật mới chỉ bắt đầu từ năm 1975 nhưng đã gặt hái nhiều thành tựu không nhỏ trong chọn giống và nhân giống cây trồng trong nông nghiệp với những loại cây quan trọng như: mía, lúa, cà phê, khoai tây Đến nay không ai còn lạ với chuối, phong lan nuôi cấy mô và hàng trăm giống cây trồng đã hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy

Ngày nay, nuôi cấy tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học Thật vậy, khi tiến hành các kĩ thuật chuyển gen để tạo ra giống cây trồng mới đều cần đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Ba ứng dụng chính của kỹ thuật nuôi cấy

tế bào thực vật là:

Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn

Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

Tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại bỏ virus, vi khuẩn từ cây mẹ bị nhiễm bệnh)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 5/2013, tại Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Nông Lâm, tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Cây hương thảo (Rosemarinus officinalis L.)

Thiết bị và dụng cụ:

Thiết bị: Máy đo pH, cân điện tử, tủ hấp, tủ sấy, tủ cấy, máy nước cất…

Dụng cụ: Pence, dao, kéo, đèn cồn, đĩa petri, chai thủy tinh …

Hóa chất: NaOCl, HgCl2, chất điều hòa sinh trưởng (BA, NAA, kinetin)

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 25 phút

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng, thời gian khử mẫu đối với sự vô trùng mẫu lá cây hương thảo

Mục đích: Xác định loại chất khử trùng, thời gian khử mẫu thích hợp cho quá trình khử trùng lá hương thảo

Cách tiến hành: Mẫu lá được cắt từ cây hương thảo trồng tại vườn ươm, ngâm rửa trong nước xà phòng loãng 15 phút Trước khi đưa vào tủ cấy, mẫu lá được rửa sạch lại với nước rồi đặt dưới vòi nước chảy nhỏ trong 15 phút Trong tủ cấy, mẫu được khử trùng bằng cồn 700 trong vòng 30 giây, tiếp sau rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó, mẫu được khử trùng bằng NaOCl 25% hoặc HgCl2 0,1% theo từng nghiệm thức được bố trí trong bảng 3.1 và rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5 lần

Cách cắt mẫu: Mẫu lá sau khi khử trùng sẽ được loại bỏ các phần tổn thương do quá trình khử trùng mẫu Sau đó mẫu lá được cắt với kích thước 3 x 10 mm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 24 mẫu, 1 bình 8 mẫu

Bảng 3.1 Khảo sát chất khử trùng, thời gian khử trùng đến sự vô trùng mẫu lá hương thảo

Chỉtiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sạch (%), tỷ lệ mẫu sống (%) của mẫu cấy lá hương thảo

Mẫu sạch là mẫu không bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm sau 30 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ mẫu sạch = (số mẫu lá sạch/tổng số mẫu lá ban đầu cấy vào môi

trường) x 100%

Tỷ lệ mẫu sống = (số mẫu lá sạch và sống/tổng số mẫu lá ban đầu cấy vào

môi trường) x 100%

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo lá hương thảo

Mục đích: Xác định khả năng tạo mô sẹo lá hương thảo trên môi trường MS bổ

sung nồng độ BA, NAA khác nhau

Cách tiến hành: Mẫu lá sau khi đã khử trùng được cắt thành những mẫu nhỏ

có kích thước 3x10 mm Sau đó, mẫu lá được cấy trên môi trường MS có bổ sung

BA và NAA với nồng độ khác nhau theo từng nghiệm thức được bố trí trong bảng

3.2 Việc nuôi cấy được duy trì trong điều kiện tối và ở nhiệt độ 25oC ± 2oC Thời

gian theo dõi mẫu cấy trong 30 ngày

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 12 mẫu

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA, NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá hương thảo

Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút)