NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KẾT TINH CAROTENOID TỪ DẦU GẤC

Với mục tiêu nghiên cứu khả năng chiết tách Carotenoid bằng phương pháp kết tinh kết hợp với phản ứng xà phòng hóa, đề tài đã đạt được những kết quả sau: Dầu gấc nguyên liệu có hàm lượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KẾT TINH CAROTENOID

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KẾT TINH CAROTENOID

TỪ DẦU GẤC

TÁC GIả

NGUYỄN THỊ TRANG – DƯƠNG THỊ VÂN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành

Công Nghệ Hóa Học

Giáo viên hướng dẫn:

Th.S Mai Huỳnh Cang

Tháng 08 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Kính gửi đến các thầy cô trong Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành vì đã tận tình truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức quí giá trong quá trình học tập, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để chúng tôi thực hiện đề tài một cách tốt nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Mai Huỳnh Cang, giảng viên Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên chúng tôi, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã nuôi dạy con khôn lớn để con có được thành quả như ngày hôm nay

Cuối cùng, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong lớp DH09HH đã giúp

đỡ chúng tôi trong thời gian chúng tôi thực hiện đề tài

Thành phố hồ chí minh, tháng 8/2013

Sinh viên thực hiện

Dương Thị Vân

Nguyễn Thị Trang

TÓM TẮT

Đề tài” Nghiên cứu chiết xuất và kết tinh Carotenoid từ gấc” được thực hiện tại phòng thí nghiệm I4 thuộc Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2013

Với mục tiêu nghiên cứu khả năng chiết tách Carotenoid bằng phương pháp kết tinh kết hợp với phản ứng xà phòng hóa, đề tài đã đạt được những kết quả sau: Dầu gấc nguyên liệu có hàm lượng Carotenoid tổng là 7,274±0.014 mg/g; tỷ trọng của dầu gấc:0,918± 0.0043g/ml

Carotenoid từ dầu gấc qua quá trình xà phòng hóa gấp 110,3 lần so với dầu gấc nguyên liệu với các yếu tố phù hợp: Loại kiềm sử dụng là KOH trong cồn với nồng

độ 40% và các thông số tối ưu của các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ là:

30 oC và thời gian cho phản ứng là: 25 phút

Và hàm lượng carotenoid qua quá trình kết tinh đạt 94.59 % Với các yếu tố phù hợp là: Tốc độ khuấy 500vòng/phút, nhiệt độ là 75 o C và thời gian cho phản ứng là 2giờ

Titled "Research and crystallization Carotenoids extracted from Gac" is done in the laboratory of the I4 Chemical Engineering, City University of Agriculture and Forestry Ho Chi Minh, the period from March to August 2013

With the aim of studying the possibility of Carotenoids extraction method in combination with crystalline saponification reaction, the subject has achieved the following results:

Gac oil materials have total carotenoid content of 7.274 ± 0.014 mg/g, the proportion of Gac oil: 0.918 ± 0.0043g/ml

Carotenoids from Gac oil through saponification process were 110.3 times higher than raw Gac oil with the appropriate factors: type of alkaline was potassium hydroxide which was used in a concentration of 40% alcohol, and the optimal parameters of the external factors such as temperature of 30 °C and the reaction time of 25 minutes And carotenoid content through crystallization process was 94.59% With the relevant factors were: 500RPM stirring speed, the temperature of

75 °C and the reaction time of 2h

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

LỜI CẢM ƠN ii 

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v 

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix 

DANH SÁCH CÁC HÌNH x 

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Mục đích của đề tài 1 

1.3 Nội dung của đề tài 2 

1.4 Yêu cầu của đề tài 2 

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 3 

2.1 Tổng quan về cây gấc 3 

2.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây gấc 3 

2.1.1.1 Đặc điểm hình thái 3 

2.1.1.2 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố 6 

2.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học 6 

2.1.2.1 Cấu trúc quả gấc: 6 

2.1.2.2 Thành phần hóa học của quả gấc 7 

2.1.3 Dầu gấc 11 

2.2 Khái quát về carotenoid 12 

2.2.1 Khái niệm về carotenoid 12 

2.2.2 Đặc tính lý hóa của carotenoid 13 

2.2.2.1 Hấp thu ánh sáng 14 

2.2.2.2 Đồng phân hóa và sự oxi hóa 14 

2.2.3 β-carotene 14 

2.2.3.1 Cấu trúc hóa học 14 

2.2.3.2 Quá trình chuyển hóa vitamin A 15 

2.2.3.3 Tính chất hóa học và vật lý 15 

2.2.3.4 Tác dụng 15 

2.2.4 Lycopene 16 

2.2.4.1 Cấu trúc hóa học 16 

2.2.4.2 Công dụng 16 

2.3 Các nghiên cứu khoa học về gấc 17 

2.4 Tổng quan về các phương pháp chiết xuất carotenoid 17 

2.4.1 Tổng quan về phản ứng xà phòng hóa chất béo[17] 17 

2.4.2 Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 18 

2.4.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)[18] 19 

2.4.3.1 Khái niệm 19 

2.4.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 19 

2.4.3.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng 19 

2.4.4 Tổng quan về phương pháp kết tinh 20 

2.4.4.1 Định nghĩa 20 

2.4.4.2 Chọn dung môi 20 

2.4.4.3 Các thao tác khi kết tinh 21 

2.4.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký cột 22 

2.4.6 Phương pháp phổ UV-Vis dùng trong phân tích định lượng[20] 23 

CHƯƠNG 3 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24 

3.1 Nội dung nghiên cứu 24 

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 24 

3.1.2 Nội dung nghiên cứu chính 24 

3.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 24 

3.2.1 Nguyên liệu 25 

3.2.2 Thiết bị và hóa chất 25 

3.2.2.1 Thiết bị 25 

3.2.2.2 Hóa chất 25 

3.3 Phương pháp thí nghiệm 26 

3.3.1 Xác định thành phần đặc tính dầu gấc 26 

3.3.1.1 Xác định tỷ trọng của dầu gấc 26 

3.3.1.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng 26 

3.3.1.3 Chỉ số peroxyt 26 

3.3.1.4 Chỉ số xà phòng hóa 26 

3.3.1.5 Chỉ số axit 26 

3.3.2 Thí nghiệm 1: Xà phòng hóa 26 

3.3.2.1 Cách tiến hành 26 

3.3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xà phòng hóa 27 

3.3.2.3 Bố trí thí nghiệm 27 

3.3.3 Thí nghiệm 2: Kết tinh carotenoid 31 

3.3.3.1 Cách tiến hành ( Tài liệu tham khảo bằng sáng chế EP 1250322A1) 31 

3.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến thí nghiệm: 31 

3.3.2.3 Bố trí thí nghiệm 32 

3.4 Đánh giá sản phẩm 34 

3.5 Xử lý số liệu 34 

CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 

4.1 Thành phần, đặc tính hóa lý của dầu gấc 35 

4.1.1 Tỷ trọng của dầu gấc 35 

4.1.2 Hàm lượng carotenoid tổng 35 

4.1.3 Chỉ số peroxyt 36 

4.1.4 Chỉ số xà phòng hóa 36 

4.1.5 Chỉ số axit 36 

4.2 Thí nghiệm 1: Xà phòng hóa 37 

4.2.1 Ảnh hưởng của loại kiềm 37 

4.2.2 Tỷ lệ giữa lượng lượng kiềm (khan) và dầu gấc 38 

4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xà phòng hóa 39 

4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến quá trình xà phòng hóa 40 

4.3 Kết quả thí nghiệm 2: kết tinh carotenoid 41 

4.3.1 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến quá trình kết tinh 42 

4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh 43 

4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình kết tinh 44 

4.4 Tính toán giá thành sản phẩm 47 

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 

5.1 Kết luận 49 

5.2 Đề nghị 50 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 

PHỤ LỤC 54 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2-1: Tên gọi cây gấc theo các ngôn ngữ [4] 4 

Bảng 2-2: Hàm lượng β-caroten và lycopene trong quả gấc 8 

Bảng 2-3: Hàm lượng carotenoid của gấc và một số loại quả [5] 8 

Bảng 2-4: Thành phần dinh dưỡng của màng hạt gấc [8] 9 

Bảng 2-5: Thành phần các axit béo trong dầu gấc [11] 11 

Bảng 2-6: Thành phần carotenoid trong dầu gấc 17 

Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm loại kiềm 28 

Bảng 3-2: Bố trí thí nghiện tỷ lệ lượng kiềm khan và dầu gấc 28 

Bảng 3-3: Bố trí thí nghiệm nhiệt độ xà phòng hóa 29 

Bảng 3-4: Bố trí thí nghiệm thời gian xà phòng hóa 31 

Bảng 3-5: Bố trí thí nghiệm tốc độ khuấy 32 

Bảng 3-6: Bố trí thí nghiệm nhiệt độ kết tinh 33 

Bảng 3-7: Bố trí thí nghiệm thời gian kết tinh 34 

Bảng 4-1: Tỷ trọng dầu gấc 35 

Bảng 4-2: Hàm lượng carotenoid tổng trong dầu gấc nguyên liệu 35 

Bảng 4-3: Chỉ số peroxyt của dầu nguyên liệu 36 

Bảng 4-4: Chỉ số axit của dầu gấc nguyên liệu 36 

Bảng 4-5: Chỉ số axit của dầu nguyên liệu 37 

Bảng 4-6: Ảnh hưởng của loại kiềm (mg/g) 37 

Bảng 4-7: Bảng tính toán giá trị chi phí cho 100mg carotenoid 48 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1: Cây gấc 3 

Hình 2: Trái gấc 5 

Hình 3: Cấu tạo của quả gấc 7 

Hình 4: Công thức cấu tạo của α-tocopherol 9 

Hình 5: Một số sản phẩm từ dầu gấc 12 

Hình 6: Công thức cấu tạo của β-caroten 15 

Hình 7: Công thức cấu tạo của lycopene 16 

Hình 8: Phản ứng xà phòng hóa 17 

Hình 9: Các bước nghiên cứu của đề tài 24 

Hình 10: Dầu gấc 25 

Hình 11: Ảnh hưởng của tỷ lệ kiềm đến hàm lượng carotenoid thu được 38 

Hình 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xà phòng hóa 39 

Hình 13: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình xà phòng hóa 41 

Hình 14: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hàm lượng carotenoid 42 

Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh 43 

Hình 16: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình kết tinh 44 

Hình 17: Qui trình tách và kết tinh carotenoid 46 

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) spreng ) là loại thực vật thân dây leo

được trồng phổ biến ở Việt Nam Quả gấc được sử dụng nhiều trong ẩm thực lẫn trong

y học Đặc biệt là phần màng hạt gấc, thường được dùng để chế biến món ăn bởi mùi

vị thơm ngon và giàu các thành phần dinh dưỡng

Màng hạt gấc chứa một lượng dầu đáng kể Dầu chiết xuất từ màng hạt gấc có độ sánh đặc, trong có màu đỏ đậm, mùi thơm, vị ngọt, béo Dầu gấc chứa nhiều carotenoid, Vitamin E và các axit béo cần thiết yếu như lenoleic và α-linolenic rất tốt cho sức khỏe, giúp phòng chống thiếu vitamin, tăng khả năng miễn dịch, giúp tăng sức

đề kháng của cơ thể, chống oxi hóa, chống lão hóa tế bào, phòng ngừa bệnh tật, giúp loại bỏ các tác động có hại của môi trường như hóa chất độc, tia xạ… [1] Trong dầu gấc chứa hàm lượng carotenoid rất cao, gấp nhiều lần so với các loại rau quả giàu carotenoid khác, bao gồm β-carotene (cao gấp 15,1 lần cà rốt) và lycopene (cao gấp 68 lần cà chua) là những chất chống oxi hóa tự nhiên mạnh, bên cạnh đó β-carotene còn

là tiền vitamin A, sẽ chuyển hóa thành vitamin A khi vào cơ thể, không sợ độc khi dùng quá liều, giúp hỗ trợ thị giác, sáng mắt và tăng sức đề kháng [2] Xuất phát từ những công dụng to lớn của carotenoid, được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, dưới dự hướng dẫn của Th.S Mai Huỳnh Cang, chúng tôi thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KẾT TINH CAROTENOID TỪ DẦU GẤC”

Đề tài sẽ tập trung nghiên cứu khả năng tách và kết tinh carotenoid từ dầu gấc bằng dung môi có qua phản ứng xà phòng hóa loại bỏ các axit béo và tạp chất, chọn lọc các thông số tối ưu để quá trình tách và kết tinh đạt hiệu quả cao nhất Kết quả nghiên cứu của đề tài hi vọng sẽ giúp ích cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao hơn những giá trị của carotenoid cũng như ứng dụng vào trong thực phẩm, mỹ phẩm hiện nay

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu khả năng chiết xuất và kết tinh carotenoid từ dầu gấc

1.3 Nội dung của đề tài

Xác định thành phần, đặc tính của nguyên liệu dầu gấc

Theo dõi thí nghiệm xà phòng hóa để tìm ra các thông số tối ưu (loại kiềm, tỷ lệ kiềm và dầu gấc, nhiệt độ, thời gian phản ứng), đánh giá qua sự thay đổi hàm lượng carotenoid của nguyên liệu và sản phẩm

Theo dõi thí nghiệm kết tinh để tìm ra các thông số tối ưu (tốc độ khuấy trộn, nhiệt

độ, thời gian phản ứng), đánh giá qua sự thay đổi hàm lượng carotenoid của nguyên liệu và sản phẩm

Đánh giá chất lượng thành phẩm thu được

1.4 Yêu cầu của đề tài

Xác định được các điều kiện tối ưu của quá trình xà phòng hóa dầu gấc

Xác định được các điều kiện tối ưu đến quá trình kết tinh carotenoid

Quy trình đơn giản, dễ thực hiện

Cây Gấc có tên khoa học là: Momordica Cochinchinensis (Lour.) Spreng Họ

Cucurbitaceae Giống: Momordica Loài: Cochinchinensis Chi: Mướp đắng

Gấc là loại cây thân thảo dây leo, sống lâu năm, được một linh mục người Bồ Đào

Nha đặt tên là Muricia cochinchinensis vào năm 1790 Tới năm 1826, Sprengel kết luận loại cây này thuộc giống Momordica và đổi tên thành Momordeca

cochinchinensis [3] Hiện nay, cây gấc được gọi với nhiều tên khác nhau theo ngôn

ngữ các nước

Bảng 2-1: Tên gọi cây gấc theo các ngôn ngữ [4]

Ngôn ngữ Tên

spreng Muricia cochinchinensis luor muricia mixta roxb

Sweet gourd Cochinchin gourd Trung quốc Mộc miết tử Nhật Kushika

mokubetsushi

Mô tả thực vât: Đây là một loại cây đơn tính khác gốc, tức là có cây cái và cây đực

riêng biệt Cây gấc leo khỏe, chiều dài có thể mọc đến 15 mét Thân cây có tiết diện

góc Lá gấc nhẵn, to bằng bàn tay và xòa kiểu chân vịt phân ra từ 3 - 5 dẻ, dài 8 -

18cm Bên cạnh cuống lá có mọc “tay leo” giống dây bí hay dây mướp dễ cuốn vào

cọc hay cây Hoa mọc ở nách lá, sắc trắng hình loa kèn, đài sắc xanh hoa có 2 loại: hoa

cái và hoa đực Cả hai có cánh hoa sắc vàng nhạt Quả hình tròn màu lá cây, khi chín

chuyển sang màu đỏ cam, đường kính 15 - 20cm Vỏ quả gấc có gai rậm, bổ ra mỗi

quả thường có 6 múi Thịt gấc có màu đỏ cam Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹt, có

khía Gấc trổ hoa mùa hè sang mùa thu, đến mùa đông mới chín Mỗi năm gấc chỉ thu

hoạch được một mùa Do vụ thu hoạch tương đối ngắn (vào khoảng tháng 12 hay

tháng 1), nên gấc ít phổ biến hơn các loại quả khác Gấc giàu chất carotenoid và

lycopenee [3]

Trên thị trường thường phân biệt hai loại gấc nếp và gấc tẻ

- Gấc nếp: Trái to trọng lượng quả trung bình từ 1,5 - 2kg nhiều hạt, gai to, ít gai khi chín chuyển sang màu đỏ cam rất đẹp, cơm vàng tươi, màng đỏ bao bọc hạt có màu đỏ tươi rất đậm và dày thớ

- Gấc tẻ: Trái nhỏ trung bình khoảng 1kg vỏ dày tương đối có ít hạt, gai nhọn, trái chín bổ ra bên trong cơm có màu vàng nhạt và màng đỏ bao bọc hạt thường có màu đỏ nhạt hoặc màu hồng

Tuy nhiên hiện nay còn có thêm giống gấc lai cho năng suất rất cao nó chủ yếu được lai tự nhiên do dân trồng bằng hạt giữ lại các cây có đặc tính tốt nhân rộng và tự đặt tên Trong các giống này có giống Gấc lai đen chất lượng tốt, quả tròn, to, trọng lượng trung bình đạt 2 - 3kg, cá biệt có quả đạt 4 - 5kg Quả ít gai, có màu xanh đen, khi chín có màu đỏ, tỉ lệ long cùi cao, ruột đỏ thẫm, cho năng suất cao

Trong các giống Gấc trên hiện nay đang trồng phổ biến là các giống gấc lai và gấc nếp vì các giống này năng suất cao, chất lượng tốt, giá cao được các công ty chế biến thu mua nhiều [5]

Hình 2-2: Trái gấc

2.1.1.2 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố

2.1.1.2.a Đặc điểm sinh thái:

Gấc là cây ưa ánh sáng Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện cường độ chiếu ánh sáng mạnh nhưng quả phát triển trong điều kiện chiếu sáng giảm Giai đoạn quả đang lớn nếu gặp ánh sáng chiếu trực tiếp quả rất dễ bị rám, thối hoặc sớm rụng (bị thúi) Chính vì vậy trồng gấc tốt nhất nên làm giàn để nâng cao chất lượng cũng như phẩm chất quả

Nhiệt độ trung bình cho gấc phát triển là từ 25 - 27 o C hạt gấc có thể nảy mầm ở nhiệt độ 13 - 15 o C nhưng tốt nhất là ở 25 o C

Gấc là cây có khả năng chịu được hạn khá hơn chịu được úng Giai đoạn từ khi mới trồng đến trước ra hoa yêu cầu độ ẩm đất đạt 65 - 70% Giai đoạn ra hoa kết quả yêu cầu độ ẩm đạtt 75% Gấc là cây chịu úng rất kém, vì vậy khi trồng tốt nhất nên làm cồn hay ụ hoặc trồng ở nơi có khả năng tiêu thoát nước tốt [5]

Cách đây 200 năm, nhà Gấc học người Bồ Đào Nha J.Lourciso đến nước ta đã

phát hiện ra cây gấc và đặt tên khoa học cho nó là Momordica Cochinchincuris

Đặc tính của cây gấc là chống chịu tốt, rất phù hợp với các loại đất cát cổ, đất đỏ 3 gian, feralit, mà những loại đất này phân bố và trải rộng ở trung du miền núi phía bắc, tây nguyên, miền đông nam bộ Điển hình cho trung du miền núi phía bắc là tỉnh Bắc Giang, đại diện cho tây nguyên là tỉnh ĐăkLăk, đại diện cho khu vực miền đông

lượng quả, bao gồm phần màng có màu đỏ, bao xung quanh hạt, dày khoảng 1 - 3mm được dùng để chế biến

(1) Vỏ quả; (2) Thịt quả; (3) Múi quả; (4) Lõi

2.1.2.2 Thành phần hóa học của quả gấc

Hiện nay tại Việt Nam và ở các nước trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về quả gấc Với sự phát triển của khoa học đăc biệt là là các kỹ thuật phân tích chất lượng cao như sắc ký lỏng cao áp (HPLC), giúp cho việc phân tích chi tiết hơn về thành phần hóa học của quả gấc

2.1.2.2.a Thành phần carotenoid của quả gấc

Gấc chứa hàm lượng carotenoid cao, đặc biệt tập trung ở phần màng hạt, nhất là thành phần β-carotenene và lycopenee Hàm lượng lycopenee trong màng hạt gấc, theo Aoki cùng cộng sự (2002) đưa ra là 380 (μg/g FW) cao hơn ít nhất khoảng năm lần so với các loại trái cây khác như nho, đu đủ, dưa hấu, ổi, cà chua, cây hương thảo Trong khi đó kết quả của nhóm Ishida (2004) tìm thấy hàm lượng lycopenee trong màng hạt gấc là 2300 (μg/g FW), và vuong (2006) là 408,4 (μg/g FW) Bên cạnh đó, gấc là một trong những loại trái có hàm lượng β-carotene cao, từ 101(μg/g FW) (Aoki 2002) đến 718(μg/g FW) ( Ishida 2004) Nghiên cứu của Aoki cùng đồng sự cũng tìm thấy một lượng nhỏ lycopenee 0,9 (μg/g FW) và β-carotene (22,1 μg/g FW) trong phần thịt quả , zexanthin va β-crytoanthin có trong thành phần màng hạt và thịt quả [6], còn Ishida chỉ

(4) (3)

Hình 2-3: Cấu tạo của quả gấc

phát hiện β-carotene ở dạng vết và không lycopenee trong thịt quả [7] Dựa trên kỹ

thuật sắc ký hiện đại, nhóm nghiên cứu của Vương đã tìm ra một lượng đáng kể

α-tocopherol trong màng hạt 976μg/g FW[8] Bảng 2-2 so sánh hàm lượng β-carotene và

lycopenee trong màng hạt gấc của các tác giả

Bảng 2-2: Hàm lượng β-caroten và lycopene trong quả gấc

Nguồn β-caroten(μg/g FW) Lycopenee(μg/g FW) Carotenoid tổng

Thịt quả Màng hạt Thịt quả Màng hạt Thịt quả Màng hạt

So với các loại rau củ quả giàu carotenoid khác như cà chua, dưa hấu, thì gấc

chứa hàm lượng β-carotene cao gấp nhiều lần Bảng 2-3 so sánh hàm lượng β-carotene

của gấc và một số loại rau quả

Bảng 2-3: Hàm lượng carotenoid của gấc và một số loại quả [5]

( μg/g)

Tổng carotenoid ( μg/g)

Đu đủ 12,10 29,60 Chuối 2,90

Rau sắn tươi 82,80

Rau đay 78,50 60,80 Bắp cải 51,00

Do đó, khoảng 10 năm gần đây, gấc được các nhà nghiên cứu đánh giá là nguồn carotenoid tiềm năng, tác dụng hữu ích lên sức khỏe, cần được đầu tư nghiên cứu rộng rãi nhằm ứng dụng trên nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm

2.1.2.2.b Các thành phần dinh dưỡng khác

Bên cạnh thành phần carotenoid màng hạt gấc còn chứa nhiều các thành phần dinh dưỡng khác như vitmin E, các axit béo, đạm cùng khoáng chất khác Bảng 2-4 chỉ ra giá trị dinh dưỡng của màng hạt gấc

Bảng 2-4: Thành phần dinh dưỡng của màng hạt gấc [8]

Thành phần dinh dưỡng 100g phần ăn được Năng lượng(kj) 523(125kcal) Nước(%) 77 CHO(g) 10,5 Lipid(g) 7,9 Protein(g) 2,1 Cellulose(g) 1,8 Tro(g) 0,7 Ca(mg) 56 P(mg) 6,4

 Thành phần vitamin E(α –totopherol)

Hàm lượng vitamin E (α-totopherol) trong gấc khoảng 76μg/g theo khối lượng tươi

Hình 2-4: Công thức cấu tạo của α-tocopherol

 Thành phần axit béo

Gấc rất giàu các axit béo, riêng đối với các axit béo không no bão hòa đơn và axit béo không no bão hòa đa thì có nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người

Các axit béo tập trung ở màng của hạt gấc Các axit béo trong màng gấc sấy khô

có hàm lượng trong khoảng giữa 17 - 22% [2] Bên cạnh đó, khoảng 70% tổng axit béo trong màng gấc là các axit béo không no và khoảng 50% của các axit béo này là axit béo không no bão hòa đa Hàm lượng các axit béo trong màng có vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình hấp thu carotenoid và các dưỡng chất khác [9] Tương tự một vài nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng, khi con người tiêu thụ các axit béo với hàm lượng nhất định thì có thể cải thiện quá trình hấp thu các carotenoid Mặt khác, các axit béo có thể bảo vệ các đồng phân cis và trans của lycopenee nhằm chống lại quá trình oxi hóa và làm chậm phản ứng đồng phân hóa [10]

Dầu từ màng hạt gấc chứa một lượng cao axit oleic khoảng 32 - 34% tổng các axit béo và có thể được sử dụng để thêm vào các nguồn dầu khác như dầu hướng dương, dầu cọ và dầu đậu nành Axit linoleic đóng một vai trò quan trọng trong sức khỏe con người

Nếu trong chế độ ăn hàng ngày có sử dụng axit linoleic trong một thời gian ngắn (liều lượng sử dụng 3,4 g/ ngày, sử dụng cho khoảng 12 tuần và 2,4 g/ ngày,sử dụng trong 8 tuần) thì giảm được khối lượng cơ thể đối với những người béo phì ở Norway

và ở Korea [1]

Theo kết quả nghiên cứu của Chung (2011) [11], phân tích thành phần axit béo trong dầu gấc bằng phương pháp GC-ISO/CD 550:94 tại sở khoa học công nghệ cho thấy dầu gấc chứa nhiều axit béo như: axit palamitic (21,51%), axit stearic (7,75%), axit oleic (44,34%), axit linoleic (24,495), ngoài ra còn có các axit béo khác như: axit lauric, axit palmitic, axit linoleic và axit α-linoleic (omega-3) Omega-3 là axit béo không no có giá trị dinh dưỡng cao, giúp duy trì sự khỏe mạnh của não bộ, chống suy giảm trí nhớ, phát triển thần kinh và thị lực [1]

Thành phần axít béo của màng hạt gấc được thể hiện ở bảng 2-5

Bảng 2-5: Thành phần các axit béo trong dầu gấc [11]

a) Theo Nguyễn Hồng Khánh cùng cộng sự (2004), dầu gấc có chỉ số axit, iot, khúc xạ kế ở 20 oC lần lượt là 2; 72 và 1,4681-1,485 [12] Tỷ trọng dầu gấc ở

15 o C là 0,9151-0,9156 g/cm3 Dầu gấc hòa tan tốt trong ete dầu hỏa, etanol, chlororm và axeton Dầu gấc chứa hàm lượng lớn carotenoid, đặc biệt là β-carotene và lycopene, bên cạnh đó vitamin E và nhiều axit béo không no thiết yếu khác cùng khoáng chất

Ở việt nam, từ lâu dầu gấc đã được sử dụng làm thuốc bổ, cung cấp vitamin A cho trẻ nhỏ, phụ nữ mang thai và cho con bú Giúp sáng mắt, phòng ngừa các bệnh về mắt như: khô mắt, mỏi mắt, chống lão hóa làm đẹp da, giúp da luôn mịn màng, tươi trẻ phòng chống suy dinh dưỡng và thiếu vitamin A, đặc biệt đối với trẻ em và phụ nữ ngăn ngừa các bệnh ung thư, đặc biệt ung thư vú, ung thư gan, hạ cholesterol và lipid máu, rất tốt với những người bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm gan

Ngày nay, cùng với sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu về gấc đã chỉ ra được thêm nhiều công dụng của dầu gấc như: làm tăng khả năng của hệ miễn dịch, chống lại

sự lão hóa của tế bào và chống lại quá trình oxi hóa [13] loại bỏ các tác động độc hại của môi trường như các chất độc hóa học, tia phóng xạ Các thành phần β-carotene, lycopenee và vitamin E trong dầu gấc có tác động trung hòa 75% các chất gây ung thư đặc biết đối với bệnh ung thư vú [14]

Với những tác dụng hữu ích lên sức khỏe, hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm, thực phẩm chức năng có thành phần chính là dầu

gấc

2.2 Kh

ái quát về carotenoid

Carotenoid là một trong các sắc tố phổ biến và quan trọng của tự nhiên gồm: xanh lá, vàng, cam, và đỏ

Có thể tìm thấy carotenoid trong rau quả, tảo, nấm, vi khuẩn và trong cơ thể động vật Các chất này tạo nên sự đa dạng về màu sắc của các loài chim, cá, hoặc côn trùng và

có thể tìm thấy trong các sản phẩm động vật như trứng và sữa Tuy nhiên, động vật có

vú, bao gồm cả con người không có khả năng tự tổng hợp các hợp chất carotenoid này

mà phải hấp thu từ các nguồn thực phẩm [15]

Vào năm 1831, Wackenroder đã thu được carotene từ cà rốt Đến năm 1837, Berzelius đã gọi các sắc tố có màu vàng trong lá cây Xantophylls Từ thập niên 1950 cho đến ngày nay carotenenoid đã được sử dụng công nghiệp như một phẩm màu thực phẩm, ký hiệu là E160A

Hình 2-5: Một số sản phẩm từ dầu gấc

Carotenoid thuộc nhóm tetraterpen (C40H56), có nhiều nối đôi tiếp cách trong phân

tử Carotenoid là một chất chống oxi hóa được cho rằng là rất tốt khi so sánh với các hợp chất khác từ các nguồn thực phẩm Chống oxi hóa có thể giúp cơ thể con người bảo vệ chống lại những tác nhân gây hại bởi các gốc tự do Mặt khác, Carotenoid (β-caroten, lycopene, zeaxanthin, và β-crytoxanthin) và α-tocopherol được biết như là các chất chống oxi hóa bảo vệ khỏi các bệnh tim mạch và ung thư bởi sự dập tắt các gốc oxi phân tử và các gốc peroxyd Số nối đôi liên hợp trong các phân tử carotenoid đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxi hóa Khi kết hợp các carotenoid như β-carotene, lycopene và α-tocopherol thì hoạt tính chống oxi hóa cao hơn rất nhiều so với hoạt tính từng carotenoid riêng lẻ [7]

2.2.2 Đặc tính lý hóa của carotenoid

và dichloromethane Dung dịch β-carotene và xanthophyll lutein tan tốt trong tetrahydrofuran [15,16]

2.2.2.1 Hấp thu ánh sáng

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo thành phổ hấp thụ ánh sáng, làm cho carotenoid có màu sắc đẹp, đồng thời tạo ra phổ hấp thụ nhìn thấy được, đặt cơ sở để định tính và định lượng chúng Phổ hồng ngoại và tử ngoại là công cụ phát hiện đầu tiên để nhận biết carotenoid Bước sóng hấp thu cực đại (λmax) và hình dạng phổ là những đặc điểm của nhóm màu

Đa số carotenoid hấp thu cực đại ở 3 bước sóng Số lượng nối đôi liên hợp càng nhiều, giá trị λmax càng cao Do đó, hầu hết các carotenoid, lycopenee không vòng, không bão hòa, với 11 nối đôi liên hợp, có màu đỏ và hấp thu bước sóng dài nhất (λmax

bằng 444, 470, 502 nm) [16]

2.2.2.2 Đồng phân hóa và sự oxi hóa

Carotenoid có độ không bão hòa cao nên dễ bị đồng phân hóa và oxi hóa Nhiệt độ, ánh sáng, axit và sự hấp thu của các chất hoạt động bề mặt (nhôm oxit) thúc đẩy quá trình đồng phân hóa dạng trans carotenoid, dạng thường gặp của chúng là dạng cis Nguyên nhân làm mất carotenoid là do sự oxi hóa, phụ thuộc vào sự có mặt của oxi, bị tác động của ánh sáng, enzyme, ion kim loại và đồng oxit hóa với lipid hyroperoxide Dạng epoxide và apocarotenoid (carotenoid có cacbon skeleton) xuất hiện trong giai đoạn đầu của quá trình tổng hợp carotenoid trong thực vật [16]

Sự phân chia tạo thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp tương tự với quá trình oxi hóa các chất béo, làm mất màu và mất hoạt tính sinh học Sự đồng phân hóa

và oxi hóa carotenoid diễn ra trong quá trình chuẩn bị, quy trình chế biến và tồn trữ thực phẩm Vì vậy cần có những giải pháp hạn chế các quá trình này nhằm duy trì hàm lượng carotenoid trong sản phẩm [16]

2.2.3 β-carotene

2.2.3.1 Cấu trúc hóa học

β-carotene có màu vàng, có nhiều trong gấc, cà rốt, các trái cây có màu vàng

và các lọai rau màu xanh đậm Chính màu vàng của β-carotene làm nền cho màu xanh của diệp lục tố đậm hơn ở các lọai rau giàu β-carotene β-carotene (tiền vitamin A) cao gấp 1,8 lần so với dầu gan cá thu, 10 lần so với cà rốt, là β-carotene thiên nhiên nên có tác dụng chống lão hóa mạnh, đồng thời bổ sung vitamin A

Công thức phân tử: C40H56

Trọng lượng phân tử: 536,8824g/mol

β-carotene có công thức hóa học giống lycopenee nhưng khác nhau về cấu tạo hóa học Phân tử β-carotene có 9 nối đôi liên hợp và sườn cacbon kết thúc bằng 2 vòng β-ionone Cấu trúc này tạo nên khả năng đặc biệt của β-carotene

Trong số các đồng phân β-carotene, dạng trans có hoạt tính vitamin A 100% trong khi đó dạng cis thì chỉ có 50% hoạt tính hoặc thấp hơn

2.2.3.3 Tính chất hóa học và vật lý

- Carotene dễ bị oxi hóa ngoài không khí Do đó cần bảo quản trong khí trơ, chân không Ở nhiệt độ thấp nên bao kín tránh ánh sáng mặt trời

- Không tan trong nước, chỉ tan trong lipit và các dung môi hữu cơ

Carotene nguyên chất là các tinh thể đen có màu đỏ sáng của đồng và có ánh kim loại, dung dịch carotene có màu đỏ cam

Trong các thử nghiệm cho rằng 30mg β-carotene mỗi ngày làm giảm tỷ lệ ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt ở người hút thuốc và những người có tiền sử tiếp xúc với chất gây nghiện

2.2.4 Lycopene

2.2.4.1 Cấu trúc hóa học

Lycopenee là một tetraterpen đối xứng được cấu tạo từ 8 đơn vị isopren Phân tử là một chuỗi cacbon chưa no có 11 nối đôi liên tiếp nhau, dài hơn bất cứ carotenoid nào khác, do không có vòng β-inone như β-carotene nên lycopenee không thể chuyển hóa thành vitamin A được

Hình 2-7: Công thức cấu tạo của lycopene

Công thức phân tử C40H56

Trọng lượng phân tử: 536,8824g/mol

Lycopene: là một carotenoid màu đỏ tươi, được tìm thấy trong cà chua, các loại quả màu đỏ khác như cà rốt đỏ, dưa hấu, đu đủ và đặc biệt là gấc trong gấc hàm lượng lycopenee cao gấp 70 lần so với cà chua, đến mức có thể kết tinh thành tinh thể Lycopenee không hòa tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ và các loại dầu

Nếu lycopenee bị oxi hóa (ví dụ, bằng cách phản ứng với các chất tẩy trắng hoặc axit ), các liên kết đôi giữa các nguyên tử cacbon sẽ bị phá vỡ, tách các phân tử và loại

bỏ các chromophore

2.2.4.2 Công dụng

Có khả năng chống lão hóa, ngăn ngừa chứng nhồi máu cơ tim và bảo về gien khỏi tổn thương Có vai trò trung hòa các chất hóa học gây lão hóa làn da

Ở thực vật, tảo, và các sinh vật quang hợp khác, lycopenee là một chất trung gian quan trọng trong việc sinh tổng hợp của nhiều carotenoid

2.3 Các nghiên cứu khoa học về gấc

Năm 1941, bộ môn dược liệu Đại học dược Hà Nội đã bước đầu xác định màng đỏ bao quanh hạt gấc có chứa β-carotene và một tỉ lệ dầu thảo mộc cao

Năm 1951, GS.Nguyễn Văn Đàn đã mang dược liệu này sang nghiên cứu ở Đức

và xác định ngoài β-carotene thì phần này của quả gấc còn chứa lycopene một chất chống lão hóa mạnh nhất hiện nay

Bảng 2-6: Thành phần carotenoid trong dầu gấc

(Nguồn: Le Thuy Vuong (2004))

2.4 Tổng quan về các phương pháp chiết xuất carotenoid

Gần đây, các loại máy móc và thiết bị công nghệ thực đã đạt được những kết quả tuyệt vời trong việc cô lập, đồng nhất hóa và tinh chế các sắc tố tự nhiên trong đó có

cả carotenoid Các sắc tố này vừa mang giá trị dinh dưỡng vừa được ứng dụng trong sản xuất thuốc nhuộm và có khả năng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể

2.4.1 Tổng quan về phản ứng xà phòng hóa chất béo [17]

Xà phòng hóa là quá trình thủy phân chất béo (triglycerid) trong môi trường kiềm tạo thành ancol (thường là glycerol) và muối cacboxylat

Hình 2-8: Phản ứng xà phòng hóa

Dầu thực vật và mỡ động vật là những vật liệu chính để xà phòng hóa, những triglycerid (triesters) này thường là những chất béo trung tính có các gốc là những axit béo đa dạng Triglycerid phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng có thể được thực hiện qua một hoặc hai bước Đối với phương pháp xà phòng hóa một bước truyền thống, triglycerid sẽ được phản ứng với dung dịch kiềm mạnh (thường là NaOH hay KOH), quá trình thủy phân esters sẽ xảy ra nhanh chóng tạo thành muối của axit béo và glycerol Xà phòng tạo ra có thể được kết tủa trong nước muối như NaCl, CaCl2 và thu lại được glycerol

Đối với dầu gấc, xà phòng hóa kết hợp với xử lý dung môi giúp loại bỏ được phần lớn các axit béo, hỗ trợ dung môi tách carotene được dễ dàng hơn, nhằm tạo cơ sở bước đầu cho các giai đoạn trong quá trình tinh sạch sau, tạo nên tinh thể carotene giá trị cao như lycopenee, phục vụ được cho những ứng dụng carotenoid cap cấp hơn

Cơ chế của phản ứng xà phòng hóa: Cơ chế phản ứng được giải thích dựa trên thuyết thế ái nhân acyl Anion hydroxyd sẽ tấn công vào nhóm cacbonyl của ester, lập tức tạo thành orthoester Orthoester sẽ tách thành hydroxide và alkoxide, sau đó proton được chuyển giao nhanh chóng và hoàn thành phản ứng

2.4.2 Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

 Định nghĩa

Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn Ở trạng thái siêu tới hạn, hợp chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí

Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn là phương pháp chiết sử dụng dạng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn

 Ưu điểm:

 Khả năng khuếch tán tốt

 Độ nhớt thấp, áp suất hơi cao

 Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết Vì thế chất chiết tương đối sạch

 Thân thiện với môi trường

 Tốc độ phản ứng lớn

 Có khả năng tái sử dụng

 Nhược điểm:

 Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền

 Không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng

 Khó lường được khi chiết trên một mẫu mới Cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để chiết thành công

2.4.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)[18]

2.4.3.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là

chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hóa học với các nhóm chức hữu cơ, cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( rây phân tử)

2.4.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký

 Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

 Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký tro đổi ion

 Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

 Nếu pha tĩnh là là gel thì ta có sắc ký gel rây phânn tử

Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cộ, chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C, vào cột phân tích, kết quả các chất A,B,C, sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

2.4.3.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng

Theo cơ chế tách của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP – HPLC), sắc ký phân bố- sắc ký chiết (LLC), sắc ký trao đổi Ion (IE – HPLC), sắc ký rây phân tử, sắc ký Gel ( IG- HPLC), nhưng thực tế hiện nay chúng ta chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ và phân tích mẫu [19].

2.4.4 Tổng quan về phương pháp kết tinh

2.4.4.2 Chọn dung môi

Người ta phải chọn dung môi hay hệ dung môi thích hợp để hòa tan chất tinh chế ở nhiệt độ sôi và không hòa tan hoặc hòa tan ít ở nhiệt độ lạnh, còn tạp chất thì hiện tượng ngược lại Sau khi lọc nóng loại bỏ tạp chất thì chất rắn sẽ kết tinh lại sạch hơn Việc chọn lựa dung môi kết tinh ở nhiệt độ thường cũng như ở nhiệt độ sôi Dung môi phải có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của chất tinh chế ít nhất là 10 oC

và lại phải giải phóng khi lọc cũng như khi rửa Việc chọn dung môi hay hệ dung môi phải dựa vào mối quan hệ cấu tạo phân tử của chất kết tinh và dung môi, thường thường chất phân cực thì hòa tan, tan trong dung môi từ không phân cực đến dung môi phân cực Cách làm như sau: lấy một vài tinh thể vào ống nghiệm, nhỏ một ít dung môi vào rồi đun sôi, quan sát độ tan cho đến khi tinh thể tan hết, nếu đảm bảo yêu cầu trên thì chất sẽ kết tinh lại khi lạnh Dung môi được xem là tốt nếu cứ 0,1g chất kết tinh tan trong 1ml dung môi nóng

Khi không chọn được dung môi thì bắt buộc phải chọn hệ dung môi Nguyên tắc: lấy một dung môi hòa tan chất kết tinh ngay ở nhiết độ thường, sau đó chọn một dung môi không hòa ran hay kém hòa tan chất tinh chế nhưng phải tan trong dung môi trên Cách làm như sau: lấy một vài tinh thể vào ống nghiệm, thêm dung môi cho đến khi tan hết, ghi lấy thể tích dung môi Nhỏ từ từ dung môi không tan chất kết tinh vào hỗn hợp trên cho đến khi vẩn đục, ghi lấy thể tích dung môi, đun hỗn hợp cho tan hết Lọc

nóng để nguội, chất rắn sẽ kết tinh lại Tỉ lệ hai thể tích đã đo được coi là tỉ lệ thể tích dung môi đã chọn Thường chọn hệ dung môi etanol-nước, etanol-benzen, axeton-ete dầu hỏa, axit axetic- nước,

Nếu có nhiều chất có độ tan khác nhau ở nhiệt độ khác nhau vào một dung dịch, nười ta dùng phương pháp kết tinh phân đoạn Ở một nhiệt độ xác định, một chất nào

đó tan quá bão hòa sẽ kết tinh lại khi để lạnh, còn chất kia chưa bão hòa sẽ ở lại trong dung dịch

Nếu dung môi hòa tan chất kết tinh, còn chất bẩn không tan, người ta sẽ lọc nóng

để loại bỏ chất bẩn, còn chất kết tinh ở lại trong dung dịch sẽ kết tinh khi để lạnh

2.4.4.3 Các thao tác khi kết tinh

Chuẩn bị dung dịch kết tinh hay dung dịch nước cái

Cho một lượng chất cần kết tinh vào bình cầu hai cổ có lắp ống sinh hàn hồi lưu và phễu chiết đựng dung môi hoặc vào bình tam giác có sinh hàn hồi lưu, thêm đá bọt rồi cho dung môi vào ít hơn một lượng ít theo lượng tính toán, đun sôi Nếu sôi mà chưa tan hết thì thêm một ít dung môi vào cho đến khi chất tan hoàn toàn, chất bẩn sẽ không tan

Nếu dùng hỗn hợp dung môi thì cho dung môi tan tốt vào trước cho đến khi chất rắn tan hoàn toàn rồi thêm dần dung môi hòa tan kém vào cho đến khi chất rắn kết tủa rồi tan ơ nhiệt độ sôi Nếu dung dịch có màu, phải thêm chất tẩy màu như than hoạt tính, than xương hay silicagel với tỉ lệ 1/20 hay 1/50 Khi cho chất khử màu phải để dung dịch lạnh, không được thêm chất khử màu khi dung dịch đang nóng để tránh dung dịch bi trào ra ngoài Sau đó đun sôi lại dung dịch trong 2-3 phút

 Lọc nóng dung dịch

Lọc dung dịch đang nóng để loại bỏ chất bẩn, chất phụ không tan ra khỏi dung dịch Cần lọc nóng bằng phễu lọc nóng, lọc nhanh để tránh chất kết tinh ở trên phễu

Nếu không thấy kết tinh thì có thể gây mầm kết tinh bằng cách cho vào dung dịch một vài tinh thể của chất tinh chế hoặc lấy đũa thủy tinh cọ vào thành bình

Những chất có nhiệt độ nóng chảy thấp thường tách ra ở dạng dầu nên phải làm lạnh chậm và sâu để tinh thể kết tinh chậm

 Tách lọc tinh thể

Tinh thể tinh khiết được lọc nhanh trên phễu ở áp suất thấp Khi lọc cần rửa lại khi kết tủa bằng dung môi lạnh Một số trường hợp người ta sẽ gạn, lắng Trong trường hợp chất háo nước và dễ bị oxi hóa thì dùng phương pháp riêng

Cũng có thể làm khô tinh thể bằng gió của máy sấy tóc

Xác định nhiệt độ nóng chảy của chất thu được

Khi xác định nhiệt độ nóng chảy thấy cố định hoặc sai khác ít hơn hoặc bằng ± 1 thì coi như chất đã sạch

Nhờ trọng lực, dung môi chảy từ trên xuống sẽ kéo theo những phân tử thích hợp làm chúng tách ra khỏi hỗn hợp Như vậy ta thấy, yếu tố quyết định đến hiệu quả của sắc kí cột phụ thuộc vào việc lựa chọn pha động, độ đặc khít của cột, dung môi sử dụng, tốc độ giải li… nên cần phải lưu ý chúng

Ưu điểm của phương pháp là pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm tương đối rẻ, dễ kiếm;

có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất Đây là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất ra khỏi hỗn hợp [20]

2.4.6 Phương pháp phổ UV-Vis dùng trong phân tích định lượng [20]

Khi chiếu các bức xạ điện từ qua dung dịch của các chất thì chất sẽ hấp thụ chọn lọc một phần năng lượng bức xạ làm cho phân tử chất bị kích thích lên trạng thái năng lượng cao hơn Ở trạng thái kích thích, phân tử không bền và sau một khoảng thời gian ngắn (10-8 s), phân tử sẽ giải phóng năng lượng dư thừa để trở về trạng thái ban đầu Năng lượng dư thừa này được giải phóng dưới nhiều dạng Trong đó, năng lượng giải phóng dưới dạng nhiệt được ứng dụng làm cơ sở cho phương pháp phân tích trắc quang để xác định nồng độ các chất dựa trên định luật cơ bản về hấp thụ ánh sáng Phương trình của định luật cơ bản hấp thụ ánh sáng Bougher-Lambert-Beer:

I = Io.10-εlC hay A = εlC Trong đó:

Io và I : cường độ dòng sáng lúc đầu và lúc sau

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Nội dung nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Từ tháng 3/2013 đến tháng 8/2013 tại phòng thí nghiệm I4 Bộ môn Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, khu phố 6, phường linh trung, quận Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh

3.1.2 Nội dung nghiên cứu chính

Với mục đích nghiên cứu phân lập và kết tinh carotenoid từ dầu gấc đã được nêu ở mục 1.2, nội dung nghiên cứu của đề tài được trình bày trong hình 3-1

Hình 3-1: Các bước nghiên cứu của đề tài

Dầu gấc nguyên liệu sau khi được xác định thành phần, đặc tính lý hóa Sẽ được tiến hành thí nghiệm xà phòng nhằm xác định các điều kiện phù hợp cho quá trình xà phòng hóa để chiết tách carotenoid ra khỏi hỗn hợp dầu Sau đó, tiến hành quá trình tách carotenoid bằng dung môi, sản phẩm tiếp tục được tiến hành các thí nghiệm kết tinh carotenoid nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tinh

 Cân điện tử Sartorius TE214S, xuất sứ Đức

 Tủ sấy Memmert UNB-400, xuất sứ Đức

 Máy khuấy từ MR-Hei standard, xuất sứ Đức

 Tủ sấy chân không JISICO J-DV01, xuất sứ Hàn Quốc

 Máy quang phổ Genesys 20, xuất sứ Mỹ

 Thiết bị cô quay Stuart, xuất sứ Anh

 Máy nước cất GFL 2008, xuất sứ Đức

 Các dụng cụ thủy tinh: Erlen, Bekcher, Pipet, đũa khuấy, ống đong, ống nghiệm, phễu chiết

 Dụng cụ khác: thau nhựa, khay nhựa, …

3.2.2.2 Hóa chất

 N-hexan

 Rượu ethanol 96%

Hình 3-2: Dầu gấc

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1 Xác định thành phần đặc tính dầu gấc

Mục đích: Đánh giá các tính chất ban đầu của dầu gấc như hàm lượng carotenoid,

tỷ trọng, chỉ số xà phòng hóa ….giúp cho việc tiến hành thí nghiệm thuận lợi hơn

3.3.1.1 Xác định tỷ trọng của dầu gấc

Phương pháp tiến hành: Dầu gấc được tiến hành do tỷ trọng bằng bình đo tỷ

trọng, chi tiết nội phương pháp được trình bày ở phụ lục 1

3.3.1.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng

Phương pháp tiến hành : Dầu gấc nguyên liệu được tiến hành đo hàm lượng

carotenoid bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 473nm

Hàm lượng carotenoid được tính dựa vào đường chuẩn carotenoid của Phan Thị Kim Khánh (2012) [21]

 Cân lượng mẫu m(g) vào bekcher

 Pha dung dịch kiềm bằng rượu ethanol 96%

 Đong một lượng kiềm xác định cho vào becher đựng mẫu

 Để mẫu chờ trong khoảng thời gian tùy vào thí nghiệm

 Dùng rượu để hòa tan hỗn hợp xà phòng hóa

3.3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xà phòng hóa

 Tỉ lệ giữa lượng dầu gấc và lượng kiềm( khan)

 Loại kiềm sử dụng (NaOH, KOH)

 Nồng độ kiềm sử dụng

 Nhiệt độ của quá trình xà phòng hóa

 Thời gian gia nhiệt và khuấy của phản ứng xà phòng hóa

3.3.2.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.2.3.a Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của loại kiềm

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của loại kiềm đến quá trình xà phòng hóa

Yếu tố cố định: Loại dầu gấc, thời gian phản ứng, nồng độ kiềm,nhiệt độ phản

ứng

Yếu tố thay đổi: Loại kiềm sử dụng, môi trường phản ứng

Chỉ tiêu theo dõi: Độ rắn, mềm của xà phòng sau phản ứng, và hàm lượng

carotennoid

Phương pháp thí nghiệm:

Chuẩn bị thí nghiệm với các yếu tố cố định về nồng độ kiềm, nhiệt độ xảy ra phản ứng, thời gian phản ứng, loại dầu gấc sử dụng

Trộn hỗn hợp dầu gấc và dung dịch kiềm (2N) với tỉ lệ 40% kiềm khan

Tiến hành phản ứng xà phòng hóa ở nhiệt độ phòng (30 oC) trong thời gian15 phút

Để hỗn hợp sau 2 giờ

Kiểm tra cảm quan của xà phòng tạo thành

Dùng rượu để hòa tan hỗn hợp xà phòng hóa

Dùng dung môi n-hexan tách lấy carotenoid Rửa lại nhiều lần với nước để loại hết kiềm dư

Tiến hành đo quang và cô quay xác định hàm lượng carotenoid thu được Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi loại kiềm

Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm loại kiềm

Loại kiềmMôi trường

NaOH KOH

Nước

A11 A12 A13

A21 A22 A23 Rượu

A14 A15 A16

A24 A25 A26

3.3.2.3.b Thí nghiệm 1.2: Tỉ lệ giữa lượng kiềm ( khan) và dầu gấc

Mục đích: Xác định được tỉ lệ kiềm phù hợp cho phản ứng

Yếu tố cố định: Loại dầu gấc, thời gian phản ứng, nồng độ kiềm,nhiệt độ phản

ứng, loại kiềm, lượng dầu gấc

Yếu tố thay đổi: Lượng kiềm cho vào phản ứng

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng carotenoid sau xà phòng hóa

Phương pháp thí nghiệm: Chuẩn bị thí nghiệm với các yếu tố cố định về nồng độ

kiềm, nhiệt độ xảy ra phản ứng, thời gian phản ứng, loại dầu gấc sử dụng, loại kiềm, môi trường phản ứng

Trộn hỗn hợp dầu gấc với kiềm (2N) với lượng theo tỉ lệ kiềm (35%; 40%; 45%) Tiến hành phản ứng xà phòng hóa ở nhiệt độ phòng 30 oC Trong thời gian15 phút

Để hỗn hợp sau 2 giờ

Dùng rượu để hòa tan hỗn hợp xà phòng hóa

Dùng dung môi n-hexan tách lấy carotenoid Rửa lại nhiều lần với nước để loại hết kiềm dư

Tiến hành đo quang và cô quay xác định hàm lượng carotenoid thu được Tiến hành thí nghiệm ở mỗi lượng kiềm cho vào 3 lần

Bảng 3-2: Bố trí thí nghiện tỷ lệ lượng kiềm và dầu gấc

3.3.2.3.c Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xà phòng hóa

Mục đích: Xác định được nhiệt độ phù hợp cho quá trình xà phòng hóa

Yếu tố cố định: Loại dầu gấc, thời gian phản ứng, nồng độ kiềm, loại kiềm, lượng

dầu gấc, môi trường phản ứng

Yếu tố thay đổi: Nhiệt độ của phản ứng xà phòng hóa

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng carotenoid sau xà phòng hóa

Phương pháp thí nghiệm: Chuẩn bị thí nghiệm với các yếu tố cố định về nồng độ

kiềm, thời gian phản ứng, loại dầu gấc sử dụng, loại kiềm, môi trường phản ứng

Trộn hỗn hợp dầu gấc với kiềm với lượng theo thể tích sao cho lượng kiềm bằng với kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1.2

Tiến hành phản ứng xà phòng hóa ở các khoảng nhiệt độ (20; 30; 40; 50 oC), trong thời gian 15 phút

Để hỗn hợp 2 giờ

Kiểm tra cảm quan của xà phòng tạo thành

Dùng rượu để hòa tan hỗn hợp xà phòng hóa

Dùng dung môi n-hexan tách lấy carotenoid Rửa lại nhiều lần với nước để loại hết kiềm dư

Tiến hành đo quang và cô quay xác định hàm lượng carotenoid thu được Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi khoảng nhiệt độ

Bảng 3-3: Bố trí thí nghiệm nhiệt độ xà phòng hóa

Nhiệt độ(OC)

Lặp lại

1 2 3