NGHIÊN CỨU CHIẾT CHLOROPHYLL VÀ CAROTENOID TỪ TẢO CHLORELLA

• Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết đến lượng chlorophyll và carotenoid thu được sau quá trình chiết.. • Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đến lượng chlorophyl

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CHIẾT CHLOROPHYLL VÀ CAROTENOID

iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trương Vĩnh, trưởng bộ môn Công nghệ hóa học, người thầy kính yêu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý giá trong suốt quá trình thực hiện, thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót và cũng không ngừng động viên tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến cô Vũ Ngọc Hà Vi cùng toàn thể quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ hóa học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Vinh Lang, khoa Khoa học cơ bản, đã tận tình giúp đỡ, cho phép tôi được thực tập tại khoa để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã nuôi dạy con khôn lớn để con có được thành quả như ngày hôm nay

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp DH08HH đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2012

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Bông

iv

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu chiết chlorophyll và carotenoid từ tảo Chlorella” được tiến

hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ hóa học, trường Đại học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 2/2012 đến tháng 8/2012

Phần nghiên cứu của đề tài bao gồm các thí nghiệm sau:

• Khảo sát ẩm độ của nguyên liệu tảo chlorella sau khi ly tâm loại bỏ nước ở tố

độ 4000 vòng/phút trong 6 phút

• Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết đến lượng chlorophyll

và carotenoid thu được sau quá trình chiết

• Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đến lượng chlorophyll và carotenoid thu được sau quá trình chiết

• Nghiên cứu định danh các thành phần sắc tố trong dịch chiết sau quá trình chiết

• Thử nghiêm tách chlorophyll và carotenoid bằng sắc ký cột

Kết quả thu được như sau:

• Nguyên liệu tảo chlorella sau khi ly tâm loại bỏ nước ở tố độ 4000 vòng/phút trong 6 phút có độ ẩm 83.21 %

• Loại dung môi tối ưu cho quá trình chiết là N,N-Dimethylformamide với thời gian chiết tối ưu là 180 phút

• Tốc độ đồng hóa tốt nhất để thu được hàm lượng chlorophyll và carotenoid cao

là 20000 vòng/phút

Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm STATGRAPHICS 7.0

v

ABSTRACT

The thesis “Research of the extraction of chlorophyll and carotenoid in chlorella algae” was conducted in the laboratory of Chemical Technology department, Nong Lam University Ho Chi Minh city, from 2/2012 to 8/2012

The thesis includes these experiment:

• Studying moisture content of the Chlorella algae after centrifugation in 4000 rpm for 6 minutes

• Studying the effect of solvent and time extractive on the amount of chlorophyll and carotenoid obtained after the extraction

• Studying the effect of assimilation rate to the amount of chlorophyll and carotenoid obtained after the extraction

• Identified the pigment components in the extraction

• Separation of chlorophyll and carotenoid by column chromatography

The results were as follows:

• Ingredients chlorella algae after centrifugation to remove water in 4000 rpm in

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT……….……… ………iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ixi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

DANH SÁCH PHỤ LỤC xiii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 M ục đích của đề tài: 2

1.3 N ội dung đề tài: 2

1.4 Yêu cầu: 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu về tảo lục Chlorella 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Hình thái và các đặc điểm sinh học về ngành tảo lục 3

2.2 Sơ lược về chlorophyll 10

2.2.1 Khái niệm 10

2.2.2 Cấu tạo và phân loại 10

2.2.3 Tính chất của chlorophyll 11

vii

2.3 Sơ lược về carotenoid 14

2.3.1 Lịch sử và khái niệm về carotenoid 14

2.3.2 Phân loại carotenoid 14

2.3.3 Tính chất của carotenoid 16

2.4 Tách chiết và tinh chế chlorophyll và carotenoid 17

2.5 Phương pháp phân tích, đo đạt các chỉ tiêu 18

Chương 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 23

3.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 233

3.2.1 Nguyên liệu: 23

3.2.2 Hóa chất: 23

3.2.3 Thiết bị: 24

3.3 Quy trình thực hiện 24

3.4 Phương pháp thí nghiệm: 26

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng nước có trong nguyên liệu tảo tươi sau khi li tâm 26

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết đến quá trình chiết chlorophyll và carotenoid từ tảo Chlorella 27

3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định tốc độ đồng hóa tối ưu cho quá trình chiết các sắc tố 28

3.4.4 Thí nghiệm 4: Định danh chlorophyll và carotenoid bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 30

3.4.5 Thí nghiệm 5: thử nghiệm tách chlorophyll và carotenoid từ tảo chlorella bằng phương pháp sắc ký cột: 33

viii

Ch ương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Ẩm độ của nguyên liệu: 34 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian ngâm chiết đến hàm lượng chlorophyll và carotenoid trích ly 35 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đền khả năng chiết các sắc tố 40 4.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm định danh các sắc tố của tảo bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 44 4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm tách chlorophyll và carotenoid bằng sắc ký cột 46 Chương 5:KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 52

[Chl.a]: Nồng độ chlorophyll a trong dịch chiết

[Chl.b]: Nồng độ chlorophyll b trong dịch chiết

[Ca]: Nồng độ carotenoid trong dịch chiết

x

Bảng 2.1: Thành phần hóa học chứa trong tảo Chlorella 8

Bảng 2.2: Thành phần aminoacid (%) của Chlorella 9

Bảng 2.3: So sáng các đặc trưng của kỹ thuật sắc ký 21

Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu Error! Bookmark not defined Bảng 4.2: Kết quả đo độ hấp thu tại các bước sóng khác nhau Error! Bookmark not defined. Bảng 4.3: Kết quả tính toán nồng độ chlorophyll và carotenoid có trong dịch chiết Error! Bookmark not defined Bảng 4.4: Lượng chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid trong 1 gam tảo khô Error! Bookmark not defined. Bảng 4.5: Kết quả đo độ hấp thu tại các bước sóng khác nhau 41

Bảng 4.6: Kết quả tính toán cho hàm lượng chlorophyll và carotenoid có trong dịch chiết 42

Bảng 4.7: Kết quả khối lượng các sắc tố tính theo 1gam tảo khô……… 44

Bảng 4.7: Giá trị Rf 45

Bảng 4.8: Kết quả theo thứ tự giải ly trên cột……… ……… 46

Bảng 4.9: Kết quả thể tích các sắc tố giải ly……….……… 47

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Các pha tăng trưởng trong nuôi vi tảo (Lavens và Sorgeloos, 1996) 5

Hình 2.2: Một vài hình ảnh Chlorella 6

Hình 2.3: Công thức cấu tạo của chlorophyll 7

Hình 2.4: Công thức cấu tạo chlorophyll b 10

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của β- carotene 15

Hình 2.6: Công thức cấu tạo của lycopen 16

Hình 3.1:Sơ đồ quy trình nghiên cứu……… …25

Hình 3.2: Chấm mẫu lên bản mỏng……… 32

Hình 3.3: Kỹ thuật giải ly kiểu dung môi đi lên nhờ lực mao dẫn……….33

Hình 4.1: Mẫu tảo tươi sau khi li tâm để tách nước: Error! Bookmark not defined Hình 4.2: Nồng độ chlorophyll a được chiết trong dung môi với thời gian chiết khác nhau……… ……… 37

Hình 4.3: Nồng độ chlorophyll b được chiết trong dung môi với thời gian chiết khác nhau……… … ……….37

Hình 4.4: Nồng độ carotenoid được chiết trong dung môi với thời gian chiết khác nhau……….38

Hình 4.5:Dịch chiết sắc tố trong dung môi N,N-DMF Error! Bookmark not defined Hình 4.6: Ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đến hàm lượng chlorophyll và carotenoid trong dịch chiết……….… 43

Hình 4.7: Hình ảnh các sắc tố trên bản mỏng 46

Hình 4.8: Dịch sắc tố sau khi tách bằng sắc ký cột 47

xii

DANH SÁCH PHỤ LỤC

Phụ lục 1: kết quả cho thí nghiệm đo độ ẩm của tảo sau li tâm……… 52 Phụ lục 2: Bảng AVOVA ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết lên hàm

lượng chlorophyll a thu được……… 52

Phụ lục 3: Bảng AVOVA ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết lên hàm

lượng chlorophyll b thu được……… 53

Phụ lục 4: Bảng AVOVA ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết lên hàm

lượng carotenoid thu được……… 53

Phụ lục 5:Bảng tính giá trị trung bình ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết

lên hàm lượng chlorophyll a thu được……… 54

Phụ lục 6: Bảng tính giá trị trung bình ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết

lên hàm lượng chlorophyll b thu được……… 54

Phụ lục 7: Bảng tính giá trị trung bình ảnh hưởng của loại dung môi và thời gian chiết

lên hàm lượng carotenoid thu được……… 55

Phụ lục 8: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến

hàm lượng chlorophyll a thu được……… 55

Phụ lục 9: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến

hàm lượng chlorophyll a thu được……… 56

Phụ lục 10: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến

hàm lượng chlorophyll b thu được……… 56

Phụ lục 11: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến

hàm lượng chlorophyll b thu được……… 57

xiii

Phụ lục 12: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến

hàm lượng carotenoid thu được……… 57

Phụ lục 13: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến

hàm lượng carotenoid thu được……… 58

Phụ lục 14: Bảng AVOVA ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng chlorophyll

a thu được……… 58

Phụ lục 15: Bảng AVOVA ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng chlorophyll

b thu được……… 59

Phụ lục 16: Bảng AVOVA đánh giá ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng

carotenoid thu được……… 59

Phụ lục 17: Bảng giá trị trung bình ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng

chlorophyll a thu được……… 60

Phụ lục 18: Bảng giá trị trung bình ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng

chlorophyll b thu được……… 60

Phụ lục 19: Bảng giá trị trung bình ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên hàm lượng

carotenoid thu được……… 60

Phụ lục 20: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên

hàm lượng chlorophyll a thu được……… 61

Phụ lục 21: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên

hàm lượng chlorophyll b thu được……… 61

Phụ lục 22: Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa lên

hàm lượng carotenoid thu được……… 62

vật Đặc biệt trong tảo chlorella có chứa rất nhiều chlorophyll và carotenoid Chlorella

có hàm lượng chlorophyll khá cao so với bất kỳ thực vật quang hợp nào được biết đến trên trái đất Chlorophyll giữ vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất đầu tiên nhận năng lượng ánh sáng cho hệ quang hợp Chlorophyll hấp thu ánh sáng chuyển

về dạng năng lượng ATP, trong quá trình xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử) tạo thành các sản phẩm oxy hóa khử Và trong cơ thể tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc tố bổ trợ quang hợp và là tác nhân bảo vệ tế bào khỏi tác hại của ánh sáng quá cao Đây là các sắc tố được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm

Có rất nhiều phương pháp chiết tách chlorophyll đã được công bố Một số tác giả

như Karsten, Schumann, Haubner, & Klausch, (2005) đã dùng dung dịch acetone 90% để

ly trích chlorophyll trên tảo Các tác giả này đã dùng hạt micro-bead trong qua trình đồng hóa để tăng khả năng phá vách tế bào lên gấp 3 lần so với các phương pháp khác Hiệu

suất thu hồi chlorophyll trong nghiên cứu này đạt 39 – 85% Trong một nghiên cứu khác, Ronen và Galun, (1984) đã dùng dimethyl sulfoxide (DMSO) để tách chiết chlorophyll từ

địa y (Ramalina duriaei) Ronen và các cộng sự cũng sử dụng dung dịch aceton 90% có

bổ sung MgCO3 để tách chlorophyll ở nhiệt độ lạnh và tránh ánh sáng Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu Nhật bản như Irijama, Shiraki và Yoshiura, (2011) cũng tiến hành nghiên

2

cứu tách chiết chlorophyll từ rau chân vịt (spinach) bằng dung môi aceton, methanol trong điều kiện lạnh và tối

Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Vĩnh, tôi đã thực hiện đề tài “NGHIÊN

CỨU CHIẾT CHLOROPHYLL VÀ CAROTENOID TỪ TẢO CHLORELLA” Trong khuôn khổ nghiên cứu này, một số dung môi khác nhau và các điều kiện tách chiết khác nhau được đưa vào thử nghiệm Thông qua kết quả thực nghiệm, ảnh hưởng của điều

kiện tách chiết khác nhau sẽ được đánh giá và so sánh từ đó rút ra điều kiện phù hợp nhất

được sử dụng để tách chiết chlorophyll và carotenoid từ tảo Chlorella Những kết quả của

đề tài hi vọng sẽ mang lại nhiều triển vọng trong việc chiết tách các chất màu từ thiên nhiên để ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và y dược

1.2 Mục đích của đề tài:

Tìm ra các điều kiện chiết chlorophyll và carotenoid từ tảo Chlorella bằng phương

pháp ngâm dầm trong điều kiện lạnh và tối

1.3 Nội dung đề tài:

Khảo sát loại dung môi dùng để chiết chlorophyll và carotenoid từ tảo chlorella

Tiến hành thí nghiệm để tìm ra được thời gian chiết và tốc độ đồng hóa thích hợp

để thu được hàm lượng chlorophyll và carotenoid cao nhất

1.4 Yêu c ầu:

Tìm được phương pháp chiết hợp lý để thu được nhiều chlorophyll và carotenoid nhất và ít bị biến đổi nhất

Tìm được hệ dung môi thích hợp cho quá trình chiết tách

Tìm được thời gian hợp lý để chiết được nhiều chlorophyll và carotenoid nhất

Loài: Chlorella vulgaris

2.1.2 Hình thái và các đặc điểm sinh học về ngành tảo lục

Tên Chlorella được lấy từ tiếng Hy Lạp “chloros” có nghĩa là màu xanh lá cây và phần hậu tố lấy từ tiếng Latin có nghĩa là “nhỏ bé”

Chlorella là một loại rong đã xuất hiện cách đây 2,5 tỷ năm và là dạng sống đầu tiên

có nhân Kích thước của tảo chỉ bằng tế bào hồng cầu người Dưới những điều kiện sống

tối ưu: nhiều ánh sáng, nước trong và không khí sạch, Chlorella sinh sản với tốc độ vô

cùng lớn Quá trình sinh sản nói chung được chia thành nhiều bước: Sinh trưởng – trưởng thành – thành thục – phân chia

Sự tăng trưởng của tảo là biểu hiện cho sự gia tăng về số lượng so với số lượng tảo cấy ban đầu (Pelczar và cộng sự, 1977; Pinij Kungvanki, 1988; trích bởi Trần Thị Mỹ

Xuyên, 2008) Sự tăng trưởng của các vi tảo nói chung và Chlorella nói riêng nuôi trong

điều kiện vô trùng đều thông qua 5 pha như sau:

4

• Pha log (pha ch ậm hoặc cảm ứng)

Sau khi cấy vào môi trường nuôi, quần thể tạm thời không thay đổi Điều này không có nghĩa là các tế bào không hoạt động Việc chậm phát triển là do sự thích nghi sinh lí của chuyển hóa tế bào để phát triển, như mức tăng enzyme và các chất chuyển hóa liên quan đến sự phân chia tế bào và cố định cacbon, ở giai đoạn này các tế bào cũng gia tăng về kích thước của chúng Ở cuối pha này, mỗi sinh vật bắt đầu phân chia

• Pha log (pha sinh trưởng theo hàm số mũ)

Ở pha này, mật độ tế bào tăng như là hàm số của thời gian theo hàm logarit:

Với Co và Ctlà các nồng độ tế bào tại thời điểm 0 và t tương ứng với m là tốc độ sinh trưởng đặc thù Tốc độ sinh trưởng đặc thù phụ thuộc chủ yếu vào loài tảo, cường độ ánh sáng và nhiệt độ Nếu nuôi trong các điều kiện tối ưu, tốc độ tăng trưởng là tối đa trong suốt giai đọan này

• Pha gi ảm tốc độ sinh trưởng (pha ngừng tăng trưởng tương đối)

Sự phân chia tế bào sẽ chậm lại khi các điều kiện về dinh dưỡng, ánh sáng, độ pH,

CO2 hoặc các yếu tố lý hóa khác bắt đầu hạn chế sự sinh trưởng

• Pha ổn định

Tại đây sự tăng trưởng theo pha hàm số mũ dần bắt đầu ngừng lại sau vài giờ hoặc vài ngày Quần thể duy trì ở mức ít hơn hoặc nhiều hơn ở một giá trị không đổi nào đó trong một thời gian, có thế đó là kết quả của sự ngừng phân chia hoàn toàn hoặc phân chia để

Vấn đề cần quan tâm trong sự suy tàn của tảo có thể do một số nguyên nhân như thiếu nguồn dưỡng chất, thiếu CO2, nhiệt độ cao, pH không ổn định do tình trạng nhiễm bẩn từ không khí Yếu tố then chốt giúp thành công trong nuôi tảo là duy trì tảo nuôi luôn ở pha log, có thể nói đây là pha luôn ổn định về số lượng và chất lượng

Hình 2.1: Các pha tăng trưởng trong nuôi vi tảo (Lavens và Sorgeloos, 1996)

Chlorella có dạng hình cầu, đường kính khoảng 2-10 μm và không có tiên mao

Chlorella có màu xanh lá cây nhờ sắc tố quang hợp chlorophyll -a và b trong lục lạp Thông qua quang hợp nó phát triển nhanh chóng chỉ cần lượng khí carbon dioxide, nước, ánh sáng mặt trời, và một lượng nhỏ các khoáng chất để tái sản xuất

6

Tảo lục đơn bào có chứa chlorophyll a và b, xanthophyll, hình thái rất đa dạng có loại đơn bào, có loại thành nhóm, có loại dạng sợi, có loại dạng màng, có loại dạng ống…phần lớn có màu lục như cỏ Sắc lạp có thể có hình phiến, hình lưới, hình trụ, hình sao… Thường có 2 - 6 thylakoid xếp chồng lên nhau Phần lớn có một hay nhiều pyrenoid nằm trong sắc lạp Nhiệm vụ chủ yếu của pyrenoid là tổng hợp tinh bột Trên sắc lạp của tảo lục đơn bào hay tế bào sinh sản di động của tảo lục có sợi lông roi (tiêm mao) dài bằng nhau và trơn nhẵn Có loại trên bề mặt lông roi có một hay vài tầng vẫy nhỏ Lông roi của tế bào di động ở tảo lục thường có hai sợi, một số ít có bốn sợi, 8 sợi hay nhiều hơn Cũng có khi chỉ có một sợi lông roi Phần lớn tế bào tảo lục có một nhân Một số ít có nhiều nhân Thành tế bào của tảo lục chủ yếu chứa cellulose

Hình 2.2: Hình ảnh tảo Chlorella

(Nguồn: http://wwwvietsciences.free.fr/khaocuu/Nguyenlandung/vitao01.htm)

2.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của tế bào Chlorella tùy thuộc vào tốc độ sử dụng môi trường

dinh dưỡng trong quá trình phát triển

8

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chứa trong tảo Chlorella

(Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

10 – 34 % 18,0 mg/gr 0,3 – 0,6 mg/gr

6 mg/gr 2,3 mg/100gr 3,5 mg/100gr

7 - 9 mg/100gr

25 mg/100gr

145 mg/100gr

9

Bảng 2.2: Thành phần aminoacid (%) của Chlorella

( Webb 1983; Nguyễn Hữu Đại,1999)

(Nguồn: http://www.tuberosr.com/chlorella.htm )

2.1.4 Vai trò của tảo:

Vi tảo có vai trò quan trọng trong đời sống và sản xuất, có nhiều thành tựu ứng dụng trong dời sống và trong lĩnh vực di truyền như:

10

- Sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng cho người và động vật

- Khai thác các hoạt chất từ tảo: Vitamin, lipit, sắc tố, cacbonhydrat, chất chống oxy hóa…

- Sử dụng làm phân bón sinh học

- Tảo xử lý nước thải

- Tạo nguồn năng lượng sạch

- Nâng cao giá trị dinh dưỡng của sinh khối vi tảo nuôi trồng công nghiệp thông qua việc tạo dòng gen mã hóa tổng hợp Protein giàu các axit amin không thay thế hoặc khai thác các siêu chủng sản xuất vitamin, các cắc tố quý

- Ứng dụng trong thực phẩm và trong y học

- Nghiên cứu đa dạng chủng loài

2.2 Sơ lược về chlorophyll

2.2.1 Khái niệm: Chlorophyll là sắc tố màu xanh giúp tảo sử dụng ánh sáng mặt

trời trong quá trình quang hợp, tổng hợp CO2 và H2O thành carbohydrate và tái tạo lại nguồn oxy cho trái đất

2.2.2 Cấu tạo và phân loại: Công thức chlorophyll nằm trên mặt phẳng là một

phức chất có nguyên tố trung tâm là magie (Mg) tạo nối với 4 nguyên tử nitơ (N) ở 4 vòng pyrole liên kết nhau bởi các nối methane

Chlorophyll có nhiều loại, trong đó có hai loại phổ biến là chlorophyll a và chlorophyll b:

- Chlorophyll a có công thức phân tử: C55H72O4N4Mg

11

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của chlorophyll

Chlorophyl b có công thức phân tử: C55H70O6N4Mg

Hình 2.2: Công thức cấu tạo chlorophyll b

Trong thực vật, hai loại này thường có tỉ lệ tương ứng là 3Chl.a : 1Chl.b

Chlorophyll a và chlorophyll b khác nhau ở vị trí C3 Loại chlorophyll a chứa nhóm methyl-CH3, loại chlorophyll b chứa nhóm fomyl – CHO

2.2.3 Tính chất của chlorophyll:

 Tính chất vật lý:

- Chlorophyll ở trong tế bào không bị mất màu vì nằm trong phức hệ protein và lipid, nhưng dung dịch chlorophyll ngoài ánh sáng và trong môi trường có oxy phân tử thì bị mất màu do bị oxy hóa dưới tác dụng của ánh sáng Quang phổ hấp thụ của chlorophyll là 400 – 700 nm ( có hai vùng hấp thụ 430 nm cho màu xanh lam, 662 nm

12

cho màu đỏ) Màu xanh đặc trưng của chlorophyll do kết quả sự hấp thụ ở vùng quang

phổ xanh và đỏ

- Có màu xanh lá cây, nó thường che các sắc tố khác như carotenoid, anthocyanin…

- Rất dễ biến màu khi thực vật biến đổi sinh lý (thay đổi mùa, sau thu hoạch…)

- Không tan trong nước nhưng khi đứt nối phytol nó trở thành tan trong nước Tan trong dung môi hữu cơ phân cực

- Khó giữ ổn định trong bảo quản

- Khi tế bào sống chlorophyll ở dạng phức chất với protein, khi tế bào chết protein

biến tính, chlorophyll tách ra và dễ tham gia phản ứng hóa học

 Tính chất hóa học:

- Tác dụng của nhiệt độ và acid:

Dưới tác dụng của nhiệt độ và môi trường acid của dịch bào, màu xanh bị mất đi

Một mặt là protein bị đông tụ làm vỏ tế bào bị phá hủy, mặt khác là do liên kết giữa chlorophyll và protein bị đứt làm chlorophyll dễ bị hydro thay thế tại vị trí Mg để thành

lập chất pheophytin có màu olive Chlorophyll b bền nhiệt hơn chlorophyll a

Trong môi trường acid mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy phân liên kết ester với rượu tạo thành hợp chất pheophorbide

- Tác dụng với kiềm:

Khi chlorophyll tác dụng với kiềm nhẹ (carbonate kiềm, kiềm phổ), hợp chất kiềm

sẽ trung hòa acid, muối acid của dịch bào tạo nên môi trường kiềm làm cho chlorophyll

bị xà phòng hóa tạo rượu phytol, methanol và muối của acid chlorophylic Các acid chlorophylic và muối của chúng đều có màu xanh đậm

Các hợp chất muối hay acid có Mg ở trung tâm còn giữ màu xanh lá cây Tuy nhiên

pH cao sẽ làm cho các vitamin như B1, C sẽ bị hư hỏng nhanh chóng

- Tác dụng của enzyme:

Enzyme chlorophyllase xúc tác thủy phân chlorophyll tạo thành chlorophyllide và giải phóng rượu phytol Enzyme này thường được định vị trong các sắc lạp, khá bền với nhiệt Nhiệt độ tối thích của enzyme này là 60o

C – 82oC, độ hoạt động giảm ở nhiệt độ

- Tác dụng với kim loại:

Dưới tác dụng của sắt, thiếc, đồng, nhôm thì Mg trong chlorophyll sẽ bị thay thế và cho màu khác nhau:

 Với sắt sẽ cho màu nâu

 Với thiếc và nhôm sẽ cho màu xám

 Với kẽm, đồng sẽ cho màu xanh sáng

Trong sản xuất thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất rau đóng hộp, người ta thường dùng các biện pháp sau đây để bảo vệ màu xanh của diệp lục:

Gia nhiệt nhanh chóng trong một lượng nước sôi lớn (khoảng 3-4lít/kg rau) để giảm hàm lượng acid Acid lúc này sẽ được bay đi cùng với hơi nước

Gia nhiệt rau xanh trong nước cứng, cacbonat kiềm thổ sẽ trung hòa một phần acid

của dịch bào

Ion Cu2+ và Zn2+ dễ trở thành nguyên tố trung tâm của chlorophyll để trở thành một

phức chất của kim loại có màu xanh Phức với Cu2+ được nhận ra ở nồng độ 1 – 2ppm, trong khi đối với kẽm xãy ra ở nồng độ lớn hơn 25ppm Các phức này ổn định trong dung dịch acid hơn trong dung dịch kiềm

- Sự oxi hóa chlorophyll:

Chlorophyll trong thời kỳ quang hợp được che chở bởi carotenoids và các lipid khác Khi già cỗi, trong trường hợp chlorophyll bị trích, hay tế bào bị hư, chlorophyll sẽ

bị oxy hóa, trở nên nhạt màu và hóa trắng Sự phân hủy do ánh sáng phá vỡ vòng pyrole thành các phân tử nhỏ Các oxygen tự do hay gốc –OH tự do sẽ tác dụng sâu sắc tới vòng

14

pyrole dẫn đến sự phá vỡ vòng porphyrin và làm mất màu Chlorophyll có thể bị oxy hóa dưới tác dụng của enzyme lipoxidate

(Nguồn: http://www.livestrong.com/article/470008-chlorella-vs-chlorophyll )

2.3 Sơ lược về carotenoid

2.3.1 Lịch sử và khái niệm về carotenoid:

Năm 1831, Wackenroder đã tách thành công Carotene từ cà rốt Năm 1837, Berzelius đã đặt tên cho chất màu màu vàng là Xanthophyll Sự kiện này là tiền đề cho việc nghiên cứu Carotenoid, sau đó được tiếp tục phát triển ra nhiều nơi trên thế giới Carotenoid đã trở thành đề tài nghiên cứu cho nhiều ngành khoa học như: hóa học, hóa sinh, sinh học, y dược, và nhiều ngành khoa học khác

Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn Hiện nay người ta

đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyll và carotene

- Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprence:

CH2 = C – CH = CH2

CH3

- Khác với cây cỏ, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn thực vật nhằm bảo vệ bản thân mình Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài

- Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể cũng tương tự nhau

- Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là β-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A Trong mấy năm gần đây người ta còn nói nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin,

2.3.2 Phân lo ại carotenoid

15

2.3.2.1 Theo cấu trúc hóa học: Carotenoid được chia làm hai nhóm theo cấu

trúc hóa học là carotene và xanthophil

Nhóm carotenes là những hydrocarbon (C40H56) có một mạch ngang 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 dây nối đôi liên hợp, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi

Có 4 loại carotene quan trọng là α – carotene, β – carotene, γ – carotene và lycopene α – carotene, β – carotene có những vòng ionon khép kín, α – carotene có một vòng α – ionon và một vòng β – ionon, β – carotene có cấu tạo đối xứng với hai vòng β – ionon nên khi thủy phân cho hai phân tử vitamine A, còn các carotene khác thủy phân chỉ cho một vitamine A

Carotene khi để ngoài không khí dễ hấp thụ oxi để trở thành dạng oxi hóa Carotene nguyên chất là các tinh thể đen có màu đỏ sáng của đồng và có ánh kim loại, dung dịch carotene có màu đỏ cam

2.3.2.1.1 Các carotene gồm có:

 β- carotene:

Công thức hóa học:

Hình 2.3: Công thức cấu tạo của β- carotene

- Gồm những sắc tố màu vàng, cam, xanh lá có ở hoa và rau

- Là tiền chất của vitamin A ở dạng tinh thể có màu đỏ đậm

- Tan trong benzen,chlorofom,ít tan trong methanol,ethanol và không tan trong nước

 α, γ – carotene:

- Dạng tinh thể có màu đỏ đậm, tan dễ dàng trong trong cloroform, và không tan trong nước

16

- Trong cơ thể γ - carotene chuyển hoá tạo thành một phân tử vitamin A

- γ - carotene có trong củ cà rốt, quả cà chua, trong một số loài rong biển

 Lycopen:

Công thức hóa học:

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của lycopen

- Là dạng đồng phân mở vòng hai đầu của β- carotene

- Có màu đỏ nhạt (do nhiều liên kết đôi của cacbon kết hợp với nhau) ví dụ như cà chua và các loại quả có màu đỏ

- Không tan trong nước, không có khả năng chuyển hoá thành vitamin A

2.3.2.1.2 Hợp chất xanthophyll: thường có màu vàng

- Xanthophyll có công thức phân tử là C40H56On (n : 1- 6) là dẫn xuất (dạng oxi hoá) của caroten Xanthophyll ở thực vật bậc cao, tảo luôn đi kèm với carotene

- Có nhiều loại xanthophyll: Cripthoxanthin, Lutein, Violaxanthin Các nguyên tử oxi liên kết trong các nhóm: hidroxyl, cacboxyl,…

- Bước sóng hấp thụ của cực đại của xanthophyll ở 451 - 481 nm

2.3.2.2 Phân loại theo đặc tính sinh học:

- Carotenoid sơ cấp: tham gia vào quang hợp hoặc bảo vệ

- Carotenoid thứ cấp: có trong các cơ quan hóa già hoặc bị bệnh khi thiếu dinh dưỡng Chính nhóm này là nguồn cung cấp vitamine A cho chúng ta, khi ăn các loại hoa,

quả có màu đỏ như: ớt, cà chua, bí ngô, đu đủ, gấc,…

(Nguồn: science.jrank.org/ /Plant-Pigment-Carotenoids.html)

2.3.3 Tính chất của carotenoid

 Tính tan: Hầu hết các carotenoid có tính thân dầu, không tan trong nước và

ít tan trong dung môi hữu cơ như acetone, cồn, ethyl ether, chloroform và ethyl acetate Các carotene dễ tan trong petroleum ether, hexan và toluene Xanthophyll tan tốt trong

Đa số carotenoid hấp thu cực đại ở 3 bước sóng Số lượng nối đôi liên hợp càng nhiều, giá trị λmax càng cao Do đó, hầu hết các carotenoid lycopene không vòng không bão hòa, với 11 nối đôi liên hợp, có màu đỏ và hấp thu bước sóng dài nhất (λmax bằng

444, 470, 502 nm)

 Đồng phân hóa và sự oxi hóa:

Carotenoid có độ bão hòa cao nên dễ bị đồng phân hóa và oxi hóa Nhiệt độ, ánh sáng, acid và sự hấp thu của các chất hoạt động bề mặt (nhôm ôxit ) thúc đẩy quá trình đồng phân hóa của dạng trans carotenoid, dạng thường gặp của chúng là dạng cis Nguyên nhân làm mất carotenoid là do sự oxi hóa, phụ thuộc vào sự có mặt của oxi và bị tác động bởi ánh sáng, enzyme, ion kim loại và đồng oxi hóa với lipid hydroperoxide

Dạng epoxide và apocarotenoid xuất hiện trong giai đoạn đầu của quá trình tổng hợp carotenoid trong thực vật

Sự phân chia tạo thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp tương tự với quá trình oxi hóa các acid béo, làm mất màu và mất hoạt tính sinh học Sự đồng phân hóa và oxi hóa carotenoid diễn ra trong quá trình chuẩn bị, quy trình chế biến và tồn trữ thực phẩm vì vậy cần có những giải pháp hạn chế các quá trình này để hàm lượng carotenoid trong sản phẩm mang tính ổn định cao

Bền vững đối với kiềm và tác động của nhiệt độ [12]

2.4 Tách chiết và tinh chế chlorophyll và carotenoid:

18

Chlorophyll thường được trích ly từ lá cây bằng các dung môi phân cực như methanol, acetone, DMSO, N,N-Dimethylformamide…Trong quá trình chiết tách thì Chlorophyll sẽ được chuyển dần sang dung môi và được chuyển sang pha petroleum

ether và được tinh chế bằng sắc ký Do chlorophyll dễ bị ôxi hóa nên trong quá trình chiết tách phải được thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng và nhiệt độ thấp

Để tinh chế chlorophyll, các chất hấp phụ chủ yếu thường dùng trong sắc ký là silicagel, cellulose, tinh bột Sau khi đã được hấp phụ lên cột, tách carotenoid bằng dung môi petroleum ether và tách chlorophyll bằng hệ dung môi petroleum ether-acetone

Nếu chỉ có một lượng nhỏ để phân tích và để định danh các thành phần của sắc tố thì thường sử dụng sắc kí bản mỏng vì tính hiệu quả nhanh của nó Gần đây, để phân tích một mẫu có chứa chlorophyll và carotenoid, người ta sử dụng sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography – HPLC) Ngoài việc là phân tích mẫu có chứa chlorophyll và carotenoid bằng HPLC còn có khả năng tách các thành phần nằm trong hỗn hợp sắc tố bằng cách sử dụng hệ dung môi thích hợp

2.5 Phương pháp phân tích, đo đạt các chỉ tiêu

2.5.1 Tổng quan về kỹ thuật sắc ký bản mỏng

Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỉ trước để tách các phẩm nhuộm từ cây cỏ Đến thập kỷ 1930- 1940, phương pháp này phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau

Sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

• Pha tĩnh là chất hấp phụ trơ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích.Ví dụ như silicagel hoặc oxid alumin, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại

• Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ

lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu

tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với

19

những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của

sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf

được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Rf = a/b (1) Trong đó:

+ a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm

+ b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Hệ thống sắc ký bản mỏng bao gồm:

- Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy

- Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu silicagel được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ solfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

- Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện

mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trông dung môi

- Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp

chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2

20

– 5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

• Với chất hấp thu là silicagel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di

chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm

2.5.2 So sánh s ắc ký lớp mỏng với các kỹ thuật sắc ký khác:

Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu , cần rất ít mẫu phân tích (vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay

kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau

So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kết quả

tệ hại do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nên quá trình

thực hiện phải kéo dài, dẫn đến kết quả không tốt Tiếp theo, kỹ thuật sắc ký lỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sử dụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp ban đầu,

đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng, tuy vậy vẫn mât thời gian Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) cho kết quả nhanh, tốt, cả về

mặt định tính lẫn định lượng nhưng máy rất đắt tiền, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị

Sắc ký cột

ch ớp nhoáng

Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi

Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi

Khí hoặc hơi của hợp

chất có tính bay hơi

Mẫu có tính bay hơi nhiều hay ít đều phù hợp

Vài mươi phút Vài phút Vài phút

Hi ệu quả Rất tốt Cần sắc kýn Cần sắc ký Rất tốt Rất tốt

 Sắc ký mỏng có một số ưu điểm sau:

Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và dài, nên quan sát viên sẽ khó phân biệt được đó là một mũi (để

chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn

2.5.3 S ắc ký cột:

Nguyên lí tách của sắc kí cột là mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ silicagel Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này

có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng

Các chất hấp phụ thường được sử dụng như silicagel, cellulose…trong đề tài này

chất hấp phụ được sử dụng là silicagel

23

Đối với dung môi là silicagel thì các chất có tính phân cực mạnh hơn sẽ được đẩy ra trước, các chất có tính phân cực yếu hơn sẽ được hấp phụ mạnh hơn

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Th ời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

− Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ 1/2012-10/08/2012

− Địa điểm: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Hóa Học, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

3.2.1 Nguyên liệu: tảo Chlorella được nuôi tại khu thực nghiệm Hoàng Anh-Bộ môn

Công nghệ hóa học, trường Đai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

1.1.1 Hóa chất:

N,N-Dimethylformamide 99,5% - Xuất xứ Trung Quốc

Acetone 99,5%-Xuất xứ Trung Quốc

Petroleum ether 60∼90 - Xuất xứ VN-Chemsol

Diethylamine 99%-Xuất xứ Trung Quốc

Sodium carbonate anhydrous 99,8% - Xuất xứ Trung Quốc

Silica gel 230-400 mesh

- Máy ly tâm thu tảo

- Máy đồng hóa IKA T25 Digital Ultra Turax

- Cân phân tích 4 số TE241S

- Máy đo quang phổ GENESYS 20

- Máy li tâm EBA 20

Đồng hóa

Ly tâm bỏ bã Ngâm dầm