NGHIÊN CỨU NUÔI DỊ DƯỠNG TẢO CHLORELLA

Sau đó tiến hành so sánh sản lượng sinh khối thu được để chọn môi trường tối ưu cho Chlorella tăng trưởng trong điều kiện dị dưỡng.. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của tảo tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NUÔI DỊ DƯỠNG TẢO CHLORELLA

HỌ VÀ TÊN:NGUYỄN THỊ BÍCH HUYỀN MSSV: 05126138

LỚP: DH05SH

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NUÔI DỊ DƯỠNG TẢO CHLORELLA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG VĨNH NGUYỄN THỊ BÍCH HUYỀN

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Trương Vĩnh tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Quý thầy cô và các bạn trong bộ môn Công nghệ hóa học đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm I4

Các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm học tại trường Cám ơn các bạn lớp DH05SH

đã cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt 4 năm học

Cám ơn ba mẹ là người đã sinh thành, nuôi nấng và dạy dỗ cũng như là nguồn động viên, an ủi con trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng vì còn nhiều hạn chế trong chuyên môn, kinh nghiệm, thời gian, kỹ thuật,… nên đề tài chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý, đánh giá của quý thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn thiện hơn

Chân thành cảm ơn

Tháng 08 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Bích Huyền

TÓM TẮT

Đề tài tiến hành nuôi sinh khối Chlorella trong điều kiện dị dưỡng Khảo sát môi

trường thích hợp cho sinh khối cao Chlorella với điều kiện không có ánh sáng và môi trường được bổ sung đường Glucose và Urea Sau đó tiến hành so sánh sản lượng sinh

khối thu được để chọn môi trường tối ưu cho Chlorella tăng trưởng trong điều kiện dị

dưỡng Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của tảo trong điều kiện dị dưỡng bằng cách khảo sát mối liên hệ của trọng lượng khô so với sinh khối tảo ở điều kiện tối ưu

về Glucose và Urea trong thí nghiệm, đồng thời khảo sát ảnh hưởng của các thế hệ tảo

dị dưỡng lên trọng lượng khô thu được

Kết quả nuôi cho thấy tảo Chlorella nuôi dị dưỡng cho sinh khối nhiều và tăng sinh

khối nhanh, hầu hết đạt đỉnh sinh khối vào ngày thứ 4 nuôi cấy Môi trường tối ưu cho Chlorella trong điều kiện của thí nghiệm là tảo được nuôi trong tối với môi trường Basal có bổ sung 3,6 g/l urea và 80 g/l glucose cho sinh khối tối đa là 30,9 triệu tb/ml Khảo sát trọng lượng khô cho thấy trọng lượng khô tối đa thu được tại đỉnh sinh khối

là 5,25 g tương ứng với 30,9 triệu tb/ml

Nghiên cứu chất lượng và lượng chất khô trong tảo dị dưỡng qua các thế hệ khác nhau bằng cách khảo sát trọng lượng khô trên cùng một số lượng tế bào Khảo sát trong điều kiện nghiên cứu cho thấy tảo dị dưỡng F3 cho trọng lượng khô cao nhất với 0,2188 g/109 tb Từ đó ta có thể ứng dụng trong sản xuất và bảo quản tảo đế có kết quả tốt nhất, đem lại hiệu quả sản xuất và kinh tế cao

SUMMARY

The goal of this experiment is to cultivate the microalgae Chlorella under hetetrotrophic condition Study medium suitable for the high-yield biomass of Chlorella growth in the dark where concentrated nutrients containing glucose and urea

were fed into the culture Comparison of biomass yields to get the best nutrients

condition for heterotrophic Chlorella Study the relation between dry cell weight and biomass at the best nutrients condition and the influence of the different Chlorella generations on the dry cell weight at the same time to aware of Chlorella growth in the

Study the quality and the dry weight in the different generations heterotrophic micro alga through study dry weight in the same quantity cells In this experiment, the 3st generation heterotrophic Chlorella had the hightest dry cell weight of 0,2188 g/109cells So we can apply these result to produce and preserve Chlorella

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình viii

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan về tảo lục Chlorella 3

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu về tảo lục Chlorella 3

2.1.1.1 Phân loại 3

2.1.1.2 Hình thái và các đặc điểm sinh học nghành tảo lục 3

2.1.1.3 Thành phần hóa học 5

2.1.2 Tăng trưởng 7

2.1.2.1 Pha lag (pha chậm hoặc cảm ứng) 7

2.1.2.2 Pha log (pha sinh trưởng theo hàm số mũ) 8

2.1.2.3 Pha giảm tốc độ sinh trưởng 8

2.1.2.4 Pha ổn định 8

2.1.2.5 Pha suy tàn 8

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo 9

2.1.3.1 Yếu tố hóa học 9

2.1.3.2 Các yếu tố vật lí 9

2.1.3.3 Các yếu tố sinh học 11

2.2 Các phương pháp nuôi tảo 11

2.2.1 Nuôi từng mẻ 12

2.2.2 Nuôi liên tục 13

2.2.3 Nuôi bán liên tục 14

2.3 Định lượng sinh khối tảo 14

2.4 Tách sinh khối tảo 15

2.5 Sấy sinh khối tảo 16

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.2.1 Nguồn tảo giống Chlorella 17

3.2.2 Hóa chất và thiết bị 17

3.2.2.1 Hóa chất 17

3.2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 17

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 18

A Thí nghiệm 1: Tác động của glucose trong nuôi dị dưỡng Chlorella 18

B Thí nghiệm 2: Tác động của urea trong nuôi dị dưỡng Chlorella 19

C Thí nghiệm 3: Tương quan giữa trọng lượng khô – sinh khối Chlorella 19

D Thí nghiệm 4: Khảo sát trọng lượng khô của Chlorella qua các thế hệ 20

3.3.2 Các chỉ tiêu và phương pháp nghiên cứu 20

3.3.2.1 Mật độ tảo 20

3.3.2.2 Trọng lượng sinh khối tảo khô 21

3.3.3 Xử lý số liệu 21

Chương 4 Kết quả và thảo luận 22

4.1 Thí nghiệm 1: Tác động của glucose trong nuôi dị dưỡng Chlorella 22

4.2 Thí nghiệm 2: Tác động của urea trong nuôi dị dưỡng Chlorella 24

4.3 Thí nghiệm 3: Tương quan giữa trọng lượng khô – sinh khối Chlorella 26

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát trọng lượng khô của Chlorella qua các thế hệ 28

Chương 5 Kết luận và đề nghị 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề nghị 30

Tài liệu tham khảo 31 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chứa trong tảo Chlorella 5

Bảng 2.2 Thành phần sinh hóa của Chlorella vulgaris 6

Bảng 2.3 Thành phần aminoacid (%) của Chlorella sp 6

Bảng 4.1 Kết quả mật độ tế bào (triệu/ml) Chlorella ở 3 nồng độ Glucose 22

Bảng 4.2 Kết quả mật độ tế bào (triệu tb/ml) Chlorella ở 3 nồng độ urea 24

Bảng 4.3 Kết quả mật độ và trọng lượng khô tương ứng của Chlorella 26

Bảng 4.4 Kết quả trọng lượng khô của tảo dị dưỡng qua các thế hệ từ F1-F5 28

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh tảo Chlorella 4

Hình 2.2 Các pha tăng trưởng trong nuôi vi tảo 7

Hình 2.3 Thiết bị nuôi sản xuất sinh khối tảo trong ống xoắn ở Úc 12

Hình 2.4 Sơ đồ sản xuất dùng cho nuôi tảo theo từng mẻ 13

Hình 3.1 Sơ đồ hệ thống nuôi tảo dị dưỡng có sục khí 18

Hình 3.2 Hệ thống nuôi tảo dị dưỡng sục khí qua NaOH 19

Hình 4.1 Tảo Chlorella quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x 22

Hình 4.2 Đồ thị mật độ tế bào tảo Chlorella nuôi dị dưỡng với các giá trị Gi 23

Hình 4.3 Bình tảo Chlorella sau 4 ngày nuôi dị dưỡng 24

Hình 4.4 Đồ thị mật độ tế bào tảo Chlorella nuôi dị dưỡng với các giá trị Ui 25

Hình 4.5 Đồ thị tương quan mật độ tế bào (triệu tb/ml) và trọng lượng khô (g/l) 27

Hình 4.6 Đồ thị khảo sát trọng lượng khô tế bào tảo dị dưỡng qua 5 thế hệ 29

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, tảo lục tiểu cầu Chlorella đã được nghiên cứu và biết đến với rất

nhiều chức năng và công dụng khác nhau và trở thành một loài vi tảo cực kỳ quí giá Tảo lục có tới 18 loại axit amin, 16 loại vitamin, 11 loại khoáng chất, nhiều loại men, hydrocacbonat, DNA và RNA, đường, chất xơ, axit béo không no, omega-3, giàu các chất khoáng đa lượng và vi lượng, đặc biệt có hàm lượng Chlorophyll cao nhất trong các loài thực vật mà con người được biết đến, ngoài ra còn chứa một thành phần độc đáo là nhân tố tăng trưởng tự nhiên CGF

Với tốc độ sinh trưởng, sinh khối tăng nhanh, vi tảo rất thích hợp để đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp nhằm giải quyết các vấn đề thực phẩm của cả người

và là nguồn nguyên liệu cho chăn nuôi Những năm gần đây, tảo Chlorella còn được

chú ý nghiên cứu sử dụng trong sản xuất biodiesel làm nguồn năng lượng thay thế cho nguyên liệu truyền thống và đã cho nhiều kết quả đáng lưu ý và rất tiềm năng Ngoài

ra, Chlorella cũng được phát hiện là nguồn tiềm lực tự nhiên lớn để có thể ứng dụng

sản xuất thực phẩm chức năng, li trích và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao Trong đó có lutein, một carotenoid quan trọng trong cơ thể đóng vai trò lớn trong hình thành sắc tố mô động vật Lutein cũng đóng vai trò là một máy lọc năng lượng cao

Tại Việt Nam, nguồn nguyên liệu tảo khá phong phú, đặc biệt là tảo Chlorella

Tảo ở Việt Nam chủ yếu được nuôi trong môi trường tự dưỡng dưới điều kiện ánh sáng tự nhiên hoặc nhân tạo và được dùng làm thực phẩm Hiện nay, tảo cũng là đề tài đang được các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất chú ý để phát triển nhằm có thể sử dụng triệt để hơn nữa nguồn nguyên liệu quý giá này Do đó, việc nghiên cứu môi trường

dinh dưỡng nhằm nâng cao những giá trị dinh dưỡng có trong tảo Chlorella và cho tốc

độ sinh trưởng nhanh là vô cùng cần thiết và đem lại nhiều lợi ích kinh tế để ứng dụng

Chlorella vào sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, những nghiên cứu về tảo Chlorella

trong môi trường dị dưỡng là một trong những hướng chưa được nghiên cứu nhiều tại

Việt Nam Do đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi dị dưỡng tảo Chlorella”

Yêu cầu của đề tài

Tìm ra điều kiện, ảnh hưởng của nitrate và glucose trong nuôi sinh khối vi tảo

Chlorella trong môi trường dị dưỡng Từ đó xác định điều kiện môi trường nuôi cấy

thích hợp để thu được sinh khối Chlorella cao nhất

Xác định đặc tính sinh khối tảo Chlorella nuôi dị dưỡng, trọng lượng khô của tảo

trong điều kiện dị dưỡng

1.2 Nội dung thực hiện

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glucose trên sản lượng sinh khối Chlorella từ

đó xác định hàm lượng glucose tối ưu cho tảo phát triển trong điều kiện dị dưỡng

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nitrogen trên sản lượng sinh khối Chlorella từ

đó xác định hàm lượng nitrogen tối ưu cho tảo Chlorella phát triển trong điều kiện dị

dưỡng

Khảo sát trọng lượng khô của tảo thu được trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối

ưu về glucose và nitrate

Khảo sát trọng lượng khô của tảo dị dưỡng qua các thế hệ khác nhau

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về tảo lục Chlorella

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu về tảo lục Chlorella

2.1.1.2 Hình thái và các đặc điểm sinh học ngành tảo lục

Ngành tảo lục là ngành lớn nhất của tảo, hiện đã phát hiện được khoảng 20.000 loài Hình thái cơ thể có tất cả các dạng (trừ dạng amíp) như mônát, hạt, tập đoàn, palmella, đa bào dạng sợi, dạng bản, dạng ống hoặc dạng cây Tảo lục phân bố rộng khắp từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng đến nước lợ và nước biển Một số bộ chỉ sống ở biển Một số sống trên vật ẩm hay sống ngay dưới mặt đất Việt Nam đã phát hiện được hơn 1000 loài (Dương Đức Tiến và Võ Hành, 1998)

Hầu hết các tế bào có một nhân, nhưng nhiều nhân cũng có ở một vài bộ (như

Cauleurpales), một số chi của bộ Chlorococcales (như Hydrodictyon) Có vách tế bào, trừ Polyblepharidacea và một số tế bào sinh sản vận động của nhóm khác, nguyên

sinh chất bao quanh bởi màng sinh chất Nhiều trường hợp, tế bào ở tình trạng đang già trong nuôi cấy cạn kiệt Nitơ thì vách tế bào của chúng dày lên nhiều

Tảo có màu xanh lục thuần khiết do diệp lục a, b chiếm ưu thế (trừ một số sống

ở nơi ẩm có màu vàng do chứa nhiều dầu và hematocrom) Ngoài diệp lục còn có µ, β,

và γ caroten và vài xanthophyll Sản phẩm đồng hóa là tinh bột, có khi là dầu Sắc tố tập trung trong cơ quan quang thể màu Thể màu ở tảo lục có hình thái rất đa dạng và

thường là đặc điểm quan trọng cho định loại Trong thể màu có các vùng khác biệt gọi

là hạch tạo bột, đây có thể là đặc điểm cho sự hình thành tinh bột Tuy nhiên, vai trò của hạch tạo bột trong hình thành tinh bột là không rõ, vì nhiều loài hoàn toàn không

có hạch tạo bột mà tinh bột vẫn được hình thành (như ở Microspora)

Ngoài hạch tạo bột, trên thể màu của các tảo lục dạng mô nát và hầu hết các tế bào sinh sản vận động của các tảo lục không phải dạng mônát có chứa bào quan sắc tố (đặc biệt là điểm mắt đỏ), chúng được xem là cơ quan cảm nhận ánh sáng

Tế bào tảo lục còn chứa các nội quan khác giống như các sinh vật có nhân khác như Golgi, ty lạp thể, lưới nội chất Nhiều loài, tế bào chất lấp đầy tế bào

(Chlamydomonas, Chlorococcum) trong khi một số khác (Spirogyra) một không bào

lớn chiếm phần lớn khoang tế bào

Sinh sản ở tảo lục rất đa dạng, có thể gặp phổ biến cả 3 hình thức sinh sản là sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính có tất cả các kiểu đẳng giao, dị giao, toàn giao, tiếp hợp, noãn giao với túi noãn và túi tinh đơn bào hoặc đa bào (Đặng Thị Sy, 2005)

Tảo lục có thể sinh trưởng tự dưỡng trong môi trường nước ngọt, nước lợ, nước mặn với ánh sáng tự nhiên hoặc nhân tạo Ngoài ra, tảo lục cũng sinh trưởng theo cấp

số mũ trong điều kiện dị dưỡng (trong tối với acetate như là nguồn Carbon) Tỉ lệ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ acetate (Endo, Sansawa và Nakajima, 1977; Đặng Thị

2.1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của tế bào Chlorella tùy thuộc vào tốc độ sử dụng môi

trường dinh dưỡng trong quá trình phát triển

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chứa trong tảo Chlorella

Protein tổng sốGluxit

LipidSterolSterinβ-CarotenXanthophyllChlorophyll aChlorophyll bTro

Vitamin B1

Vitamin CVitamin KVitamin B6Vitamin B2Vitamin B12 Niacin Acid Nicotinic

40 – 60 %

25 – 35 %

10 – 15 % 0,1- 0,2 % 0,1- 0.5 % 0,16 % 3,6 – 6,6 % 2,2 % 0,58 %

10 – 34 % 18,0 mg/gr 0,3 – 0,6 mg/gr

6 mg/gr 2,3 mg/100gr 3,5 mg/100gr

Bảng 2.2 Thành phần sinh hóa của Chlorella vulgaris

Thành phần Đơn vị (% trọng lượng tảo khô) Protein

Lipid Saccharide Vitamin Khoáng

35,30 3,99 4,27 20,39 26,88 (Nguyễn Hữu Đại, 1999; Nguyễn Vy Hải và Nhữ Thế Dũng, 2008 )

Bảng 2.3 Thành phần aminoacid (%) của Chlorella sp

Arginine Aspartic Threonine Serine Glutamic acid Proline

Glucine Alanine Valine Cystein Methionine Isoleucine Leucine Tyrocine Phenyl Lycine Trytophan Histidine Taurin

5,17 9,24 5,44 5,32 15,10 5,19 9,23 10,97 6,24 0,40 0,22 4,08 8,30 2,47 4,12 5,63 1,23 1,59 0,04 (Nguyễn Hữu Đại, 1999; Nguyễn Vy Hải và Nhữ Thế Dũng, 2008)

Thành phần hóa học của các loài Chlorella phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của

nitơ trong môi trường Khi lượng nitơ có trong môi trường thấp thì hàm lượng protein

của Chlorella giảm xuống rõ rệt trong khi lượng cacbohydrat và lipid lại tăng lên

Tảo có khả năng hấp thu CO2 và các muối khoáng cần thiết để tổng hợp protein, glucid, lipid… Có thể thay đổi tùy theo điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ,

độ mặn… (Vũ Thị Tám, 1982) Các nguyên tố vô cơ cũng có chức năng sinh lý quan

trọng đối với thực vật (C, H, O, K, Mg, Fe, Cu,…) Ngoài ra, Chlorella còn chứa

glucid, acid amine thiết yếu, nhiều loại vitamin như: carotene, thiamine, niacine, paridoxine, choline, acid lipoic, acidpentonoid, ….các vitamin nhóm C, A, B1, B2, B6, K… có nhiều trong tế bào tảo tươi

2.1.2 Tăng trưởng

Tăng trưởng là biểu hiện cho sự gia tăng về số lượng so với số lượng tảo cấy ban đầu (Pelczar và cộng sự, 1977; Pinij Kungvanki, 1988; Trần Thị Mỹ Xuyên, 2008) Sự

tăng trưởng của các vi tảo nói chung và Chlorella nói riêng nuôi trong điều kiện vô

trùng đều thông qua 5 pha như sau

Hình 2.2 Các pha tăng trưởng trong nuôi vi tảo

(Lavens và Sorgeloos, 1996; Nguyễn Vy Hải,

Nhữ Thế Dũng, 2008)

2.1.2.1 Pha lag (pha chậm hoặc cảm ứng)

Sau khi cấy vào môi trường nuôi, quần thể tạm thời không thay đổi Điều này không có nghĩa là các tế bào không hoạt động Việc chậm phát triển là do sự thích nghi sinh lí của chuyển hóa tế bào để phát triển, như mức tăng enzyme và các chất chuyển

hóa liên quan đến sự phân chia tế bào và cố định cacbon, ở giai đoạn này các tế bào cũng gia tăng về kích thước của chúng Ở cuối pha này, mỗi tế bào bắt đầu phân chia

2.1.2.2 Pha log (pha sinh trưởng theo hàm số mũ)

Ở pha này, mật độ tế bào tăng như là hàm số của thời gian theo hàm logarit:

2.1.2.3 Pha giảm tốc độ sinh trưởng (pha ngừng tăng trưởng tương đối)

Sự phân chia tế bào sẽ chậm lại khi các điều kiện về dinh dưỡng, ánh sáng, độ

pH, CO2 hoặc các yếu tố lý hóa khác bắt đầu hạn chế sự sinh trưởng

2.1.2.4 Pha ổn định

Tại đây sự tăng trưởng theo pha hàm số mũ dần bắt đầu ngừng lại sau vài giờ hoặc vài ngày Quần thể duy trì ở mức ít hơn hoặc nhiều hơn ở một giá trị không đổi nào đó trong một thời gian, có thế đó là kết quả của sự ngừng phân chia hoàn toàn hoặc phân chia để bù vào số tế bào bị chết

2.1.2.5 Pha suy tàn

Ở giai đoạn này các nhà nuôi tảo đều không mong muốn tuy nhiên không thể tránh khỏi giai đoạn này Đây là giai đoạn mà các tế bào tảo chết nhanh hơn là tốc độ sản sinh ra tế bào mới Do chất lượng nước bị giảm, nguồn dinh dưỡng bị cạn kiệt đến mức không thể duy trì được sự sinh trưởng và phát triển của tảo Lúc này mật độ tế bào giảm theo cấp số nhân và việc nuôi cũng kết thúc

Sự tăng trưởng ổn định chỉ có thể đạt đến giá trị tối đa khi được nuôi dưới những điều kiện tăng trưởng tối ưu đặc biệt là về nhiệt độ, ánh sáng và dinh dưỡng Nhưng nếu chuyển sang môi trường không thích hợp thì mật độ tảo sẽ giảm đi một cách đáng

kể Vấn đề cấp thiết trong việc nuôi tảo là phải kiểm soát được điều kiện nuôi Điều kiện này chỉ có thể đạt được khi nuôi trong điều kiện môi trường được vô trùng, kiểm soát không khí và cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, pH có thể thay đổi theo ý muốn Vấn đề cần quan tâm trong sự suy tàn của tảo có thể do một số nguyên nhân như thiếu nguồn dưỡng chất, thiếu CO2, nhiệt độ cao, pH không ổn định do tình trạng

nhiễm bẩn từ không khí Yếu tố then chốt giúp thành công trong nuôi tảo là duy trì tảo nuôi luôn ở pha log, có thể nói đây là pha luôn ổn định về số lượng và chất lượng

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo

2.1.3.1 Yếu tố hóa học

a Ảnh hưởng của pH

pH xác định độ hòa tan của CO2 và muối khoáng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất ở tảo Hầu hết các giống tảo được nuôi trong môi trường đều có giá trị pH nhất định Thông thường khoảng pH cho phép là 7 - 9 và theo nhiều tài liệu pH tối ưu

là 8,2 - 8,7 Bên cạnh đó khi thay đổi pH đột ngột có thể làm cho tảo nhanh chóng bị tàn lụi Trong trường hợp nuôi tảo với mật độ cao thì việc bổ sung CO2 sẽ giúp điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình tảo phát triển, độ pH có thể đạt đến giá trị tới hạn là

9 Nhiều trường hợp việc nuôi trồng tảo thất bại có thể do pH không thích hợp Điều này có thể khắc phục bằng cách sục khí môi trường nuôi (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

b Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng /môi trường nuôi

Các môi trường dinh dưỡng dùng cho nuôi trồng tảo phải dựa theo nhu cầu dinh dưỡng của từng loài tảo Môi trường dinh dưỡng tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào mật độ quần thể, ánh sáng và pH môi trường Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm: nitrat, phosphat…Các nguyên tố vi lượng được coi là không thể thay thế đối với sinh trưởng

và phát triển của tảo là Fe, Mn, Cu, Zn và Cl Những vi lượng khác có vai trò quan trọng đối với một số nhóm tảo là Co, B, Si,…

2.1.3.2 Các yếu tố vật lí

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi loài tảo thích hợp với nhiệt độ tối ưu và biên độ nhiệt khác nhau tùy theo loài (Trịnh Trường Giang, 1997) Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng

Nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi tảo trong khoảng từ 18 - 25oC mặc dù chúng

có thể thay đổi tùy theo thành phần môi trường nuôi, loài nuôi và dòng nuôi Nhìn chung các loài tảo nuôi thường chịu đựơc nhiệt độ trong khoảng 16 – 27oC Nhiệt độ thấp hơn 16oC sẽ làm chậm sự tăng trưởng, trong khi đó nhiệt độ tăng cao hơn 35oC sẽ gây thiệt hại cho một số loài (Lavens và Sordeloos,1996; Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

b Khuấy sục môi trường nuôi (chế độ sục khuấy)

Trong quá trình nuôi tảo việc khuấy sục có tác dụng: giúp ngăn ngừa hiện tượng phân tầng nhiệt độ trong dịch nuôi, giúp tế bào tảo tiếp xúc đều với ánh sáng, ngăn ngừa tảo lắng xuống bể, cải thiện trao đổi khí giữa môi trường nuôi và không khí, quan trọng hơn là cung cấp CO2 cho quá trình quang hợp Trong trường hợp nuôi với mật độ cao, CO2 từ không khí (chỉ chứa 0,03 % CO2) sẽ làm hạn chế sinh trưởng của tảo Vì vậy việc bổ sung CO2 tinh khiết với tỉ lệ 1 % thể tích không khí Việc bổ sung CO2 có tác dụng giúp ổn định pH do cân bằng giữa CO2 và HCO3 Tùy thuộc vào quy mô của

hệ thống nuôi mà ta có thể sục khuấy hằng ngày bằng tay (ống nghiệm, các bình tam giác), sục khí (các túi, các bể) hoặc các guồng hay bơm chạy bằng điện (ao) Tuy nhiên không phải tất cả các loài tảo đều có thể chịu đựng được với chế độ sục khuấy mạnh (Lavens và Sorgeloos, 1996; Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

c Ảnh hưởng của ánh sáng

Cường độ ánh sáng đóng vai trò quan trọng nhưng yêu cầu về cường độ ánh sáng thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật độ tảo nuôi Khi nuôi ở độ sâu lớn và mật độ cao thì cường độ ánh sáng thay đổi từ 1000 - 10000 lux, tối ưu 2500 -

5000 lux tùy vào thể tích Có thể là ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng tối thiểu là 18 h/ngày, tối đa là 24 h/ngày tùy vào thể tích Tuy nhiên không phải tất cả các phiêu sinh vật đều chịu được ánh sáng liên tục nhưng phần lớn các giống tảo làm thức ăn đều chịu được ánh sáng liên tục Điều này không

có nghĩa là cứ cung cấp thêm năng lượng ánh sáng cho một dịch nuôi là sinh khối sẽ tăng (Robert, 1971; Đậu Thị Như Quỳnh, 2001)

Tuy nhiên, Chlorella có thể sinh trưởng dị dưỡng trong một nguồn carbon hữu cơ

và tạo ra mật độ tế bào cao trong một quy mô lớn hơn Môi trường nuôi có chứa 5% giống khởi động được lắc liên tục trong tối (180 vòng/phút) tại nhiệt độ 28 ± 1oC (Shi,

Chen, 2000) Trong một nghiên cứu nuôi dị dưỡng Chlorella trong môi trường có bồ

sung và giữ cho nồng độ glucose đạt 40 g/l, nồng độ ban đầu của urea là 3,6 g/l trong fermenter 30l thì trọng lượng khô tối đa thu được là 45,8 g/l (Shi, Chen, 2002) Như vậy, nếu môi trường nuôi được bổ sung đầy đủ nguồn carbon và nitrate thì ánh sáng không còn cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tảo

2.1.3.3 Các yếu tố sinh học

Lây nhiễm vi khuẩn, nguyên sinh động vật hoặc của các loài tảo khác là vấn đề khó khắc phục đối với việc nuôi cấy tảo thuần chủng cũng như nuôi cấy vô trùng Các nguồn gây nhiễm phổ biến nhất gồm có môi trường nuôi (nước và các chất dinh dưỡng), không khí, bình nuôi và tình trạng giống nuôi cấy ban đầu

Tảo bị nhiễm tạp sẽ ức chế về nhiều mặt trong quá trình phát triển dẫn đến sinh khối đạt được không cao và chất lượng tảo giảm đi rất nhiều, thậm chí không thể sử dụng được Sự cạnh tranh về dinh dưỡng, ánh sáng, CO2 và ảnh hưởng của một số chất độc gây ức chế từ các tác nhân gây nhiễm đối với tảo nuôi là những tác hại chính của

sự tạp nhiễm

Việc chuẩn bị các bình nuôi có dung tích nhỏ là khâu quyết định trong việc tăng môi trường nuôi cấy tảo Bình nuôi được chuẩn bị qua các giai đoạn Trước tiên rửa bằng xà phòng, sau đó tráng rửa bằng nước nóng Làm sạch bình nuôi với 30% acid muriatic, sau đó tráng sạch lại bằng nước nóng Bình nuôi được sấy khô trước khi sử dụng Theo cách khác, các ống, bình và bình lớn bằng thủy tinh có thể được khử trùng bằng nồi hấp, có thể sử dụng các bình nuôi dùng một lần rồi vứt bỏ như túi polyetylen

2.2 Các phương pháp nuôi tảo

Tảo có thể được sản xuất bằng cách áp dụng một loạt các phương pháp khác nhau, từ các phương pháp được áp dụng trong phòng thí nghiệm đến các phương pháp khó kiểm soát hơn trong các bể nuôi ngoài trời Thuật ngữ dùng để mô tả các điều kiện nuôi gồm có:

Hệ thống nuôi tảo trong nhà hoặc ngoài trời: nuôi trong nhà cho phép kiểm soát cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, hàm lượng chất dinh dưỡng, tạp nhiễm các sinh vật ăn mồi sống và các tảo cạnh tranh Ngược lại, các hệ thống nuôi ngoài trời làm cho việc nuôi trồng duy trì một loài tảo thuần trong thời gian dài là rất khó khăn

Hình 2.3 Thiết bị nuôi sản xuất sinh khối tảo

trong ống xoắn ở Úc (Yusuf Chisti, 2007;

Nguyễn Vy Hải, Nhữ Thế Dũng, 2008)

Hệ thống nuôi hở hoặc kín: nuôi hở như nuôi ở các ao, hồ, bể nuôi không có mái che sẽ dễ bị nhiễm tạp bẩn hơn so với các dụng cụ nuôi kín như các ống nghiệm, bình tam giác, túi…

Nuôi sạch (vô trùng) hoặc không vô trùng: nuôi vô trùng là nuôi không có bất

kỳ sinh vật ngoại lai nào và đòi hỏi khử trùng rất cẩn thận tất cả các dụng cụ thủy tinh, môi trường và các bình nuôi để tránh nhiễm tạp Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế đối với quy mô công nghiệp

Nuôi từng mẻ, nuôi liên tục và bán liên tục: dưới đây là ba kiểu nuôi thực vật phù du cơ bản, trong đó có tảo

2.2.1 Nuôi từng mẻ

Nuôi từng mẻ gồm có việc cấy đơn các tế bào trong một thùng chứa môi trường, tiếp theo là một thời kì phát triển vài ngày và tiến hành thu hoạch khi quần thể đạt tối đa hoặc gần tối đa Trong thực hành, tảo được chuyển sang các thùng nuôi có dung tích lớn hơn trước khi đạt tới pha ổn định và sau đó khối lượng nuôi lớn được tăng lên với mật độ tối đa và thu hoạch Có thể áp dụng các giai đoạn liên tiếp sau đây: các ống nghiệm, các bình tam giác 2 lít, các bình lớn 5 lít và 10 lít, các bình hình trụ

160 lít, các bể nuôi trong nhà 500 lít, các bể nuôi ngoài trời dung tích 5000 lít tới

25000 lít

Hình 2.4 Sơ đồ sản xuất dùng cho nuôi tảo theo từng mẻ (Lee và

Tamaru, 1993; Cao Tuấn Kiệt, 2007)

Tùy theo nồng độ tảo, dung tích nguyên liệu cấy thường tương ứng với dung tích của giai đoạn trước trong quá trình tăng khối lượng tảo, bằng 2 – 10 % khối lượng nuôi cuối cùng Hệ thống nuôi mẻ ngày càng được áp dụng phổ biến do tính đơn giản

và linh hoạt của chúng cho phép thay đổi các loài tảo nuôi và khắc phục các sự cố trong hệ thống nhanh chóng Tuy nhiên, nuôi mẻ có hạn chế là chất lượng của các tế bào tảo thu hoạch có thể ít đoán trước được so với chất lượng ở các hệ thống nuôi liên tục và biến động theo lịch thời gian thu hoạch (thời gian của ngày, pha sinh trưởng chính xác)

Một hạn chế khác của nuôi từng mẻ là phải ngăn ngừa sự nhiễm bẩn trong lần cấy ban đầu và thời kỳ sinh trưởng lúc đầu Do mật độ của thực vật phù du mong muốn thấp và nồng độ các chất dinh dưỡng cao nên các chất gây ô nhiễm có tốc độ sinh trưởng nhanh sẽ có khả năng phát triển vượt đối tượng nuôi (Cao Tuấn Kiệt, 2007; Trần Thị Mỹ Xuyên, 2008)

2.2.2 Nuôi liên tục

Phương pháp nuôi liên tục cho phép duy trì giống nuôi cấy có tốc độ rất gần tốc

độ sinh trưởng tối đa Người ta phân biệt một số dạng nuôi liên tục

Turbidostat (nuôi cho lên men liên tục): Trong đó mật độ tảo được duy trì ở mức độ xác định trước bằng cách pha loãng tảo nuôi với môi trường Có thể nói đây là

hệ thống tự động Trong trường hợp này, dinh dưỡng là không hạn chế nhưng ánh sáng

là yếu tố hạn chế trừ khi mật độ tảo quá thấp

Chemostat (nuôi ở trạng thái hóa tính): Ở đây môi trường nước được đưa vào

hệ thống nuôi với tốc độ chính xác Tuy nhiên một phần dịch mới liên tục được bổ sung để thay đổi dịch môi trường đã dùng Hệ thống này thường đơn giản và ít tốn kém so với turbidostat

Các nhược điểm của hệ thống nuôi liên tục là chi phí tương đối cao và phức tạp

Do yêu cầu phải chiếu sáng liên tục, duy trì nhiệt độ nên đòi hỏi phải bố trí trong nhà

và điều này chỉ có tính khả thi đối với các cơ sở có quy mô sản xuất tương đối nhỏ Tuy nhiên nuôi liên tục có ưu điểm là mật độ tảo thu được từ môi trường luôn ổn định Mặt khác, hệ thống này có thể kiểm soát và dễ dàng điều khiển về mặt công nghệ và

có thể tự động hóa, điều này làm tăng độ tin cậy của hệ thống với người sản xuất và giảm nhu cầu về lao động

2.2.3 Nuôi bán liên tục

Kỹ thuật nuôi bán liên tục kéo dài thời gian nuôi tảo, thực chất là một dạng nuôi theo mẻ nhưng sinh khối được kiểm tra định kỳ và giữ ổn định bằng phương pháp pha loãng môi trường Nuôi bán liên tục có thể thực hiện trong nhà hoặc ở ngoài trời, nhưng thời gian nuôi thường không đoán trước được Do tảo nuôi không được thu hoạch toàn bộ mà thu hoạch từng phần nên phương pháp nuôi bán liên tục cho khối

lượng tảo nhiều hơn so với nuôi từng mẻ với cùng một kích thước bể nuôi

2.3 Định lượng sinh khối tảo

Định lượng sinh khối tảo: Sinh khối tảo trong môi trường là tổng lượng tảo tươi hay khô có trong một đơn vị thể tích nước đó (Đặng Thị Sy, 2005)

Có một số phương pháp xác định khối lượng sinh khối tảo có trong môi trường nuôi hoặc bằng cách đếm số tế bào hoặc thông qua việc xác định dung tích, mật độ quang hoặc trọng lượng nhưng phổ biến nhất vẫn là 2 phương pháp

Phương pháp đếm tế bào: Có thể đếm các tế bào bằng máy đếm hạt điện tử hoặc dùng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp dưới kính hiển vi Khó khăn chủ yếu của việc đếm bằng kính hiển vi là sự tái sinh sản, mà hoạt động này lại biến đổi theo việc

lấy mẫu, sự pha loãng và sự chứa đầy của buồng đếm cũng như việc lựa chọn đúng kiểu buồng đếm và thang mật độ tế bào

Phương pháp cân trọng lượng khô của tảo nuôi là cách tốt nhất để đánh giá sinh khối tảo Phương pháp này gồm các bước : thu mẫu, tách tảo khỏi pha loãng bằng cách

ly tâm hoặc bằng các bộ lọc như lọc tiếp tuyến, sấy và cân trọng lượng khô

Ngoài ra còn có các phương pháp như: đo độ đục (OD), xác định hàm lượng chlorophyll, phương pháp đo thải O2 quang hợp, xác định huỳnh quang chlorophyll… Đây là những phương pháp tương đối mới với công nghệ vi tảo cần có nhiều kĩ thuật

và chuyên môn để hoàn chỉnh với các phương pháp trên và đây cũng là tiềm năng lớn của công nghệ vi tảo trong tương lai

2.4 Tách sinh khối tảo

Cho tới nay nhiều phương pháp thu sinh khối đã được ứng dụng như ly tâm, lắng lọc, kết lắng hóa học, kết lắng bằng điện trường, tự kết lắng, lọc trọng trường, lọc chân không… khâu thu hoạch tảo là khâu có ảnh hưởng lớn đến giá thành sản xuất

Phương pháp ly tâm

Phương pháp ly tâm có ưu điểm chính là đơn giản và không phải sử dụng hóa chất bổ sung Trong quá trình ly tâm thì các tế bào sẽ đọng lại ở thành của đầu máy ly tâm ở dạng bột nhão lắng Sau đó bột này được treo lơ lửng trở lại trong một dung dịch nước hạn chế Tuy vậy, chi phí năng lượng cho phương pháp này là khá lớn (khoảng 1 KWh/m3) khiến việc sử dụng nó chỉ khả thi trong những cơ sở sản xuất cho

ra các sản phẩm chất lượng cao

Phương pháp lọc

Đây là phương pháp khả thi cho thu hoạch nhiều loài tảo nói chung và Chlorella

nói riêng Vật liệu dùng cho lọc cơ học là cát mịn, sợi cellulose… Tốc độ lọc chậm và màng lọc hay bị bít tắc do chính sinh khối tảo và vi sinh vật khiến phương pháp này cần lượng nước khá lớn để rửa thường xuyên Trong các phương pháp lọc thì lọc nén

áp suất thấp có triển vọng hơn cả do tốc độ nhanh và khả thi cho sản xuất lớn vì giá

thành không cao Những tảo đơn bào (Dunaliella, Chlorella, Scenedesmus…) thường

đòi hỏi thu hoạch bằng ly tâm, lọc hoặc bằng phương pháp tạo bông (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

Phương pháp tạo bông