KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CỦA TẢO CHLORELLA VULGARIS.

GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CỦA TẢO CHLORELLA VULGARIS Họ tên sinh viên: TRẦN THỊ MAI THẢO TRẦN THỊ MỸ DUNG Ngành: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Niên khóa: 2008-2012 Tháng 08/2012 ii KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CỦA TẢO Chlorella Vulgaris Tác giả TRẦN THỊ MAI THẢO & TRẦN THỊ MỸ DUNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp kỹ sư ngành Cơng Nghệ Hóa Học Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS.TRƯƠNG VĨNH Tháng 08 năm 2012 i LỜI CẢM TẠ Lời xin gửi tới PGS - TS Trương Vĩnh lời biết ơn chân thành sâu sắc Thầy người trực tiếp giao đề tài tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ chúng tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Chúng tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Hóa học – Đại học Nơng Lâm Tp.HCM, anh chị bạn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi suốt q trình thực đề tài Và xin chân thành cảm ơn đơn vị Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM tạo điều kiện để học tập nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn Cuối xin cảm ơn người thân gia đình, ln động viên, cổ vũ để chúng tơi hồn thành tốt luận văn TP.HCM, tháng 08 năm 2012 Sinh viên Trần Thị Mai Thảo Trần Thị Mỹ Dung ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát khả làm thực phẩm chức tảo Chlorella vulgaris.” Đề tài thực tiến hành Phòng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Hóa Học, thời gian từ tháng 02/2012 đến tháng 08/2012 Mẫu nguyên lệu tảo Chlorella Vulgaris nuôi thiết bị ống 400 L 40 L môi trường Basal, sau đạt mật độ thích hợp thu hoạch bảo quản để tiến hành phân tích Mẫu tảo đem tiến hành phân tích số thành phần đạm Lipid, Carotenoids Chlorophyll, đường…để khảo sát hàm lượng số thành phần dinh dưỡng có tảo, hoạt tính chúng Khảo sát độc tính cấp phương pháp thử chuột bạch mua Viện Pasteur, cho chuột ăn với liều lượng tính theo thể trọng chuột so với thể trọng người Kết cho thấy, cho chuột ăn với liều lượng tăng dần lơ chuột khơng có biểu bất thường mà bên cạnh đó, trọng lượng chuột tăng lên, linh hoạt khỏe mạnh Với khảo sát trên, thấy tảo Chlorella Vulgaris sử dụng làm thực phẩm chức tốt để bổ sung dinh dưỡng đồng thời hỗ trợ điều trị số bệnh cho người iii ABSTRACT STUDY THE ABILITY OF CHLORELLA VULGARIS ALGAE AS A FUNCTION FOOD This study was conducted at the Laboratory of Chemical Engineering Deparment from 02/2012 to 08/2012 Chlorella Vulgaris algae was grown cultured in the 400L and 40L photobroreactor using basal environment An appropriate cell density algae was harvested and stored for analysis Algae samples were taken to conduct the analysis of some main components such as protein, lipids, Carotenoids and Chlorophyll, to examine the levels of some nutrients in the algae, and the activity of them Study the acute toxicity of algae by the method of trials on white mice which were purchased from Pasteur Institute, where were the mice fed doses per body weight in corresponding to the does applied to humam body The results show that, when the mice fed with increasing doses between batches, the mice had no expression of any irregularities Besides that, the weight of them was increasedand they were flexible and healthy With these study found, we saw that the algae Chlorella Vulgaris can be used as a function food for nutritional supplements and also it may aid in treating some human diseases iv MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Abstract iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách hình ix Danh sách bảng x Chương 1: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề [9] 1.2 Mục đích đề tài: 1.3 Nội dung đề tài: 1.4 Yêu cầu: .3 Chương 2: TỔNG QUAN .4 2.1 Tổng quan tài liệu [11] .4 2.2 Cấu trúc Chlorella .6 2.3 Chlorella sản xuất thương mại 2.4 Thành phần dinh dưỡng .8 2.5 Các chức sinh học tảo Chlorella .15 2.6 Tổng quan chức số hoạt chất quan trọng có tảo Chlorella 27 2.7 Tổng quan phương pháp nghiên cứu .33 v 2.7.1 Các phương pháp xác định đạm .33 2.7.2 Các phương pháp phân tích Chlorophyll, Carotenoids [8] 41 2.7.3 Xác định hàm lượng Lipid phương pháp Soxhlet [12] 45 2.7.4 Các phương pháp định lượng Carbohydrate [3,16] 45 2.7.5 Các phương pháp thử độc tính tảo Chlorella Vulgaris [1] 48 2.7.5.1 Phương pháp Miller Tainter 50 2.7.5.2 Phương pháp Karber Behrens (1935) 51 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .53 3.1 Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu .53 3.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 53 3.1.2 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 53 3.2 Phương pháp gây nuôi tảo 54 3.3 Nội dung nghiên cứu 54 3.3.1 Phương pháp xác định thành phần 54 3.3.1.1 Định lượng Nitơ tổng phương pháp Kjeldahl [8] 54 3.3.1.2 Phương pháp phân tích Chlorophyll Carotenoid [2,7] 58 3.3.1.3 Định lượng lipit tổng theo phương pháp Soxhlet [9] .59 3.3.1.4 Định lượng Carbohydrate theo phương pháp Robert Copper (AOAC) (1988).[10] .61 3.3.2 Phương pháp xác định độc tính cấp tảo ( Phương pháp Karber -Behrens ) [4] .66 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 4.1 Xác định thành phần chất có mẫu tảo 68 4.1.1 Xác định hàm lượng đạm tảo 68 4.1.2 Xác định hàm lượng lipid tảo 72 vi 4.1.3 Xác định hàm lượng Chlorophyll Carotenoid tảo .73 4.1.4 Xác định hàm lượng carbohydrate tảo 74 4.2 Kết khảo sát tính độc tảo Chlorella Vulgaris 77 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 5.1 Kết luận kiến nghị .83 5.1.1 Kết luận 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC .87 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chlo: Chlorophyll Chlo a: Chlorophyll a Chlo b: Chlorophyll b Pheo a: Pheophytin a Pheo b: Pheophytin b Pheos: Pheophytin Gfw: Gram fresh weight (gram tảo tươi) CGF: Chlorella Growth Facter (nhân tố tăng trưởng từ Chlorella) CFU: Colonies Formed Units (đơn vị tạo khuẩn lạc) TNF: Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoại tử khối u) IL: Interleukins (là loại protein tạo thể) PCB: Polychlorbiphenyl trtb/ml: Triệu tế bào/ ml dịch tảo viii độ tăng khối lượng tuần liên tiếp 3.5 2.5 Tuần Tuần 1.5 Tuần Tuần 0.5 Lô chứng Lô thử Lô thử Lơ thử Hình 4.6: Biểu đồ so sánh tăng trọng tuần lô Nhận xét: Lơ chứng: chuột khỏe mạnh, phát triển bình thường, tốc độ tăng trọng tương đối ổn định suốt thời gian theo dõi, khơng có chết Vì vậy, điều kiện mơi trường khơng ảnh hưởng đến thí nghiệm Các lô thử: chuột khỏe mạnh, lanh lợi, tốc độ phát triển nhanh so với lô chứng Ngày đầu cho tảo vào chưa quen với mùi vị tảo nên chuột ăn tương đối ít, khơng có biểu lạ Vài ngày sau, thích nghi với loại thức ăn này, ăn tảo với hàm lượng cao tốc độ phát triển nhanh so với ăn tảo với hàm lượng thấp lô chứng Tuy nhiên, tốc độ tăng trọng lơ khơng đồng có ăn nhiều có ăn hàm lượng tảo quy định Khơng có biểu bệnh tật Khơng chết Kết luận: • Điều kiện mơi trường khơng ảnh hưởng đến kết thí nghiệm • Tảo khơng có độc tố hàm lượng độc tố thấp khơng ảnh hưởng đến sức khỏe • Tảo có hàm lượng đạm cao có tác dụng tăng cường sức khỏe kích thích tăng trọng • Có thể dùng tảo làm thực phẩm bổ sung sức khỏe an toàn cho người 81 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Kết phân tích số thành phần độc tính cấp tảo Chlorella Vulgaris cho thấy tảo có chứa dưỡng chất từ thiên nhiên vượt trội so với số loại nguyên liệu thực phẩm khác đạm, béo, chlorophyll thành phần cần thiết cho thể người Với hàm lượng đạm chất béo cao nguồn cung cấp lượng dồi cho thể, làm thực phẩm bổ sung dinh dưỡng cho người ốm yếu, trẻ em suy dinh dưỡng hỗ trợ phục hồi sức khỏe cho bệnh nhân Đặc biệt hàm lượng Chlorophyll mà xác định cao hẳn nguyên liệu khác, hoạt chất có khả ngăn cản gốc tự do, làm giảm trình oxy hóa xảy thể người tham gia hỗ trợ phòng chống ung thư số bệnh khác Bên cạnh đó, độc tính cấp Chlorella Vulgaris khơng có nên an tồn cho người sử dụng Đây nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất loại thực phẩm chức bổ sung cho người kỷ 21 82 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận kiến nghị 5.1.1 Kết luận Qua thời gian nghiên cứu, luận văn đạt kết chính: Lựa chọn phương pháp phù hợp để xác định thành phần tảo Chlorella Vulgaris Xác định hàm lượng đạm tảo cất đạm Kjeldalh thủ công Mặc dù chưng cất đạm Kjeldalh lần tiến hành thử nghiệm phòng thí nghiệm Bộ mơn, nhiên sau q trình khảo sát thấy Bộ chưng cất đạm đáp ứng yêu cầu để xác định hàm lượng đạm phòng thí nghiệm phương pháp khơng mắc sai số hệ thống Cho nên kết cuối cho tương đối xác chấp nhận Xác định hàm lượng lipid tảo phương pháp chiết Soxhlet Xác định hàm lượng Chlorophyll a, Chlorophyll b carotenoids tảo tươi dung môi Methanol theo phương pháp Lichtentaler Wellburn Đây phương pháp có tính ưu việt so với phương pháp mà chúng tơi tìm hiểu xác định thành phần Chlorophyll a,b Carotenoids lúc Xác định hàm lượng carbohydrat tảo phương pháp đo quang Kết xác định thành phần chất có tảo Chlorella Vulgaris đạm, béo, chlorophyll… cao hẳn so với loại thực phẩm khác Đây lý chúng tơi cho tảo Chlorella Vulgaris có tiềm nguồn nguyên liệu để làm Thực phẩm chức Tảo Chlorella Vulgaris sau thử độc tính cấp chuột bạch cho thấy tảo khơng có tính độc hồn tồn nguồn ngun liệu tốt sử dụng để làm 83 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh thực phẩm chức cho người nhằm mục đích bổ sung dinh dưỡng, trì sức khỏe, hỗ trợ phòng điều trị số loại bệnh 5.1.2 Kiến nghị Vì thời gian làm đề tài có hạn, phương pháp điều kiện thiết bị phân tích thủ công nên kết mắc sai số hệ thống sai số người thực Để xác định xác hàm lượng đạm tảo cấn sử dụng phương pháp dụng cụ tân tiến sử dụng máy cất đạm tự động thay cho chưng cất đạm thủ công Xác định hàm lương Chlorophyll Carotenoid cần tiến hành thí nghiệm điều kiện lạnh tối hoàn toàn để giảm thiểu khả Chlorophyll bị oxy hóa tìm phương pháp đơn giản tối ưu Về thí nghiệm độc tính cấp tảo nên theo dõi tình trạng sức khỏe biểu lâm sàng chuột thời gian dài hơn, tìm cách đưa tảo vào thể chuột cho liều lượng lô Để làm thực phẩm chức cho người cần phải thể dạng cụ thể để người sử dụng thể có khả hấp thụ tối ưu chất dinh dưỡng tảo Sau thời gian nghiên cứu đề tài thấy rằng: tiềm để làm thực phẩm chức từ tảo Chlorella Vulgaris khả quan Trong tương lai, nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi tảo nguồn nguyên liệu giàu hàm lượng hoạt chất từ thực vật Chlorophyll, Carotenoids…thì điều hứa hẹn tương lai tuyệt vời cho sản phẩm từ tảo 84 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, NXB Y học Hà Nội, trang 50- 51 Phạm Thị Ánh Hồng, kỹ thuật sinh hóa, NXB.Đại Học Quốc Gia TP.HCM TS Phan Tại Hn, Phân tích Carbohydrate, Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm – ĐHNL TP.HCM T.S Nguyễn Hoài Hương & CN.Bùi Văn Thế Vinh, 2009 Bài giảng Thực hành hóa sinh, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Vaxcrixenxki.P Kỹ Thuật Phòng Thí Nghiệm – Phần 1, NXB Đại Học Trung Học Chuyên Nghiệp TS Lê Thị Thanh Mai, Giáo trình thực tập sinh hóa Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB KH&KT, Hà Nội, 2001 thuviensinhhoc.com/ /3005-sac-to-quang-hop http://www.thucphamchucnang.net/index.php?option=com_content&view=artic le&id=62&Itemid=61 10 www.ebook.edu.vn TIẾNG ANH 11 Abeille D’Or,1989 Chlorella – the most exciting nutritional discovery on planet earth, (S) PTE LTD 12 Ben Browne and ctv, 2009/2010 Oil Extraction from Microalgae Algae Oil Extraction Capstone 2009/2010 pp 11-12 13 Jordan Shaw, February 10, 2006 Kjeldahl Nitrogen Analysis FDST 4070 14 Lichtenthaler, H.K., Wellburn, A.R., Determination of Total Carotenoids and Chlorophylls A and B of Leaf in Different Solvents Biol Soc Trans 591-592 (1985) 15 Mario G Ferruzzia, Digestion, absorption, and cancer preventative activity of dietary Chlorophyll derivatives, 4, Joshua Blakesleeb Department of Food 85 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh science, Purdue University, 745 Agriculture Mall Dr, West Lafayette, IN 47907 16 Roberts Copper, 1988 Dextran in Raw Cane Sugar AOAC Official Method 988.12, AOAC Internationnal, 2006 86 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh PHỤ LỤC Phụ lục 4.1: Khảo sát tính phù hợp phương trình tuyến tính xác định hàm lượng đạm Regression Statistics Multiple R 0.993973 R Square 0.987981 Adjusted R Square 0.985978 Standard Error 0.011936 Observations ANOVA df Regression Residual Total SS MS F 0.070272961 0.070273 493.2274 0.000854855 0.000142 0.071127816 Significance F 5.45E-07 mgN/mL Residual Plot 0.025 0.02 0.015 Residuals 0.01 0.005 -0.005 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 -0.01 -0.015 -0.02 mgN/mL Đồ thị số dư 87 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.2: Bảng ANOVA khảo sát ảnh hưởng nguồn gốc nguyên liệu lên hàm lượng dầu tảo: Analysis of Variance for LIPID.solieu - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:LIPID.nguon 94.096022 47.048011 45.066 0018 B:LIPID.khoi 491622 245811 235 8004 RESIDUAL 4.1759111 1.0439778 TOTAL (CORRECTED) 98.763556 Multiple range analysis for LIPID.solieu by LIPID.nguon -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -2 10.926667 X 13.940000 X 3 18.776667 X -contrast difference limits - 3.01333 2.31709 * - -4.83667 2.31709 * - -7.85000 2.31709 * -* denotes a statistically significant difference Phụ lục 4.3: Bảng ANOVA khảo sát tính ảnh hưởng yếu tố đến kết xác định hàm lượng thành phần Chlorophyll Carotenoids: Analysis of Variance for CHL.solieu - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:CHL.tphan 2310.6435 1155.3217 135.810 0002 B:CHL.khoi 14.0451 7.0225 826 5010 RESIDUAL 34.027467 8.5068667 TOTAL (CORRECTED) 2358.7160 - 88 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.4: Khảo sát tính phù hợp phương trình hồi quy tuyến tính xác định Carbohydrate SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.994261868 R Square 0.988556661 Adjusted R Square 0.987126244 Standard Error 0.00343525 Observations 10 ANOVA df SS Regression Residual 0.008155592 9.44075E-05 Total 0.00825 F 0.008156 1.18E-05 691.0967 Significance F 4.7105E-09 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% -0.003955153 0.002491859 -1.58723 0.151122 -0.00970139 0.00179108 -0.00970139 0.001791084 0.129628744 0.004930965 26.28872 4.71E-09 0.118257919 0.14099957 0.118257919 0.14099957 X Variable Residual Plot 0.006 0.004 Residuals Intercept X Variable MS 0.002 -0.002 0.2 0.4 0.6 0.8 -0.004 -0.006 -0.008 X Variable Đồ thị số dư 89 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.5: Bảng ANOVA khảo sát ảnh hưởng nguồn gốc nguyên liệu tảo hàm lượng đường Analysis of Variance for DUONG.solieu - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:DUONG.khoi 0102675 0102675 5.676 0974 RESIDUAL 0054265 0018088 TOTAL (CORRECTED) 0156940 - Phụ lục 4.6: So sánh trọng lượng lô chuột thử nghiệm Multiple range analysis for CHUOT.solieu by CHUOT.lo Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups chung 20.740000 X thu1 22.540000 X thu2 23.420000 XX thu3 24.600000 X contrast difference limits chung - thu1 -1.80000 1.35472 * chung - thu2 -2.68000 1.35472 * chung - thu3 -3.86000 1.35472 * thu1 - thu2 -0.88000 1.35472 thu1 - thu3 -2.06000 1.35472 * thu2 - thu3 -1.18000 1.35472 * denotes a statistically significant difference 90 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.7: So sánh trọng lượng (g) lô chuột thời điểm khác Multiple range analysis for CHUOT.solieu by CHUOT.tuan Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups tuan0 19.000000 X tuan1 21.850000 X tuan2 23.075000 XX tuan3 24.450000 XX tuan4 25.750000 X contrast difference limits tuan0 - tuan1 -2.85000 1.51463 * tuan0 - tuan2 -4.07500 1.51463 * tuan0 - tuan3 -5.45000 1.51463 * tuan0 - tuan4 -6.75000 1.51463 * tuan1 - tuan2 -1.22500 1.51463 tuan1 - tuan3 -2.60000 1.51463 * tuan1 - tuan4 -3.90000 1.51463 * tuan2 - tuan3 -1.37500 1.51463 tuan2 - tuan4 -2.67500 1.51463 * tuan3 - tuan4 -1.30000 1.51463 * denotes a statistically significant difference 91 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM ĐỀ TÀI Phụ lục 4.8: Cất đạm Kjeldahl Phụ lục 4.9: Chiết Lipid Soxhlet 92 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.10: Máy đo quang Phụ lục 4.11: Máy sấy chân không 93 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.12: Bình hút ẩm Phụ lục 4.13: Máy ly tâm 94 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh Phụ lục 4.14: Máy đồng hóa Phụ lục 4.14: Máy Vortex 95 GVHD: PGS.TS.Trương Vĩnh ... food for nutritional supplements and also it may aid in treating some human diseases iv MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Abstract ... Các thành phần khống có Chlorella Bảng 2.5: Các amino acid thi t yếu có Chlorella 10 Bảng 2.6: Các amino acid khơng thi t yếu có Chlorella 11 Bảng 2.7: So sánh hàm lượng Protein... dưỡng ngày? Theo kết khảo cứu, hầu hết người thi u vi chất dinh dưỡng trầm trọng, người trẻ, dù có ăn đầy đủ, ta khơng có đủ Vitamin khoáng chất cần thi t cho thể Hiện nay, có nhiều nguyên nhân