CHẨN ĐOÁN, NGHIÊN CỨU CMV (Cucumber mosaic virus) GÂY BỆNH KHẢM TRÊN CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.) BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

Một trong những loại virus gây thiệt hại nặng nề là CMV Cucumber mosaic virus gây bệnh khảm trên cây dưa leo.. Hiện nay tại các vườn trồng dưa leo tại các tỉnh miền Nam đã xuất hiện một

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN, NGHIÊN CỨU CMV (Cucumber mosaic virus) GÂY BỆNH KHẢM TRÊN CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN, NGHIÊN CỨU CMV (Cucumber mosaic virus) GÂY BỆNH KHẢM TRÊN CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT CHẾ NGUYÊN KHA

Tháng 6/2013

 

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong bốn năm đại học

Em cảm ơn quý Thầy/Cô trong và ngoài trường đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập

Em vô cùng biết ơn Thầy Huỳnh Văn Biết đã luôn tận tâm hướng dẫn, hỗ trợ và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu để có thể hoàn thành đề tài này

Em xin cảm ơn Viện cây ăn quả miền Nam đã tận lực hỗ trợ để việc lấy mẫu thí nghiệm của em trở nên thuận lợi

Em xin cảm ơn Anh Võ Khánh Hưng và Anh Huỳnh Đặng Sang đã luôn giúp đỡ

em mỗi khi gặp khó khăn

Em xin cảm ơn Chị Nguyễn Thị Xuân Ngọc đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn các bạn lớp DH09SH đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ mình suốt bốn năm qua

Cuối cùng, con cảm ơn ba mẹ đã luôn dõi theo và ủng hộ con suốt bao năm qua

Ba mẹ là động lực rất lớn để con có thể có được ngày hôm nay

TP HCM, Tháng 6 năm 2013

Chế Nguyên Kha

TÓM TẮT

Dưa leo (Cucumis sativus L.) là một trong những loại cây trồng phổ biến nhất ở

Việt Nam Dưa leo có thời gian sinh trưởng ngắn, có thể trồng đến 4 vụ một năm, cho năng suất và giá trị dinh dưỡng cao, đáp ứng được nhu cầu rau xanh của người tiêu dùng Tuy nhiên, tình trạng xuất hiện nhiều loại virus gây bệnh đã làm giảm đáng kể năng suất của cây dưa leo Một trong những loại virus gây thiệt hại nặng nề là CMV

(Cucumber mosaic virus) gây bệnh khảm trên cây dưa leo

Hiện nay tại các vườn trồng dưa leo tại các tỉnh miền Nam đã xuất hiện một số triệu chứng lâm sàng về bệnh khảm trên cây dưa leo làm người nông dân bị mất mùa Việc ứng dụng kỹ thuật ELISA và RT – PCR nhằm chẩn đoán và nghiên cứu CMV để xác định nguyên nhân gây bệnh một cách chính xác là cần thiết nhằm hạn chế thiệt hại cho người nông dân

Trong nghiên cứu này, 90 mẫu lá dưa leo được thu thập trên địa bàn huyện Củ Chi thành phố Hồ Chí Minh và các huyện Chợ Gạo, Cái Bè tỉnh Tiền Giang Mẫu sau khi thu thập được chẩn đoán CMV bằng kỹ thuật DAS – ELISA và RT - PCR để xác định mẫu dương tính Các mẫu PCR dương tính được giải trình tự

Sau quá trình thực hiện nghiên cứu, chúng tối đạt được một số kết quả:

Sự chênh lệch về tỷ lệ mẫu dương tính ở huyện Củ Chi – TP Hồ Chí Minh và tỉnh Tiền Giang là không lớn

Tỷ lệ dương tính với CMV trên cây dưa leo ở xã An Nhơn Tây là cao nhất, đạt 40% Tỷ lệ dương tính với CMV trên cây dưa leo ở xã Hòa Khánh là thấp nhất, đạt 13,33%

Độ nhạy của kỹ thuật ELISA và RT – PCR là không quá khác biệt

Primer 2 là primer đặc hiệu trong chẩn đoán CMV ở địa bàn huyện Củ Chi –

Tp HCM và tỉnh Tiền Giang

Độ tương đồng giữa các chủng CMV ở một số nước thuộc khu vực Châu Á và chủng CMV được ly trích từ mẫu TLT – 4D trong nghiên cứu này khá cao

SUMMARY

Using DAS – ELISA and RT – PCR techniques for studying and detecting

CMV (Cucumber mosaic virus) in cucumber (Cucumis sativus L.)

Cucumber (Cucumis sativus L.) is one of the most popular vegetables in

Vietnam It has such a short growing perious that can be cultivated to four crops per year Cucumber has quite high nutrius value It has enough amount to support human demand However, the appearance of some viruses has reduced yield of cucumber

significantly One of these viruses that has dealed heavy damage is Cucumber mosaic

virus (CMV)

Nowadays, on some cucumber fields in Southern Vietnam, the appearance of some symptoms of mosaic on cucumber causes damage to crops It is necessary to study the pathway of pathogens correctly caused by CMV by using ELISA and RT – PCR

In this research, 90 cucumber leaf samples were collected in Cu Chi District – HCM City, Cho Gao and Cai Be Districts – Tien Giang Province The leaf collected samples collected were examined to find the positive samples with CMV infection by using ELISA and RT – PCR Then, positive results were sequenced

After study processes, there were some results such as:

The ratio of positive samples with CMV infection in Cu Chi District – HCM City and Tien Giang province is not too different

 An Nhon Tay Ward of Cu Chi Province has the highest ratio of positive samples (40%); Hoa Khanh Ward of Cai Be Province has the lowest ratio of positive samples

 Primer 2 is specific for detecting CMV

 The sensitivity of ELISA and RT – PCR techniques is not different

 The CMV strain of TLT – 4D sample is similar to the CMV strains in some countries of Asia

Keywords: CMV; Cucumber; ELISA; RT – PCR

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Sumary iii

Mục lục iv

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục các hình vii

Danh mục các bảng viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây dưa leo 3

2.1.1 Phân loại khoa học 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 3

2.1.4 Điều kiện ngoại cảnh 4

2.1.5 Một số điều kiện phát sinh bệnh thực vật 5

2.1.6 Các biện pháp phòng chống bệnh thực vật 5

2.1.7 Một số bệnh trên cây dưa leo 6

2.2 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật 8

2.3 Giới thiệu về cucumber mosaic virus (CMV) 8

2.3.1 Sơ lược về CMV 8

2.3.2 Nguyên nhân gây bệnh và cách phòng ngừa 9

2.4 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật 10

2.4.1 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 10

2.4.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 12

2.4.3 Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – PCR) 14

2.4.4 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh virus khác 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu 16

3.3 Dụng cụ và hóa chất 16

3.4 Quy trình thực hiện 17

3.4.1 Thí nghiệm DAS – ELISA 17

3.4.2 Thí nghiệm RT – PCR 19

3.4.3 Giải trình tự 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Hiện trạng canh tác cây dưa leo ở nơi lấy mẫu 22

4.1.1 Hiện trạng canh tác cây dưa leo ở huyện Củ Chi 22

4.1.2 Hiện trạng canh tác cây dưa leo ở tỉnh Tiền Giang 22

4.2 Kết quả thí nghiệm ELISA 22

4.3 Kết quả thí nghiệm RT – PCR 26

4.4 Kết quả so sánh độ tương đồng giữa chủng CMV Việt Nam và Châu Á 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

Tài liệu tham khảo 36

Phụ lục

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST : The Basic Local Alignment Search Tool

Bp : Base pair

cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid

CMV : Cucumber Mosaic Virus

Da : Dalton

DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – ELISA

dATP : Deoxyadenosine triphosphate

EDTA : Ethylenediamine Tetraacetic Acid

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IgG : Immunoglobulin G

mRNA : Messenger RNA

OD : Optical Density

PBST : Phosphate Buffered Saline with Tween

PCR : Polymerase Chain Reaction

pH : Power of Hydrogen

RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA

RNA : Ribonucleic Acid

Rnase : Ribonuclease

RT – PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SSR : Simple Sequence Repeat

TAS – ELISA : Triple Antibody Sandwich – ELISA

TBE : Tris – Borate – EDTA

Tm : Melting Temprature

ToLCNDV : Tomato Leaf Curf New Delhi Virus

UV : Ultra Violet

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Quả dưa leo giai đoạn 30 – 45 ngày 3

Hình 2.2 Vườn dưa leo bị bệnh hại nghiêm trọng tại huyên Củ Chi 7

Hình 2.3 Cấu trúc Cucumber mosaic virus 8

Hình 2.4 Bọ trĩ cư trú ở mặt sau lá dưa leo 9

Hình 2.5 Lá cây dưa leo bị nhiễm bệnh khảm do CMV gây nên 10

Hình 2.6 Các phương pháp ELISA 11

Hình 2.7 Sơ đồ phản ứng PCR nhiều chu kỳ 12

Hình 2.8 Quy trình RT – PCR 14

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí mẫu 18

Hình 4.1 Đĩa ELISA sau 120 phút ủ bởi substrate bufer và sơ đồ bố trí mẫu 23

Hình 4.2 Một số mẫu lá cho kết quả dương tính mạnh 26

Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với cặp primer 1 27

Hình 4.4 Độ tương đồng giữa trình tự mẫu AC – 13E với ToLCNDV 28

Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp primer 2 29

Hình 4.6 Biểu đồ bitmap đoạn gene giải trình tự theo primer forward 29

Hình 4.7 Biểu đồ bitmap đoạn gene giải trình tự theo primer reverse 30

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn độ tương đồng của trình tự mẫu và mRNA CMV 31

Hình 4.9 Độ tương đồng của trình tự mẫu TLT – 4D và mRNA CMV 32

Hình 4.10 Độ tương đồng giữa trình tự CMV mẫu và các chủng CMV Châu Á 33

Hình 4.11 Sơ đồ cây di truyền giữ các chủng CMV khu vực Châu Á 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết cho việc nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Một số hóa chất và kit cần thiết cho việc nghiên cứu 17

Bảng 3.3 Phản ứng PCR thực hiện trong 25 µl 20

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt 20

Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu cho kết quả dương tính theo địa bàn điều tra 23

Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu cho kết quả dương tính theo tuổi cây 25

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dưa leo (cucumis sativus L.) là một trong số những loại cây trồng nông nghiệp

rất phổ biến tại Việt Nam và một số nước trên thế giới Với thời gian sinh trưởng ngắn, cho năng suất cao và giàu dinh dưỡng Trong 100g dưa leo có 95g nước, 0,8g protein, 3g glucid, 0,7g cellulose, tương đương với nhiều loại rau tươi khác như cải sen, cải cúc, cải xoong, cải thìa Ngoài ra trong dưa leo còn có nhiều loại vitamin và muối khoáng cần thiết cho cơ thể như caroten, vitamin B1, vitamin B2, vitamin PP, vitamin

C, canxi, phospho và sắt (Khoa học & đời sống, 2009) Chính vì vậy, dưa leo góp phần không nhỏ trong việc đáp ứng nhu cầu thực phẩm của người tiêu dùng trên thế giới

Tại Việt Nam, dưa leo đã được trồng từ rất lâu, không chỉ để giải quyết vấn đề thực phẩm trong bữa ăn hằng ngày mà còn mang tính thương mại quan trọng Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của cây trồng, các loại bệnh hại cũng không ngừng tăng theo, gây thiệt hại hết sức nặng nề, đặc biệt là bệnh do virus gây nên Hiện nay, người

ta đã biết khoảng 2000 loài virus gây bệnh cho các sinh vật, trong đó có ½ (hơn 1000 loài) là các virus hại thực vật, chưa kể đến các chủng loại của chúng (Vũ Triệu Mân, 2007) Tuy ở Việt Nam, diện tích trồng dưa leo là khá lớn, cho sản lượng thu hoạch hằng năm cao, mang lại nhiều lợi nhuận nhưng rủi ro cũng không ít Việc trồng trọt gặp nhiều khó khăn do bệnh virus gây ra làm tổn thất nặng nề cho người nông dân

Trong đó, Cucumber mosaic virus (CMV) là một trong những nguyên nhân gây thiệt

hại to lớn nhất, gây giảm năng suất cũng như chất lượng của dưa leo CMV có thể gây bệnh từ giai đoạn cây con cho đến khi cây ra hoa và hình thành quả và thường lây lan mạnh trong vụ Đông Xuân (Vũ Triệu Mân, 2007) Một khi bệnh đã phát triển thành dịch sẽ rất khó khống chế và có thể phải tiêu hủy toàn bộ diện tích đất đã trồng

Chính vì lý do đã nêu trên, khóa luận “Chẩn đoán, nghiên cứu CMV (cucumber

mosaic virus) gây bệnh khảm trên cây dưa leo (Cucumis sativus L.) bằng kỹ thuật

DAS – ELISA và RT - PCR” được thực hiện nhằm đưa ra phương pháp giúp phát hiện

bệnh một cách sớm nhất, làm giảm thiệt hại do virus gây ra và góp phần làm ổn định nguồn thu nhập từ dưa leo của người nông dân

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung nghiên cứu gồm ba giai đoạn chính Ở giai đoạn đầu, các mẫu đã thu thập được chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay) nhằm khảo sát tỷ lệ nhiễm CMV Những mẫu dương tính và âm tính có giá trị OD sát với ngưỡng phát hiện dương tính của kỹ thuật ELISA được kiểm tra lại bằng kỹ thuật RT – PCR để so sánh độ nhạy giữa hai kỹ thuật này Sau đó, sản phẩm PCR dương tính sẽ được giải trình tự để định danh và so sánh mối quan hệ di truyền với một số chủng CMV trong khu vực Châu Á

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây dưa leo

2.1.1 Phân loại khoa học

Bộ : Cucurbitales

Họ : Cucurbitaceae

Chi : Cucumis

Loài : Cucumis sativus

Tên tiếng Anh : Cucumber

Tên tiếng Việt : Dưa leo, dưa chuột

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Dưa leo có nguồn gốc ở miền Tây Ấn Độ, được trồng trọt vào khoảng 3000 năm trước, sau đó được đưa đến một số vùng phía tây Châu Á, Bắc Phi và Nam Âu Dưa leo đã có mặt ở Trung Quốc từ rất sớm, có thể 100 năm trước công nguyên hoặc sớm hơn (Tạ Thu Cúc, 2005)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Hệ rễ của dưa leo gồm rễ cái, rễ nhánh và rễ phụ có đặc điểm ưa ẩm ướt và không chịu được môi trường khô hạn lẫn ngập úng Rễ cái có thể ăn sâu xống mặt đất được 1 m trong khi rễ nhánh và rễ phụ phát triển theo điều kiện đất đai, thường tập trung ở tầng đất 15 – 20 cm Ở thời kỳ cây con, hệ rễ rất yếu và dễ bị tổn thương, nếu trong trường hợp rễ bị ngập úng hoặc khô hạn, nồng độ dinh dưỡng cao, rễ cây sẽ bị khô đen, thối, ảnh hưởng đến các bộ phận khác của cây, làm cây sinh trưởng kém

Thân cây dưa leo mảnh và nhỏ, thuộc dạng leo bò, chiều cao cây trưởng thành tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và điều kiện nuôi trồng mà phân làm các loại lùn (< 1 m), trung bình (1 – 1,5 m) hay cao (> 1 m) Người ta dựa vào đường kính thân để biết tình hình sinh trưởng của cây, đường kính thân chính khi trưởng thành vào khoảng

1 cm, đường kính thân quá lớn hoặc quá nhỏ đều có ảnh hưởng không tốt đối với dưa leo Cây dưa leo có các nếp gấp dọc theo thân cây, trên thân có lông cứng và ngắn, thân chính có thể phân thành cành cấp 1, cành cấp 2 và tạo quả

Hình 2.1 Quả dưa leo

(Phan Nga, 2007)

Lá dưa leo gồm 2 loại chính là lá mầm và lá thật, 2 lá mầm hình trứng, mọc đối xứng qua trục thân, là chỉ tiêu quan trọng để dự đoán tình trạng và khả năng sinh trưởng của cây Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của lá mầm như chủng loại

và chất lượng của hạt giống dưa leo và một số điều kiện ngoại cảnh như chất dinh dưỡng, độ ẩm, nhiệt độ Lá thật có 5 cánh, dạng chân vịt, trên lá có lông cứng và ngắn

Dưa leo có hoa màu vàng, đường kính từ 2 – 3 cm, thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Tính đực cái của hoa rất đa dạng: Có thể là đơn tính cùng gốc (monecious), đơn tính khác gốc (dioecious) hoặc lưỡng tính cùng gốc (gynomonoecious) Tuy nhiên, hoa của dưa leo chủ yếu vẫn là đơn tính cùng gốc, hoa cái nhiều hơn hoa đực Hoa cái mọc đơn, có cuống ngắn và mập hơn hoa đực, còn hoa đực mọc thành chùm ở nách lá, có vị trí thấp hơn hoa cái

Quả dưa leo thường có hình dáng thon, dài, màu xanh, có 3 múi và hạt dính vào giá noãn Độ lớn và chiều dài của quả chủ yếu phụ thuộc vào giống Khi chín, quả có

da nhẵn hoặc có gai, màu xanh, sau khi thu hoạch, quả sẽ dần chuyển sang màu vàng

và bị hư Ngoài hình dạng thường thấy, quả dưa leo cũng xuất hiện các trường hợp dị dạng, quả phát triển không cân đối do sự thay đổi bất thường trong thời kỳ hình thành hạt (Tạ Thu Cúc, 2005)

2.1.4 Điều kiện ngoại cảnh

Nhiệt độ: dưa leo thích hợp trồng ở những nơi ấm áp, nhiệt độ thích hợp để hạt nảy mầm là 15,5 – 350C, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng là 20 – 22 0C Nếu nhiệt độ vào khoảng 120C, cây sinh trưởng rất chậm, đốt ngắn, lá nhỏ, hoa đực vàng

úa Khi nhiệt độ giảm xuống còn 50C, hầu hết dưa leo sẽ bị chết rét, khi nhiệt độ tăng lên 40 0C, dưa leo sẽ ngừng sinh trưởng, hoa cái không xuất hiện, lá héo

Ánh sáng: dưa leo ưa ánh sáng ngày ngắn (10 – 12 giờ/ngày), hoa cái ra sớm, ở

vị trí thấp Nếu thời gian chiếu sáng dài hơn, thân lá phát triển mạnh, hoa cái nở muộn,

dễ bị rụng, không chỉ làm giảm năng suất, hương vị cùng chất lượng của quả cũng giảm

Nước: vì hàm lượng nước trong thân và lá rất cao (> 93%) nên nước là yếu tố hết sức quan trong đối với dưa leo Trong thời kỳ nảy mầm, dưa leo cần bổ sung lượng nước bằng 50% trọng lượng hạt Từ thời kỳ thân lá sinh trưởng mạnh cho đến khi ra hoa, độ

ẩm trong đất cần đạt 70 – 80% Thời kỳ ra quả, cây dưa leo cần độ ẩm từ 80 – 90%

Đất và dinh dưỡng: dưa leo thích hợp trồng ở nơi đất phì nhiêu, tơi xốp, có độ

pH từ 5,5 – 6,8, tốt nhất là 6 – 6,5 Khoáng chất cũng hết sức cần thiết đối với cây, nếu

thiếu khoáng, dưa leo sẽ phát triển không tốt, lượng đường trong quả cũng không cao Giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng, cây cần nhiều đạm và lân Còn giai đoạn sau nên giảm bớt đạm thì năng suất sẽ cao hơn (Tạ Thu Cúc, 2005)

2.1.5 Một số điều kiện phát sinh bệnh thực vật

Có 3 điều kiện cơ bản để phát sinh bệnh cây, các điều kiện này bao gồm sự có mặt của cây ký chủ ở giai đoạn cảm nhiễm trùng hợp với thời gian lây lan bệnh, sự hiện diện của nguồn bệnh và số lượng vi sinh vật cần đạt được tới mức tối thiểu để xâm nhiễm, các vi sinh vật này có khả năng sinh sản lớn, khỏe mạnh, khả năng lây lan nhanh và độc tính mạnh Ngoài ra, để bệnh phát sinh, các yếu tố môi trường như độ

ẩm, nhiệt độ, ánh sáng, độ pH thích hợp là những điều kiện tất yếu giúp bệnh bùng nổ

và lây lan nhanh

2.1.6 Các biện pháp phòng chống bệnh thực vật

Sử dụng giống kháng bệnh: sử dụng công nghệ tái tổ hợp để đưa những gene kháng bệnh từ các loại cây dại trong tự nhiên vào hệ thống gene của các cây trồng đạt năng suất cao Biện pháp này giúp tạo ra những giống cây vừa cho năng suất cao, vừa

có hiệu quả kháng lại một số bệnh hại cụ thể

Sử dụng giống sạch bệnh: nguồn dùng để tạo giống sạch bệnh cần được kiểm tra bằng các kỹ thuật có độ nhạy cao như ELISA hay PCR Sau khi đã xác định là nguồn sạch bệnh, những cây này được nuôi cấy mô để nhân nhanh số lượng Quá trình sản xuất giống sạch bệnh đều phải thực hiện trong điều kện nhà lưới, cách ly với nguồn bệnh

Biện pháp canh tác: thông qua những biện pháp canh tác như thời vụ, làm đất, luân canh, xen canh có thể thay đổi điều kiện sinh thái, thay đổi ký chủ và nguồn dinh dưỡng của ký sinh vật, làm hạn chế hay tiêu diệt các sinh vật gây bệnh Biện pháp này không gây ô nhiêm môi trường và có giá trị phòng bệnh cao

Biện pháp vật lý: các biện pháp như ngâm hạt giống vào nước muối tỷ trọng cao để loại bỏ các hạt lép và tạp chất, phơi nắng hạt giống để diệt trừ mầm bệnh, nhổ

cỏ, loại bỏ cây bệnh, đốt tàn dư đều là những biện pháp đơn giản, ít tốn kém nhưng trong nhiều trường hợp lại có hiệu quả kinh tế cao

Biện pháp sinh học: biện pháp sinh học là biện pháp sử dụng những sinh vật đối kháng hay những chất kháng sinh để chống lại mầm bệnh Các biện pháp này không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại cây trồng và sức khỏe của con người Thuốc

sinh học chứa siêu ký sinh là một trong những biện pháp hữu hiệu ngăn ngừa bệnh, đây là các sinh vật ký sinh trên cơ thể sinh vật gây bệnh, tiêu diệt mầm bệnh Một biện pháp khác là sử dụng nhóm chất phytonxit do thực vật sản xuất có tác dụng ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh

Biện pháp hóa học: đây là biện pháp hữu hiệu nhất, cho kết quả nhanh chóng nhất, có lợi ích kinh tế nhất Tuy nhiên, nếu không sử dụng hợp lý sẽ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe, gây ngộ độc thực phẩm cho người và gia súc, nếu sử dụng liên tục ở cùng một địa điểm sẽ làm vi sinh vật lờn thuốc Vì vậy, cần sử dụng đúng thuốc, đúng liều và đúng thời điểm để cho hiệu quả cao nhất và đảm bảo an toàn cho con người và môi trường Các loại thuốc này rất độc hại nên cần giữ cần thận ở những nơi riêng biệt, cách xa khu dân cư và nguồn nước Phụ nữ có thai, người già yếu

và trẻ em không được tiếp xúc với thuốc Không ăn uống trong quá trình sử dụng thuốc và vệ sinh sạch sẽ sau khi dùng Dựa vào tác dụng, thuốc được chia làm hai nhóm chính là thuốc bảo vệ cây và thuốc tiêu diệt bệnh

Khi thực hiện các biện pháp phòng trừ bệnh, cần chọn ra các biện pháp thích hợp, trong thời gian thích hợp để đạt hiệu quả cao nhất (Vũ Triệu Mân, 2007)

2.1.7 Một số bệnh phổ biến trên cây dưa leo

Bệnh héo rũ, chạy dây: bệnh do nấm Fusarium sp gây ra, khi mắc bệnh, cây có

triệu chứng mất nước, chết khô từ đọt, thân đôi khi bị nứt, trên cây con bệnh làm chết rạp từng đám Trên cây trưởng thành, cây bị héo từng nhánh, sau đó héo đột ngột như

bị thiếu nước rồi chết cả cây

Bệnh chết héo cây non, héo tóp thân: bệnh chỉ xuất hiện ở giai đoạn cây non, cổ

rễ thường bị thối nhũng, cây dễ ngã Tác nhân gây bệnh là nấm Rhizoctonia solani

thường lưu tồn lại trên thân lúa, rơm rạ, cỏ dại xung quanh và phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm không khí cao

Bệnh thán thư: bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium gây nên, cây

nhiễm bệnh thường xuất hiện những vết trên lá có màu nâu tạo thành những vòng tròn đồng tâm Vết bệnh trên thân có dạng dài, vết bệnh trên quả có màu nâu, tròn lõm vào

da, còn gọi là ghẻ dưa Khi bệnh năng, các mảng này lên kết lại thành mảng to, gây thối trái, ủng nước

Bệnh đốm phấn sương mai: ở những ngày mưa nhiều, độ ẩm cao, nấm

Pseudoperonospora cubensis phát triển mạnh là tác nhân gây bệnh chính Bệnh đầu

tiên xuất hiện ở các lá già gần gốc, sau đó lan dần lên ngọn, vết bệnh hình đa giác, có góc cạnh rất rõ, lúc đầu màu vàng nhạt, sau chuyển thành nâu, khi vết bệnh già thì rất giòn và dễ vỡ

Bệnh khảm: bệnh do Cucumber mosaic virus gây nên, cây bệnh có triệu chứng

đọt non bị xoăn lại, lá mất màu, cây bị chùn, phát triển rất chậm, cho trái rất ít và dị dạng Vector truyền bệnh là nhóm côn trùng chích hút như bồ lệch và rệp dưa

Sâu bệnh: ngoài các tác nhân nêu trên còn có một số lượng lớn các loại sâu hại như sâu đục quả, sâu xám, nhện đỏ, ruồi đục quả cũng có sức phá hoại nghiêm trọng,

là nguồn lây lan bệnh hại lớn cho dưa leo nói riêng và các loại rau màu khác nói chung Các loại sâu bệnh này gây thiệt hại hết sức nặng nề cho nền nông nghiệp Việt Nam (Trần Thị Ba, 2006)

2.2 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật

Virus gây hại thực vật là những nucleprotein rất nhỏ bé, kích thước dao động trong khoảng 23 – 95 nm, có khả năng ký sinh và nhân lên trong tế bào thực vật Virus

có cấu tạo hết sức đơn giản bao gồm 2 bộ phận là chuỗi acid nucleic bên trong và lớp

vỏ protein bao bọc bên ngoài có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh Ngoài ra, khi điều kiện môi trường sống của ký chủ thay đổi, virus cũng có khả năng biến dị để thích ứng

Virus xâm nhập vào tế bào thực vật qua các vết thương có tiếp xúc với virus hoặc chỉ là sự cọ sát tiếp xúc giữa lá cây bệnh và cây khỏe Virus sau khi xâm nhiễm

Hình 2.2 Vườn dưa leo bị bệnh hại nghiêm trọng

ở giai đoạn 30 – 45 ngày tại xã Trung Lập Thượng huyên Củ Chi

vào tế bào thực vật sẽ dựa vào vật liệu và năng lượng của vật chủ để tái sinh và nhân bản (Vũ Triệu Mân, 2007)

2.3 Giới thiệu về Cucumber mosaic virus (CMV)

2.3.1 Sơ lược về CMV

CMV thuộc họ Bromoviridae, Cucumovirus, có tên khoa học là Cucumber

mosaic virus Bệnh do CMV gây ra được báo cáo chi tiết lần đầu tiên vào năm 1916

(Doolittle, 1920), là một trong những bệnh cây sớm nhất được biết là do virus gây ra Sau đó, bệnh xuất hiện ở nhiều nơi khác tại Mỹ, cuối cùng lan tới Châu Âu, Châu Phi

và những nơi khác trên thế giới

CMV có cấu trúc phân tử RNA, hình cầu, đường kính 28 nm, trọng lượng phân

tử vào khoảng 5 – 6,7 triệu Da Bộ gene của CMV bao gồm 3 phân tử RNA sợi đơn, lần lượt là RNA 1 (3.350 nucleotide) , RNA 2 (3.050 nucleotide) và RNA 3 (2.200 nucleotide) Các phân tử này được bao bọc bởi lớp vỏ bọc protein riêng biệt Vì vậy, một CMV trưởng thành bao gồm 3 hạt hình cầu, một hạt chứa RNA 1, một hạt chứa RNA 2 và hạt còn lại chứa RNA 3 Những cấu trúc đặc biệt này giúp cho virus xâm nhiễm và nhân bản trong vật chủ Trong hạt RNA 3 có thể chứa RNA thứ 4 hay còn gọi là RNA 4 (1.030 nucleotide) RNA này có nhiệm vụ tạo ra lớp vỏ bọc protein giúp bảo vệ CMV (Zitter và ctv, 2009)

Hình 2.3 Cấu trúc Cucumber mosaic virus

(Jean - Yves Sgro, 2004)

 

2.3.2 Nguyên nhân gây bệnh và cách phòng ngừa

CMV có phạm vi ký chủ rộng, gây hại trên 800 loài thuộc 85 họ thực vật, có khoảng 60 loài rệp có khả năng lây lan CMV cho cây qua tiếp xúc cơ học Vào mùa đông, khi nhiệt độ thấp (20 – 220C), điều kiện ánh sáng yếu, rệp sẽ xuất hiện nhiều, làm bệnh phát triển mạnh, kéo dài sang mùa xuân Ở những mùa vụ tiếp theo trong năm, bệnh vẫn có xuất hiện nhưng ít hơn Do cây con có sức đề kháng yếu nên rất dễ mắc bệnh

Những triệu chứng đầu tiên thường xuất hiện trên những lá non, trên mặt lá thường có những đốm nhỏ màu váng đến xanh sẫm Sau đó, lá bị méo mó, nhăn nheo

và cong lại, cây bị còi cọc, rút ngắn lóng Cây bị nhiễm bệnh cho năng suất thấp, quả

bị nhiễm CMV có màu lốm đốm vàng đến xanh sẫm hoặc xuất hiện những mụt nhỏ màu xanh đậm trên bề mặt

Để ngăn ngừa sự lây lan của CMV, cần chọn những giống có khả năng kháng bệnh tốt Ngoài ra, việc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ những cây cỏ hoang sống ở khu vực đồng ruộng là cần thiết, tránh tình trạng mầm mống bệnh còn lưu lại trên cây cỏ ở khu vực xung quanh hoặc trong đất Khi canh tác, tránh làm tổn thương cây, những vết

Bọ trĩ

Hình 2.4 Bọ trĩ cư trú ở mặt sau lá dưa leo

thương trên cây là nơi rất dễ bị nhiễm bệnh Ở giai đoạn đầu, cây còn nhỏ, có sức đề kháng bệnh yếu, rất mẫn cảm với bệnh, vì vậy, cần thường xuyên chăm sóc để cây phát triển tốt, khỏe mạnh Khi có triệu chứng, trước tiên cần nhổ bỏ, tiêu hủy cây bệnh, sau đó phun thuốc trừ rệp để hạn chế bệnh lây lan

Hình 2.5 Lá cây dưa leo nhiễm bệnh khảm do CMV gây nên

2.4 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật

2.4.1 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

ELISA là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Một khi thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất tạo thành màu Sự xuất hiện của màu cho biết có sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Cũng thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Dựa vào nguyên lý trên, kháng nguyên được cố định trên giá thể, sau đó kháng thể có đính kèm enzyme nếu gắn kết được với kháng nguyên sẽ kích hoạt enzyme làm phân hủy chất tạo màu, làm thay đổi màu của cơ chất Đây là phương pháp đơn giản nhất, được gọi là direct ELISA (ELISA trực tiếp) Tuy nhiên, do thông thường kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope, mà 1 kháng thể chỉ gắn được lên 1 epitope nên độ đặc hiệu là không cao Ngoài ra, khi sử dụng phương pháp này, từng đối tượng chuyên biệt cần phải dùng kháng thể chuyên biệt để kết hợp với emzyme nên không có hiệu quả kinh tế cao Để khắc phục tình trạng này, phương pháp indirect ELISA (ELISA gián tiếp) được phát minh Điểm đặc biệt của indirect ELISA là có 2 kháng thể lần lượt là kháng thể cấp 1 (primary antibody) và kháng thể cấp 2 (secondary antibody) có đính

kèm enzyme Như vậy, kháng thể cấp 2 có thể đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên khác nhau, dễ dàng thương mại hóa

Ngoài direct và indirect ELISA còn có 2 phương pháp ELISA khác có tính đặc hiệu cao hơn và được ứng dụng rộng rãi hiện nay là DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich – ELISA, ELISA sandwich trực tiếp) và TAS – ELISA (Triple Antibody Sandwich – ELISA, ELISA sandwich gián tiếp) Phương pháp DAS – ELISA sử dụng kháng thể cố định trên giá thể (kháng thể bắt), sau đó cho kháng nguyên vào để gắn với kháng thể bắt Tiếp theo, người ta thêm kháng thể đính kèm enzyme vào Khi 2 kháng thể cùng kết hợp với kháng nguyên, enzyme kích hoạt phân hủy chất tạo màu, làm thay đổi màu cơ chất Phương pháp TAS – ELISA là sự kết hợp giữa DAS – ELISA và indirect ELISA, bao gồm 3 kháng thể là kháng thể bắt được cố định ở giá thể, kháng thể cấp 1 và kháng thể cấp 2 có đính enzyme Như vậy, TAS – ELISA vừa giữ được tính đặc hiệu từ DAS – ELISA do gắn được vào cả 2 epitope của kháng nguyên, vừa có tính thương mại cao do kháng thể cấp 2 có thể đánh dấu được nhiều loại kháng nguyên khác nhau (Nguyễn Minh Nam, 2011)

2.4.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử dùng để khuyếch đại một đoạn DNA ngắn Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn nhờ mồi

a) b) c) d)

Hình 2.6 Các phương pháp ELISA (a) Direct ELISA; (b) Indirect ELISA; (c) DAS – ELISA; (d) TAS – ELISA ( Piercenet , 2009).

Một quy trình PCR thường có 20 – 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ đều có 3 giai đoạn là biến tính, bắt cặp và kéo dài Ở giai đoạn biến tính, DNA từ mạch kép chuyển thành mạch đơn ở 94 – 950C trong thời gian 30 – 60 giây Khi nhiệt độ giảm xuống còn 45 –

600C, mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào một mạch DNA đơn theo nguyên tắc bổ sung trong thời gian khoảng 30 – 60 giây, đây là giai đoạn bắt cặp Cuối cùng là giai đoạn kéo dài, nhiệt độ tăng lên 720C, enzyme DNA polymerase gắn vào đầu 3’OH tự

do của mồi bám trên sợi khuôn và tiến hành tổng hợp đoạn DNA mới trong 30 giây đến vài phút

PCR là kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử rất phổ biến, có độ nhạy cao, thao tác đơn giản, trong thời gian lớn có thể khuyếch đại một lượng lớn DNA từ nhiều nguồn khác nhau Tuy nhiên, PCR không thể khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 3 kb Sự ngoại nhiễm cũng là một vấn đề khó khăn thường gặp ở PCR,

Hinh 2.7 Sơ đồ phản ứng PCR 5 chu kỳ (Bùi Chí Bửu, 2007)

làm sản phẩm khuyếch đại có lẫn những DNA khác ngoài DNA đích Ngoài ra, Taq polymera cũng có những sai sót nhất định, cứ 1000 nucleotide thì enzyme này gắn sai

1 nucleotide

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR như mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi, để sản phẩm khuyếch đại có hiệu quả cao, trình tự mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc; phải đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen; trình tự giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1 kb); độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi quá ngắn sẽ không đặc hiệu, mồi quá dài

sẽ ảnh hưởng đến cơ chế và rất khó tổng hợp; Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thưòng trong khoảng từ 4 – 50C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 720C Ngoài ra, sự cân bằng của bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP là quan trọng đối với phản ứng PCR Nếu giữa các loại nucleotide trên mất cân bằng sẽ gây ra lỗi khi sao chép hoặc dẫn đến hiện tượng sao chép giả Ion Mg 2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ

Mg 2+ tối ưu để thực hiện PCR từ 150 – 200 µM Nồng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng phải được xác định trong điều kiện thí nghiệm nhất định Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy axit nucleic Môi trường dung dịch đệm phải ổn định Thời gian và số lượng chu kỳ cũng là một yếu tố quan trong, ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, nhưng đến một giới hạn nào đó thì sẽ có hiện tượng số bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm, xuất hiện các sản phẩm phụ Vì vậy cần quyết định số lượng chu kỳ hợp lý, thường từ 20 – 30 chu kỳ Thời gian mỗi chu kỳ phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA mà ngắn dài khác nhau Cuối cùng, thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng (Bùi Chí Bửu, 2007)

PCR có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong nghiên cứu, PCR giúp Xác định các đoạn trình tự, phát hiện đột biến, nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử, phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm, xác định loài mới, là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR Trong nông nghiệp, PCR giúp chọn giống cây trồng, vật nuôi, lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn Trong y

khoa, việc chẩn đoán các loại bệnh do virus, vi khuẩn, chẩn đoán các bệnh về di truyền, ung thư cũng đều là những ứng dụng của PCR Ngoài ra, PCR cũng rất hữu ích trong việc xác nhận huyết thống hay truy tìm dấu vết tội phạm (Lê Quốc Hội, 2012)

2.4.3 Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – PCR)

RT – PCR là kỹ thuật thông dụng trong sinh học phân tử dùng để xác định mức

độ biểu hiện của RNA RT – PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực hiện phản ứng khuyếch đại, có thêm phản ứng tổng hợp cDNA từ mRNA khuôn Phản ứng tổng hợp cDNA này dựa vào enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Khi cung cấp primer bắt cặp với mRNA, enzyme này sẽ tiến hành tổng hợp đoạn cDNA, sau đó, đoạn cDNA này được dùng để chạy phản ứng PCR bình thường

RT – PCR có 2 loại: One – step RT – PCR và Two – step RT – PCR One – step RT – PCR là kỹ thuật kết hợp phản ứng tổng hợp cDNA và PCR với nhau trong cùng 1 tube Việc này làm thao tác trở nên đơn giản hơn, có thể xử lý một số lượng lớn mẫu với độ nhạy cao mà khả năng lây nhiễm lại thấp Tuy nhiên, hạn chế của kỹ thuật này chính là cần phải có trình tự mồi chuyên biệt Two – Step RT – PCR bắt đầu bằng phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA bằng enzyme phiên mã ngược, sau đó mới khuyếch đại cDNA bằng phản ứng PCR Khi dùng kỹ thuật này, việc sử dụng primer oligo hoặc hexame ngẫu nhiên hay đoạn primer chuyên biệt đều được Hơn nữa, Two – Step RT – PCR cho phép chọn hệ thống khuyếch đại khác nhau, như Platinum® Taq DNA Polymerase, Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity Do việc tổng hợp và

Hình 2.8 Quy trình RT – PCR (Jea, 2012)

khuyếch đại cDNA là riêng biệt nên có thể trữ lại một ít mẫu để sử dụng sau (Invitrogen, 2012)

2.4.4 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh virus khác

Chẩn đoán nhờ vào triệu chứng: triệu chứng bệnh là biểu hiện của bệnh, phản ánh những đặc điểm riêng biệt của một bệnh nào đó Những đặc điểm bên ngoài như hình dạng, màu sắc các bộ phận của cây có thể quan sát để phán đoán bệnh Tuy nhiên cũng có một số triệu chứng bệnh tương tự nhau, dễ gây nên nhầm lẫn, vì vậy, cần kết hợp với một số biện pháp khác để việc chẩn đoán chính xác hơn

Chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: sau khi thu thập mẫu và xử lý, dịch chiết

từ lá được quan sát dưới kính hiển vi điện tử Đây là phương pháp rất đơn giản, thường được sử dụng ở các trung tâm nghiên cứu virus thực vật

Chẩn đoán bệnh bằng cây chỉ thị: cây chỉ thị chính là những ký chủ của virus gây bệnh có khả năng biểu hiện những triệu chứng rất rõ ràng và nhanh chóng Cây chỉ thị gồm 2 nhóm chính là nhóm cây nhiễm bộ phận (khi lây nhiễm nhân tạo, bệnh chỉ biểu hiện ở 1 bộ phận nhất định, thường là lá, không ảnh hưởng đến các bộ phận khác của cây) và nhóm cây nhiễm hệ thống (khi lây nhiễm nhân tạo, cây sẽ chết toàn bộ hệ thống)

Phương pháp sử dụng chất chỉ thị: có thể sử dụng dung dịch CuSO4.5H2O 3%

để chẩn đoán bệnh do virus CMV gây ra trên các loại cây thuộc họ bầu bí Nếu cây bị nhiễm bệnh, sau khi nhỏ dung dịch CuSO4.5H2O 3% vào thì mô cây sẽ chuyển thành màu nâu đỏ

Phương pháp đo độ nhớt, độ đục: khi cây bị bệnh, dịch cây thường có độ đục và

độ nhớt cao hơn so với cây khỏe mạnh, nên việc đo độ nhớt và độ đục của cây là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ (Vũ Triệu Mân, 2007)