KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN TẠI CỦA Edwardsiella ictaluri TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU

HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN TẠI CỦA Edwardsiella ictaluri TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG TUÂN Ngành: NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN TẠI CỦA Edwardsiella ictaluri TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG

KHÁC NHAU

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG TUÂN Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành: NGƯ Y Niên khoá: 2004 - 2008

KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN TẠI CỦA Edwardsiella ictaluri

TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU

CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt những kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã hướng dẫn tôi hoàn thành tốt Luận văn này với tất cả trách nhiệm và lòng nhiệt thành

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 30 đã luôn ở bên tôi, chia sẻ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện từ tháng 04/2008 đến 08/20008 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học, Khoa Thủy Sản trường Đại Học Nộng Lâm, Thành Phố Hồ Chí Minh với

nội dung: “KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN TẠI CỦA EDWARDSIELLA

ICTALURI TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU”

Đề tài được thực hiện trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên bốn môi trường:

BHI Broth, nước ao nuôi cá, bùn đáy ao, nước muối sinh lý

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi rút ra được kết quả như sau:

Edwardsiella ictaluri hầu hết đều tăng trưởng tốt trong môi trường kiềm và môi

trường trung tính (môi trường có chứa các thành phần dinh dưỡng như: nước ao, bùn,

BHI Broth), ngược lại ở môi trường acid càng cao thì khả năng tăng sinh và tồn tại của

E ictaluri càng giảm

Môi trường nước muối sinh lý, vi khuẩn E ictaluri chỉ có thể tồn tại trong 24 h.Trong đó, pH 9 khả năng tồn tại của E ictaluri là cao nhất; ngược lại pH 7 khả năng tồn tại của E ictaluri là thấp nhất

Môi trường nước ao nuôi cá, vi khuẩn E ictaluri tồn tại trong 5 ngày Trong đó, với pH 9 khả năng tồn tại của E ictaluri là tôt nhất; ngược lại pH 5 khả năng tồn tại của E ictaluri là thấp nhất

Môi trường tăng sinh BHI Broth, vi khuẩn E ictaluri có thể tồn tại lên đến 14 ngày Trong đó, pH 9 và pH 7 khả năng tăng sinh và tồn tại của E ictaluri là cao nhất; ngược lại pH 5 khả năng tăng sinh và tồn tại của E ictaluri là thấp nhất

Môi trường bùn đáy ao, vi khuẩn E ictaluri tồn tại lên đến 13 ngày Khả năng tăng sinh của E ictaluri trong môi trường bùn đáy ao là rất tốt

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt vii

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một Số Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra 3

2.2 Lịch Sử, Phân Bố Và Lan Truyền Bệnh Do Vi Khuẩn

Edwardsiella ictaluri 5

2.2.2 Phân bố và lan truyền bệnh 5

2.3 Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri 6

2.3.1 Giới thiệu về Edwardsiella ictaluri 6

2.3.2 Những đặc tính sinh lý sinh hoá của Edwardsiela ictaluri 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện Đề Tài 14

3.2 Vật Liệu 14 3.2.1 Mẫu vật 14

3.2.1.1 Mẫu vi khuẩn 14

3.2.1.2 Mẫu nước ao 14

3.2.1.3 Mẫu bùn đáy ao 14

3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 14

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 15

3.3.1 Phương pháp cấy vi khuẩn 15

3.3.2 Phương pháp đo pH bằng máy 16

3.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước muối sinh lý, môi trường

dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth ( BHI Broth) 17

3.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước ao nuôi cá 18

3.3.5 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường bùn đáy ao 19

3.3.6 Pha loãng mẫu 20 3.3.7 Tiến hành nuôi cấy trên đĩa thạch 21

3.3.8 Tăng sinh vi khuẩn 21 3.3.9 Đếm vi khuẩn 22 3.3.10 Tính kết quả 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Thí Nghiệm Xác Định Khả Năng Tăng Sinh Và Tồn Tại Vi Khuẩn

Edwardsiella ictaluri Trên Môi Trường BHI Broth 24

4.2 Thí Nghiệm Xác Định Khả Năng Tăng Sinh Và Tồn Tại Vi Khuẩn

Edwardsiella ictaluri Trên Môi Trường Nước Ao 26

4.3 Thí Nghiệm Xác Định Khả Năng Tăng Sinh Và Tồn Tại Vi Khuẩn

Edwardsiella ictaluri Trên Môi Trường Bùn Đáy Ao 28

4.2 Thí Nghiệm Xác Định Khả Năng Tồn Tại Vi Khuẩn

Edwardsiella ictaluri Trên Môi Trường Nước Muối Sinh Lý 29

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết Luận 32 5.2 Đề Nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIA : Brain Heart Infusion Agar

BHIB : Brain Heart Infusion Broth

TSA : Trytone Soya Agar

CFU : Colony Forming Unit

ESC : Enteric Septimecia of catfish

EMB : Eosine Methylene blue lactase Agar

pH : potential of hydrogen

EIA : Edward-siella ictaluri agar

ELISA : enzyme linked immunosorbant assay

T : Thời gian

VL : Vĩnh Long

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Vi khuẩn Edwardsiella gây bệnh trên một số loài cá 6

Bảng 2.2 Những đặc tính sinh lý, sinh hoá của Edwardsiela ictaluri 9 Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn (lgCFU/ml) trong môi trường BHI Broth

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái ngoài của cá tra 4

Hình 2.2 Một số hình ảnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dưới kính hiển vi 8

Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiela ictaluri cấy trên môi trường TSA 8

Hình 2.4 Edwardsiela ictaluri được định danh bằng bộ định danh Nam Khoa 10

Hình 2.5 Xoang bụng cá tra bị nhiễm Edwardsiela ictaluri 11 Hình 3.1 Khuẩn lạc Edwardsiela ictaluri mọc sau khi cấy 36 - 48 giờ 16

Hình 3.3 Môi trường nước muối sinh lý 18

Hình 3.4 Môi trường dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth) 18

Hình 3.5 Môi trường nước ao 19

Hình 3.6 Môi trường bùn đáy ao 20

Hình 3.7 Máy lắc tăng sinh 22

Hình 3.8 Khuẩn lạc Edwardsiela ictaluri mọc sau khi trang 48 giờ 23

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển

và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành thủy sản nói riêng và kinh tế đất nước nói chung Trong đó, các mặt hàng thủy sản xuất khẩu chủ yếu gồm tôm sú, cá tra, cá basa đã mang lại nguồn thu nhập rất lớn (Trần Thanh Xuân, 1996) đem lại kim ngạch xuất khẩu khoảng 974 triệu USD năm 2007

Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi trồng

thủy sản đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (tập trung chủ yếu ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp) và là một trong những loài cá

có giá trị xuất khẩu cao

Tuy nhiên, do việc mở rộng diện tích không theo qui hoạch với diện tích ao bè

nuôi ngày càng tăng nhanh, cá được nuôi với mật độ dày, môi trường nước ô nhiễm cộng với điều kiện bất lợi của thời tiếtđã tạo cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và

lây lan mạnh Trong đó điển hình nhất là bệnh gan, thận, mủ do vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri gây ra Có rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới Vi khuẩn này gây

bệnh trên cá và làm tỷ lệ cá chết cao Do đó việc nghiên cứu đặc điểm phát triển của vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri để có thể đưa ra phương pháp phòng bệnh hợp lý là yêu

cầu cấp thiết đặt ra

Với mong muốn góp phần vào việc ổn định nghề nuôi trồng thủy sản và được

sự phân công của Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí

Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ TỒN

TẠI CỦA Edwardsiella ictaluri TRONG NHỮNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG

KHÁC NHAU”

1.2 Nội Dung Đề Tài

Tìm hiểu thời gian tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong

các môi trường :

Nước muối sinh lý

Môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth)

Nước ao nuôi cá

Bùn đáy ao

1.3 Mục Tiêu Đề Tài

Trong quá trình nghiên cứu chúng ta có thể xác định khả năng phát triển và tồn

tại của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong các thành phần có chất dinh dưỡng như:

BHI Broth, nước ao nuôi cá và bùn đáy ao Ngược lại cũng có thể xác định khả năng tồn tại của chúng trong điều kiện không có chất dinh dưỡng là nước muối sinh lý

Kết quả thu được có thể giúp ta biết được vi khuẩn Edwardsiella ictaluri tồn tại

trong mỗi môi trường ở thời gian nhất định nào đó, để qua đó có được phương pháp

điều trị hiệu quả những bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra

2.1.3 Hình thái

Cá tra là loài cá da trơn, có thân dài, bề ngang hẹp, đầu nhỏ vừa phải, miệng rộng Loài này có hai đôi râu, trong đó có râu hàm trên ngắn hơn ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới ngắn hơn ¼ chiều dài đầu Vây lưng và vây ngực của cá tra có gai cứng, có răng cưa ở mặt sau Điểm khởi đầu của vây lưng gần đối xứng với vây bụng Vây hậu môn tương đối dài Thân cá có màu xám hơi xanh trên lưng, bụng có màu trắng hơi bạc (Phạm Văn Khánh, 2000)

Hình 2.1 Hình thái ngoài của cá tra

2.1.4 Điều kiện sống

Nhiệt độ thích hợp cho cá tăng trưởng dao động từ 26 đến 300C Nhờ có cơ quan hô hấp phụ nên cá có khả năng sống ở nhưng nơi ao tù nước bẩn, hàm lượng oxy hoà tan thấp, cá có khả năng chịu pH từ 4 - 5 (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2001 trích dẫn Bùi Kim Ngân, Dương Hoàng Tân, 2004) Độ mặn 7 - 10‰ pH thích hợp

cho cá 6,5 - 7,5

2.1.5 Sinh Sản

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái 3 tuổi, trọng lượng trung bình 5 -

6 kg/cá với chiều dài tối đa 60 cm Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 dương lịch, cá

có tập tính di cư đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện phù hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở phần sông của Việt Nam Trong sinh sản nhân tạo ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm) cá tra có thể tái phát dục 1 - 3 lần trong 1 năm

Rất khó phân biệt cá tra đực và cái bằng mắt thường, khi vuốt nhẹ vào xoang bụng có thể phân biệt đực cái dựa vào sự xuất hiện của trứng hoặc tinh trùng

Sức sinh sản của cá tra 139.000 - 150.000 trứng/kg cá cái (Trần Thanh Xuân,

1994, trích dẫn Bùi Kim Ngân, Dương Hoàng Tân, 2004)

2.1.6 Sinh trưởng

Cá tra sau khi tiêu hết noãn hoàng cá chiều dài 1,0 - 1,1 cm Sau 14 ngày ương

cá có thể đạt đến chiều dài 2 -3 cm và khối lượng trung bình 0,52 g Cá ương 5 tuần tuổi có chiều dài 5,0 - 6,0 cm và trọng lượng 1,28 – 1,5 g/cơ thể cá Sau 1 năm tuổi, cá

có thể đạt trọng lượng 1,2 - 1,5 kg Sau 3 - 4 năm có thể đạt 3 - 4 kg (Trần Thanh Xuân, 1994; trích dẫn Bùi Kim Ngân, Dương Hoàng Tân, 2004)

2.1.7 Dinh dưỡng

Cá tra là loài ăn tạp thiên về động vật Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống Vì vậy, chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục

ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ

Khi cá lớn thể hiện rõ tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật

2.2 Lịch Sử, Phân Bố và Lan Truyền Bệnh Do Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri

Năm 1992 phát hiện bệnh trên cá tra, basa nuôi ao bè ở Việt Nam Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson và cộng sự, 2001)

Đến năm 2001 bệnh được gọi là bệnh mủ gan

2.2.2 Phân bố và lan truyền bệnh

Vi khuẩn thường gây ở động vật máu lạnh: Rắn, cá sấu, ba ba, cá… và những

động vật thủy sản khác Việt Nam đã phân lập được Edwardsiella ictaluri từ cá tra, cá

ba sa, cá nheo giống và cá thịt Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá tra hương (cỡ

từ 4 – 6 cm) đến 5 – 6 tháng tuổi, tỷ lệ tử vong của cá từ 60 – 70%, có trường hợp 100% (Bùi Quang Tề, 2003) Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu, và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè

Bảng 2.1: Vi khuẩn Edwardsiella gây bệnh trên một số loài cá

Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô Thời điểm phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm

Edwardsiella ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau Vi khuẩn

trong nước có thể, qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di

chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb 1985; Shotts

và ctv, 1986) Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da E ictaluri cũng có thể xâm

nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv, 1986) Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và

mất sắc tố của da Cá da trơn còn nhiễm E ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn

ruột Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh (Shotts và ctv, 1986)

Tóm lại, vi khuẩn E ictaluri có thể xâm nhập vào cơ thể cá từ môi trường nước

qua da, qua mang cá và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh mủ gan cho cá

2.3 Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.3.1 Giới thiệu về Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriace, bộ Enterobacterales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria

Loài cá Tên La tinh Tên địa phương Vi khuẩn Tác giả

Ictalurus nebulosus Trê sông nâu E ictaluri Hawke, 1976

Ictalurus furcatus Trê sông xanh E ictaluri Plumb và ctv, 1985

Danio devario E ictaluri Waltman và ctv, 1985

Eigemannia virens Cá dao xanh E ictaluri Kent và Lyons, 1982

Clarias batrachus Cá trê trắng E ictaluri Kasomchandra và ctv, 1987 Ictalurus catus Cá trê sông trắng E ictaluri Plamb và Sanchez, 1983

Có đặc điểm gram âm, hình que mảnh, kích thước 1 x 2 – 3 µm , không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao Yếm khí tuỳ tiện, catalase dương, Cytocrom oxidase âm, oxy hoá âm và lên men trong môi trường O/F glucose Thành phần

Guanin và Cytozin trong AND là 55 - 59 mol% Thường gặp 2 loài là E tarda và E

ictaluri E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng gan, tụy, thận

của cá không không vẩy (Bệnh học thuỷ sản, Bùi Quang Tề, 2006)

E ictaluri là loài chịu đựng kém nhất của Edwardsiella Chúng phát triển chậm

trên môi trường nuôi cấy, cần mất 36 – 48 giờ để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHI tại 28 - 300C, phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C Khi trong

môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E

ictaluri (như Aeromonas sp) thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E ictaluri phát

triển rất chậm

Vi khuẩn E ictaluri kén chọn vật chủ hơn nhiều so với E tarda và gây thiệt hại nặng hơn Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra được tìm thấy ở loài cá trê sông (Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979) còn có 2 loài khác như: cá trê sông xanh (Ictaluri

purcatus) và cá trê sông trắng (Ictalurus catus) (Plumb and Sanchez, 1983), cá trê

trắng (Clarias batrachus) (Kasornchandra et al., 1987) ở Thái Lan

Hình 2.1: Hình ảnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dưới kính hiển vi

(Nguồn:www.micro-gen.ouhsc.edu/e_ictal/e_ictal_home.htm)

Hình 2.2: Hình ảnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dưới kính hiển vi

(Nguồn:www.micro-gen.ouhsc.edu/e_ictal/e_ictal_home.htm)

Hình 2.3: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấy trên môi trường TSA

(Nguồn: T T Dung, M Crumllsh, H W ferguson, N T N Ngọc, N Q Thịnh và D

T M Thy_2003)

2.3.2 Những đặc tính sinh lý sinh hoá của Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn sống trong bùn đến 95 ngày ở 250C, và có thể tồn tại trong gan, thận, não cá sau khi khỏi bệnh vài tháng

Vi khuẩn xâm nhập trực tiếp từ ruột, mủ, mang vào cơ thể cá và được bài thải

từ phân, xác cá chết vào nước

Bệnh bộc phát mạnh khi nhiệt độ 20 – 280C, trên 300C tỷ lệ cá chết giảm dần Tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy, cần từ 36 - 48 giờ ở 28 – 300C để

phát triển mọc thành khuẩn lạc nhỏ trên thạch BHI (Brain heart infusion Agar) và vi

khuẩn tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 370C (Valerie và ctv, 1994)

Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi trường TSA

(Trytone Soya Agar) hoặc EMB (Eosine Methylene blue lactase Agar) sau 48 giờ ở

280C tạo thành khuẩn lạc màu trắng đục

Bảng 2.2: Những đặc tính sinh lý, sinh hoá của Edwardsiela ictaluri

Sinh H2S trong triple sugar iron -

Sinh H2S trong pepton iron agar -

Giới hạn nồng độ muối 1,5% +

Giới hạn nồng độ muối 3,0% -

Tỷ lệ G – C của AND mol% 53

Hình 2.4: Edwardsiella ictaluri được định danh bằng bộ đinh danh Nam Khoa

2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh thường gây ra trên cá cỡ 0,2 – 300 g (cá giống và thịt) Khi vi khuẩn tấn công tỷ lệ chết thể chết lên đến 100% sau 5 ngày phát bệnh đối với cá giống, cá nuôi thương phẩm chết 30 - 50% trong 1 đợt dịch

Cá thường bơi xoay vòng, treo cơ thể lơ lững ở mặt nước và bỏ ăn ngay sau khi nhiễm khuẩn.Quanh hậu môn, miệng, bụng, gốc vây xuất huyết Tích dịch dưới da vùng sọ (phù đầu), mắt bị lồi và gan nhạt màu

Bên trong nội quan xuất hiện mảng trắng hoại tử trên gan, thận, lách Bệnh nặng phát triển thành mủ Xoang bụng có dịch viêm, hơi vàng có lẫn máu Ruột, cơ,

mô mỡ bị xuất huyết điểm, lòng ruột có chứa dịch lẫn máu

Hình 2.5: Xoang bụng cá tra bị nhiễm Edwardsiella ictaluri

(Nguồn: T T Dung, M Crumllsh, H W ferguson, N T N Ngọc, N Q Thịnh và D

T M Thy_2003)

2.3.4 Phương pháp phòng và tri bệnh

Biện pháp phòng bệnh quan trọng nhất không để cho động vật thủy sản bị sốc

do môi trường nuôi thay đổi xấu: nhiệt độ, oxy hoà tan, nhiễm bẩn của nước Môi trường nước phải đảm bảo tốt cho đời sống của động vật thủy sản

Tránh tạo ra các tác nhân cơ hội như nhiễm ký sinh trùng, tránh làm xây xát cá, mật độ nuôi quá dày Dùng thuốc tím tắm cá, liều dùng là 4 ppm (4 g/m3 nước) đối với cá nuôi trong ao và 10 ppm đối với cá nuôi trong bè Xử lý lặp lại sau 3 ngày và tắm cá theo định kỳ (Bùi Quang Tề và ctv., 1999) Ngoài ra, cũng có thể dùng các loại kháng sinh (Oxytetracyline, Streptomycin, Sulfamid, Kanamycin) trộn vào thức ăn để

trị bệnh cho cá (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005)

2.3.5 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E ictaluri và sự tồn tại của vi khuẩn

Waltman và ctv (1986) đã mô tả đặc điểm sinh hóa hoàn chỉnh của E ictaluri

Plumb và Vinitnantharat (1989) đã tìm thấy một vài đặc điểm hóa sinh học và tính đa dạng về huyết thanh giữa các loài

E ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Speyerer và Boyle 1987, Newton và ctv (1988)

Chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng chúng quan trọng trong việc nâng

cao tính kháng đối với kháng sinh cho E ictaluri

Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu ra một môi trường có tính chọn lọc

cho E ictaluri, Edward-siella ictaluri agar (EIA) giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có mặt của E ictaluri trong lần phân lập vi khuẩn đầu tiên

Roger 1981 đã định danh E ictaluri bằng kỹ thuật enzyme link immunosorbant

assay (gọi tắt là kỹ thuật ELISA)

Ainsworth và ctv, 1986 định danh E ictaluri thông qua những đặc điểm sinh

hóa và huyết thanh của chúng bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh chuyên biệt, hoặc dùng kháng thể phát huỳnh quang (fluoresent antibody - FA)

ELISA và FA có thể dùng để thăm dò và định danh E ictaluri trong những vết

bôi được làm trực tiếp từ mô của cá bị nhiễm bệnh

Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm

trên cá nheo Mỹ (từ 15 - 20 cm) với mật độ vi khuẩn E ictaluri là 1,2 x 106 cfu/0,1ml

ở 250C, tốc độ nước chảy 1 lít/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày Tỉ lệ chết dao động từ 38 - 95,3% trong thời gian thí nghiệm là 7

Theo Ferguson và ctv (2001) thì sau khi phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra rồi tiến hành gây cảm nhiễm Kết quả vi khuẩn có khả năng tạo hoại tử trong 7 ngày

Theo Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá tra bằng

cách tiêm vi khuẩn E ictaluri với mật độ là 1,5 x 106 CFU/ml và mật độ 1,5 x 105cfu/ml để xác định khả năng bộc phát bệnh, kết quả cá chết 100% sau 6 ngày

Trong bùn vi khuẩn có thể tồn tại trong 95 ngày

2.4 pH

2.4.1 Giới thiệu

pH là chỉ số đo độ hoạt động của các ion hiđrô (H+) trong dung dịch và vì vậy là

độ axít hay bazơ của nó Trong các hệ dung dịch nước, độ hoạt động của ion hiđrô

được quyết định bởi hằng số điện ly của nước (Kw) = 1,011 × 10−14 ở 25°C) và tương tác với các ion khác có trong dung dịch Do hằng số điện ly này nên một dung dịch trung hòa (độ hoạt động của các ion hiđrô cân bằng với độ hoạt động của các ion hiđrôxít) có pH xấp xỉ 7 Các dung dịch nước có giá trị pH nhỏ hơn 7 được coi là có tính axít, trong khi các giá trị pH lớn hơn 7 được coi là có tính kiềm

Trong tiếng Anh, pH có thể là viết tắt của "hydrogen power", "power of

hydrogen” hoặc "potential of hydrogen" Tất cả các thuật ngữ này đều đúng về mặt kỹ

ra màu của dung dịch

Sử dụng máy đo pH cùng với các điện cực có chọn lựa pH (điện cực thủy tinh

pH, điện cực hiđrô, điện cực quinhiđrôn và nhiều loại khác)

Năm 2002, một nhóm nghiên cứu của IUPAC đã thống nhất đề nghị đưa pH vào trong hệ thống đơn vị đo lường quốc tế (SI)

2.4.3 Độ kiềm của đất

Độ chua, độ kiềm của đất được đo bằng độ pH Đất thường có trị số pH từ 3 đến 9 Căn cứ vào trị số pH người ta chia đất thành: đất chua (pH < 6,5), đất trung tính (pH = 6,6 - 7,5) và đất kiềm (pH > 7,5) Người ta xác định đất chua, đất kiềm và đất trung tính để có kế hoạch cải tạo và sử dụng

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện Đề Tài

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh Học, Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nộng Lâm – Thành Phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện đề tài từ: tháng 04/2008 đến 08/2008

3.2 Vật Liệu

3.2.1 Mẫu vật

3.2.1.1 Mẫu vi khuẩn

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập trên cá tra bệnh ở các tỉnh Vĩnh

Long, Cần Thơ, Bến Tre…và được lưu trữ ở - 200C Chủng được sử dụng trong thí nghiệm là chủng VL33

Môi trường nuôi cấy

BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.3.1 Phương pháp cấy vi khuẩn

Lấy 15 – 20 ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 500C rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác vô trùng) Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30 – 370C để làm khô mặt thạch

Lấy một vòng que cấy gạt 3 - 4 lần trên mặt thạch ở một góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3 - 4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy

Ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 1 - 2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

Hình 3.1: Khuẩn lạc Edwardsiella ictaluri mọc sau khi cấy 36 - 48 giờ

3.3.2 Phương pháp đo pH bằng máy

Dùng cốc sạch chứa nước cần đo (môi trường)

Mở nút lọ bảo quản, lấy đầu đo ra đưa vào cốc chứa nước môi trường, tránh không để nước ngập gần dây điện

Bật công tắc về ON và giữ yên máy, chờ khoảng 1 - 2 phút để số trên màn hình

ổn định rồi đọc kết quả Đôi khi số hiện trên màn hình nhấp nháy thay đổi, ta đọc số trung bình Ví dụ: 6,99 – 7,00 và 7,01 thì đọc 7,00

Rửa đầu đo bằng nước cất sau đó thấm khô bằng giấy mềm trước khi đo mẫu tiếp theo

Điều chỉnh pH trong các môi trường ta dùng dung dịch NaOH 0,1N, HCl 0,1N Muốn pH môi trường tăng ta nhỏ NaOH 0,1N và giảm nhỏ HCl 0,1N (lưu ý nhỏ từng giọt để có đạt được pH chính xác và nhanh hơn)

Hình 3.2: Máy đo pH

3.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước muối sinh lý, môi trường dinh dưỡng

Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth)

Chuẩn bị bốn bình tam giác thể tích 100 ml đã được sấy tiệt trùng ở 1800C trong 2 giờ Sau đó cho 60 ml môi trường vào mỗi bình và tiến hành chuẩn pH

Sử dụng máy đo pH chuẩn pH các môi trường nước muối sinh lý, môi trường dinh dưỡng BHIB (Brain Heart Infusion Broth) ở 4 mức pH 5, 6, 7, 9 rồi đem hấp tiệt trùng các bình ở 1210C trong vòng 20 phút

Sau khi hấp tiệt trùng các bình môi trường xong để nguội rồi tiến hành nuôi cấy

vi khuẩn vào trong môi trường

Pha loãng vi khuẩn

Cân 2,5 mg vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được cấy 48 giờ Vi khuẩn được

lấy bằng que cấy vòng và phải là những khuẩn lạc thuần và rời

Sau đó cho 2,5 ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa vi khuẩn đã cân (tỉ

lệ 1 mg vi khuẩn/1ml nước muối sinh lý) khuấy đều bằng máy votex

Cho 0,1ml vi khuẩn đã pha loãng ở trên vào 4 bình tam giác chứa môi trường mỗi loại Tiếp tục lắc đều rồi tiến hành pha loãng ra các nồng độ cần thiết

Các thao tác phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo không bị

Hình 3.3: Môi trường nước muối sinh lý

Hình 3.4: Môi trường dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth)

3.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường nước ao nuôi cá

Nước ao sau khi được lấy từ ao nuôi cá để lắng trong 5 giờ rồi tiến hành thí nghiệm như hai môi trường trên

Hình 3.5: Môi trường nước ao

3.3.5 Thí nghiệm xác định khả năng tăng sinh và tồn tại của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trong môi trường bùn đáy ao

Do việc điều chỉnh pH rất phức tạp nên chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra pH của mẫu bùn

Bùn được lọc qua rây có mắc lưới 0,085 mm rồi dàn mỏng ra đĩa petri đem sấy

600C trong 12 giờ

Cân 15 g bùn đã sấy cho vào bình tam giác chứa 15 ml nước cất tiệt trùng, khuấy đều và để lắng trong 20 phút, lấy phần nước trong đo pH pH chúng tôi đo được

là 7,28

Pha loãng bùn đáy ao

Cho bùn vào 3 bình tam giác thể tích 100 ml, mỗi bình 50 g đem hấp tiệt trùng

ở 1210C trong 20 phút

Cho vào mỗi bình tam giác 5ml vi khuẩn sau đó pha loãng với nước muối sinh

lý (tỉ lệ 1 mg vi khuẩn/1 ml nước muối sinh lý) cho vào mỗi bình tam giác 5 ml vi khuẩn đã pha, dùng que khuấy trộn điều vi khuẩn trong các bình

Cân 0,5 g bùn của mỗi bình vào mỗi ống nghiệm rồi cho 4,5 ml nước muối sinh

lý vào khuấy đều bằng máy votex, để lắng trong ít phút rồi lấy phần nước trong tiến

Hình 3.6: Môi trường bùn đáy ao

3.3.6 Pha loãng mẫu

0,2 ml dung dịch mẫu được pha loãng 1,8 ml nước muối sinh lý (đã được hấp tiệt trùng), lắc kỹ ta được dung dịch có nồng độ 10-1 Cứ tuần tự như thế 0,2 ml dung dịch có độ pha loãng trước đó + 1,8 ml nước muối sinh lý, dung dịch mẫu sẽ được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1…10-7 với mỗi bậc pha loãng là

10-1

Thí nghiệm với nước muối sinh lý thực hiện trên các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Thí nghiệm với môi trường dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth) thực hiện trên các nồng độ 10-5, 10-6, 10-7

Thí nghiệm với môi trường nước ao nuôi cá thực hiện trên các nồng độ 10-1,

Sơ đồ pha loãng

0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

3.3.7 Tiến hành nuôi cấy trên đĩa thạch

Dùng pipet tiệt trùng hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào giữa các đĩa petri và ứng với mỗi nồng độ nuôi cấy trên hai đĩa petri chứa môi trường BHIA Sau đó dùng que trang trang đều dung dịch trên đĩa, lật úp đĩa ủ ở 300C

từ 36 - 48 giờ để đếm khuẩn lạc

Mọi thao tác nuôi cấy phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng và tất cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu phải được khử trùng

3.3.8 Tăng sinh vi khuẩn

Thí nghiệm được lặp 3 lần trên tất cả các môi trường nhằm tăng độ chính xác Các mẫu thí nghiệm phải lặp lại giống như nhau về chủng vi khuẩn, thời gian vi khuẩn phát triển, vị trí và thời gian lấy nước ao…

1,8 ml Nước muối sinh lý

1,8 ml Nước muối sinh lý

……… 1,8 ml

Nước muối sinh lý

1,8 ml Nước muối sinh lý

Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại ít nhất 2 đĩa/mẫu

Khi đếm ta dùng bút aceton đánh dấu vào khuẩn lạc đã đếm để tránh việc nhầm lẫn khuẩn lạc đã đếm xong