GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH HỌC THỰC VẬT

Viện Di truyền nông nghiệp được thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội. Chức năng chính của Viện là : -Nghiên cứu, ứng dúng các phương pháp di truyền học hiện đại và công nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trường. -Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lương thực- thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường. -Tăng cường hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền và Công nghệ sinh học. Để thực hiện được các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 người trong đó có 3 tiến sĩ , 6 phó giáo sư, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ. Trong những năm qua, Viện đã đạt được rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và chủ trì 18 đề tài nhà nước, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo được nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình tiến bộ kỹ thuật được công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO... Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận được nhiều giải thưởng có giá trị cả trong và ngoài nước: Giải thưởng quốc tế về đóng góp phát triển nông nghiêph Châu Á Thái Bình Dương, huân chương lao động hạng 3 ...

Lời cảm ơn Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật. 1 Lời mở đầu Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội. Chức năng chính của Viện là : -Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và công nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng. -Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực- thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trờng. -Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền và Công nghệ sinh học. Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có 3 tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ. Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợc nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO . Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận đợc nhiều giải thởng có giá trị cả trong và ngoài nớc: Giải thởng quốc tế về đóng góp phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dơng, huân chơng lao động hạng 3 . giới thiệu chung về bệnh học thực vật 2 I. Quan niệm về bệnh hại thực vật Việc chỉ ra đợc chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khó khăn và đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Ngời ta cho rằng một cây đợc coi là khoẻ mạnh và phát triển bình thờng khi nó biểu hiện các chức năng sinh lý ở mức tối đa tiềm năng di truyền của nó. Các tế bào mô phân sinh của cây khoẻ mạnh thực hiện chức năng phân chia và chuyên hoá khi cơ thể đòi hỏi là cần thiết. Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nớc và dinh dỡng từ đất, đa nớc và dinh dỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quang tổng hợp, các quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lu giữ các sản phẩm của quá trình quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khả năng sinh tồn và phát triển. Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộ phận nào đó của cây có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bị can thiệp do các vi sinh vật hoặc là yếu tố môt trờng bất lợi thì các hoạt động của các tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trở nên bị bệnh. Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn cha biểu hiện ra nhng chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh bắt đầu thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thờng có thể thấy đợc. Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật hay ảnh hởng của các yếu tố môi trờng bất lợi mà chúng ta có thể biết đợc mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể đợc định nghĩa là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh vật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trờng mà ta có thể nhìn thấy đợc hoặc không nhìn thấy đợc, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, hoặc tình trạng nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có thể gây chết toàn phần hoặc từng phần của cây. Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh bằng cách can thiệp vào quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các chất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng của 3 chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất yếu là làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng. Ngoài ra, các yếu tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ngỡng chống chịu của cây. Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiều tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị bệnh . Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và cách lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh 4 Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật I. Khái niệm chung: Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trờng dinh dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm: - Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh. - Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ, một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả . - Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành. - Nuôi cấy mô sẹo (callus) - Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp. Cơ sở vật chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền. Khi tạo đợc môi trờng nuôi cấy phù hợp, sử dụng các chất điều khiển sinh trởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển đợc thành cây hoàn chỉnh. Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của công nghệ này. Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thành các tế bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinh hoá; còn sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạng thái phôi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới. Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đờng phân hoá và phản phân hoá là môi trờng nuôi cấy. 5 II.Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trờng nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm: 1. Nguyên tố khoáng đa lợng: Là các nguyên tố nh N, P, K, Mg, S, Ca .,chiếm nhiều trong môi trờng nuôi cấy với hàm lợng của mỗi nguyên tố thờng lớn hơn 30mg/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc. 2. Các nguyên tố khoáng vi lợng: Là các nguyên tố nh Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn, Co . với hàm lợng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là thành phần của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống. 3. Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào chuyển sang phơng thức sống dị dỡng nên cần phải cung cấp cho chúng một nguồn cacbon hữu cơ, thờng là đờng mía saccaroza (trong một số trờng hợp còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza .). Ngoài ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu. 4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung vitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy. Vitamin thờng dùng là nhóm B dễ hoà tan vào trong nớc nh B 1 , B 2 , B 3 , B 5 , B 6 với hàm lợng từ một đến một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi trờng nuôi cấy. *Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l- ợng lớn ~ 100 mg/l. 6 5. Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật tách rời. Ngời ta thờng sử dụng chủ yếu hai nhóm chất điều khiển sinh trởng thực vật sau: - Auxin: kích thích quá trình tăng trởng của tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thờng dùng là IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lợng dùng nhỏ 10 -5 -10 -7 mol/l. - Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định. Các loại thờng dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin), Zeatin, TDZ(Thidiazuron) với hàm lợng 10 -5 -10 -7 mol/l. Ngời ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lợng phù hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tơng đối: tỷ lệ auxin trên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi. Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh tr- ởng: axit absisic (ABA), CCC sử dụng trong bảo quản nguồn gen invitro. 5. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: đây là thành phần thờng dùng nhng không bắt buộc trong môi trờng nuôi cấy. Bao gồm nớc dừa, dịch nghiền một số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt dịch chiết nấm men, hợp chất cazein, pepton để gia tăng các chất dinh dỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trởng và sự phát triển của mẫu cấy. 7 6. Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy. Thờng dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với nớc khi ở nhiệt độ lớn hơn 80 0 C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 40 0 C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từ môi trờng. III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào: Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau: Bớc 0: Bớc chuẩn bị Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau: - Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần. - Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt. - Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus. - Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiện chăm sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn. Bớc 1: Nuôi cấy khởi động Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thờng sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy nh mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non. Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phơng pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thờng là HgCl 2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút. ít 8 phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl) 2 5% trong 20-30 phút. Ngoài ra còn dùng H 2 O 2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhng hiệu quả không cao. Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đa mẫu cấy vào môi trờng thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trờng thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lợng các chất điều khiển sinh trởng trong môi trờng để làm cho mẫu cấy phát sinh đợc hình thái. Bớc 2: Nhân nhanh mẫu Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này đợc coi là giai đoạn đánh giá tính u việt hay không u việt của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào. ở giai đoạn này, môi trờng dinh dỡng nhân tạo để nuôi cấy thờng đợc đa thêm vào chất điều khiển sinh trởng, các chất bổ sung khác nh nớc dừa, nớc chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein .kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt đợc hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên, tuỳ từng đối tợng nuôi cấy, ngời ta có thể đạt đợc hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Bớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt đợc một kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờng trong bớc 2 vào môi trờng tạo rễ. Thờng sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt đợc trong môi trờng không có chất điều hoà sinh trởng. Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên 9 Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào. Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thờng. Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là: - Sự bất định di truyền + Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro. + Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng sử dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hởng của các chát điều khiển sinh trởng. - Sự nhiễm mẫu cấy + Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3 tuần nuôi cấy. + Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu - Sự tiết độc tố từ mẫu cấy + Sau 1-2 ngày đa vào môi trờng, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm hỏng môi trờng, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá. 10 . tế về đóng góp phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dơng, huân chơng lao động hạng 3 ... giới thiệu chung về bệnh học thực vật 2 I. Quan niệm về bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu chuẩn