thu nhận protease từ vi sinh vật

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến th

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được

sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

1 Giới thiệu chung.

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1 Cấu trúc không gian enzyme Protease.

2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 2 Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

Aminopeptidase

Carboxypeptidase

Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Metallo proteinase

thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

3 Nguồn thu nhận enzyme protease:

loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một

số loại nấm men

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của

vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi

Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn

Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp

ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi

B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ

20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus,

A saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,

có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng có khả

năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp

protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%

liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ S fradiae cũng

có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

quanh năm

dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp

ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

4 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn

Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu

Hình 3 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme 4.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.

Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên

bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu

4.1.1 Phương pháp gây đột biến.

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:

 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng hợp repressor có ái lực thấp với gene opertor

 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể giảm

độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược

Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme

 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đối với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần

Tuyển chọn và cải tạo giống vi

sinh vật

Phương pháp bảo quản giống

vi sinh vật

Tách và làm sạch chế phẩm

enzyme Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme

Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi” một bazo khi tái tạo phân tử ADN

Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ) hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật

4.1.2 Phương pháp biến nạp.

ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác Ở đây yếu tố biến nạp là AND Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho

mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào

Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN từ các giống họ hàng Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định, thường

có cấu trúc xoắn kép Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài vi khuẩn như:

Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.

4.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene.

bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì

sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã

được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.

4.1.4 Phương pháp tải nạp

trung gian của thực khuẩn thể (phage) Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận Do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận

4.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.

kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các

biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được) Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng

Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý

Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc

Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận) Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm

Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật

khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này

ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu

(-196°C -> -80 °C)

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta

đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng

vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô

4.3 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào